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临床器官移植免疫耐受诱导的进展
摘要：
长期免疫制剂的使用将给器官移植患者带来一系列毒副作用，以致影响患者和移植物的长期存活。对于这些患者和器官移植医生而言，诱导免疫耐受是最终解决方案。目前临床上尚缺少有效的实验方案、合适的免疫检测手段以及完全停药所面临的一些伦理和安全问题的成熟共识，因此器官移植”可控耐受”在临床上实现很难。尽管面临着种种困难，仍然有一些中心谨慎的构建了以长期存活为目标的诱导器官移植免疫耐受的方案，并取得部分的成功。本文对目前临床成功诱导器官移植免疫耐受的方案进行简要综述，包括主动逐渐停药诱导移植免疫耐受，通过混合嵌合诱导器官移植免疫耐受以及调节性T细胞在临床免疫耐受中的应用。

关键词： 器官移植;免疫耐受;免疫抑制剂;混合嵌合;调节性T细胞

Advances in research of clinical transplantation tolerance
Abstract:
It is clear that the long-term use of immunosuppressive agents after organ transplantation is associated with an extensive list of undesirable side effects that may limit the survival of the patient and transplanted organ. To these patients and transplant surgeons, organ transplantation tolerance is the ultimate purpose to improve quality of life. The clinical state of allograft acceptance termed "operational tolerance" has been remains an infrequent event in clinical transplantation as a result of the lack of validated assays or biomarkers predictive of tolerance, and concerns about the safety and ethics of complete withdrawal of immunosuppression. Despite these barriers, a number of investigators have continued to conduct well-designed studies with the long-term goal of inducing clinical transplantation tolerance. This review provides an overview of successful current approaches to achieve clinical operational tolerance, including slowly immunosuppression withdraw in organ transplantation, transplantation tolerance through mixed chimerism and clinical application of T regulatory cells in tolerance.
Key words: organ transplantation; immune tolerance; immunosuppression; mixed chimerism; T regulatory cells

一 引言
近20年，随着新型免疫抑制剂的发展，器官移植急性排斥反应能够得到理想的控制，可以明显提高器官移植患者短期生存率，但长期的生存结果并不乐观[1]，主要因为慢性排斥反应和免疫抑制剂的毒副作用导致移植器官丢失。若要解决上述问题，诱导移植器官免疫耐受是唯一选择。绝对意义上的免疫耐受很难达到，早期有个别移植免疫患者因为严重感染、免疫抑制剂的毒性作用危及生命而不得不停药，结果却意外的发现获得了免疫耐受[2]，成为临床可控免疫耐受(Clinical Operational Tolerance，COT)。但这是不可重复的，而且也是不能被推荐和鼓励的。不过正因为出现了这些自发停药产生免疫耐受的患者，才给了移植医生以巨大的信心，认识到临床免疫耐受是切实可行的，也激励了更多的移植中心主动的开始临床免疫耐受的诱导。上述COT满足了免疫耐受的两个基本要求：首先可以解除对免疫抑制剂的长期依赖，能够停止使用免疫抑制剂，同时还可以防止移植后器官的慢性排斥反应发生，维持移植物功能正常[3]。以上两点也是器官移植免疫耐受的终极目标，除此之外，免疫耐受的器官移植患者还需要维持对异体抗原，比如感染和肿瘤等免疫刺激的正常免疫功能。
诱导器官移植免疫耐受的方案和研究成果在啮齿类动物实验中非常满意，但在灵长类大动物和人类临床应用时却出现了很多困难，我们仍然面临着一系列亟需回答的问题和挑战。合理的诱导免疫耐受方案都需要主动停止免疫抑制药，但是什么时候停药，什么是合理的停药方案，停药后会不会出现排斥反应从而导致移植器官的功能丧失等一些列问题，还没有明确的答案，而且受到医学伦理的限制，任何尝试都需要确保不对移植物和患者造成伤害，这种限制和担心严重的制约了临床免疫耐受试验的开展。另外一个重要挑战就是免疫监测，选择什么样的移植患者停药，停药后如何监测排斥反应的发生或者判断免疫耐受诱导的建立，目前还没有足够数据和公认的方法能够为我们提供合理的免疫耐受监测手段。鉴于此，美国国立卫生研究院于1999年建立了免疫耐受网络系统 (Immune Tolerance Network，ITN，www.immunetolerance.org)，目的在于支持临床器官移植免疫耐受诱导的研究，促进器官移植免疫耐受的研究发展。目前，很多中心都在尝试以各种方案实现临床器官移植免疫耐受，但真正能使患者完全停药，达到COT的并不多。本文将对目前成功诱导COT的一些方案、经验以及当前研究的热点进行简要综述。

二 临床器官移植免疫耐受诱导的进展
肝脏作为一个免疫特惠器官在解剖结构上，能最大程度的为供受体免疫细胞和肝细胞相互接触提供空间，这可能有利于免疫耐受的诱导，但是具体的免疫耐受诱导机制尚不清楚[4]。对于临床医生和患者来说，开展肝移植免疫耐受诱导要比其它器官移植更容易被接受[5]，因此临床上成功的免疫耐受报道常见于肝移植患者。

1997年Starzl和他的同事们第一次发现并报道肝移植后持续的、稳定的免疫耐受，他们发现了11例肝移植患者因为不遵守医嘱或因器官移植后淋巴细胞增殖紊乱疾病(Posttransplantation Lymphoproliferative Disorders，PTLD)而停药，最后完全停用免疫抑制剂达6个月至13年。Starzl等人以此现象为基础，尝试对95位肝移植患者（平均移植后时间为8.4年）诱导完全停药。18个患者在经过平均6.6个月的停药时间后可以完全停药，停药后平均随访时间长达34.5个月。在数据收集之时还有37个患者处于不间断的停药过程中[6, 7]。其中大部分完全停药的患者均较年轻。遗憾的是，到目前为止该作者没有再发表文章报道患者停药后的长期结果和预后。

其他一些中心也纷纷报道了临床免疫耐受现象（表1）。Girlanda等人2005年对18个10年前曾因免疫抑制剂毒副作用而被迫停药的患者进行随访[8, 9]。其中曾经有5个患者成功的停药并维持了很好的移植物功能（28%），但10年后仅有2个患者还维持免疫耐受状态，其他三个患者分别发生了迟发的急性排斥反应、慢性排斥反应和终末期肾功能衰竭。他们的经验提示，已经建立的免疫耐受，在某些条件下，也可以被打破而无法保证免疫耐受的长久。

Takatsuki等人报道了63个活体供肝肝移植儿童免疫耐受诱导的临床试验，移植后随访时间超过2年[10]。这些儿童患者都是因为药物导致的致命并发症比如败血症、淋巴瘤而停药。63个患者中有24个（38%）成功停药达23.5个月。该系列移植患者接受肝移植的平均年龄为1.1岁，而且成功诱导的免疫耐受比例达38%，这提示年轻患者在诱导免疫耐受上可能更具优势。

Rome的移植中心报道了34个患有活动性丙型病毒肝炎的肝移植患者，因担心免疫抑制剂的使用会加速丙肝的发展，作者开始主动让患者逐渐停止应用免疫抑制药物以期改善预后。最后8/34（27.2%）的患者成功的停用了免疫抑制剂，并且增强了患者机体对丙肝病毒的识别能力[11]。Gras等人曾在儿童肝移植后的早期免疫监测的研究中发现，一例儿童患者因为PTLD 而被迫完全停药长达4.75年之久[2]。Korea一中心最近发表文章报道了在105个儿童肝移植患者中，有4个患者不遵医嘱服药，另1个是因患有致命的PTLD，最后5个患者完全停药并维持正常移植物功能，停药后平均随访时间为32个月。

相当一部分肝移植患者免疫耐受都是偶然发现的，但最近10年来，越来越多的研究机构有意识的选择合适的患者来进行免疫耐受的主动诱导。目前，停止应用免疫抑制药物的方法非常适用于患有严重免疫抑制剂相关并发症患者的治疗，然而由于尚无有效的免疫耐受的监测手段，并不提倡对普通的、无生命威胁并发症的移植患者主动的停止免疫抑制药物治疗。曾有报道CAMPATH-1H（alemtuzumab，抗CD52单抗）能降低肝移植排斥发生率和降低免疫抑制剂的使用[12, 13]，由Immune Tolerance Network赞助的几个中心正在进行CAMPATH-1H联合免疫抑制剂逐渐停药诱导肝移植免疫耐受的临床试验，初期进展良好。诱导过程中的免疫监测成为他们研究的重点。

除了肝移植以外，肾脏移植患者也有自发免疫耐受的临床报道[14]。但是和肝移植相比，例数明显减少。而且停药后肾移植的急性排斥反应，并不像肝移植那样容易纠正，因此在免疫耐受机理完全清楚前，并不建议在临床上主动开展大规模的肾移植患者免疫耐受诱导试验。尽管目前肾移植诱导完全停药不现实，但临床上有研究证实了CAMPATH-1H联合TAC(Tacrolimus，他克莫司)的单一疗法能使肾移植患者实现免疫抑制剂量的最小化，这种疗法在移植患者的存活率、急性排斥的控制上能达到甚至优于传统三倍剂量的免疫抑制剂[15, 16]。

表1：几个移植中心报道的免疫耐受现象
时间
机构
患者数量
平均年龄(岁)
停药原因
维持治疗用药
完全停药比例
肝移植后至停药平均时间(年)
完全停药后随访时间（年）
参考文献
1997
Pittsburgh
95
1/3儿童
PTLD,
不服从*
TAC
AZA
18/95
(19%)
8.4
（1.7-25）
2.9
[6, 7]
1998-2005
London
18
47.7
慢性IS毒副作用
CSA
2/18
(11%)
7
(5-11)
10
[8, 9]
2001
Kyoto
63
1.1
慢性IS毒副作用
TAC
24/63
(38%)
>2
1.96
[10]
2006
Rome
34
62.2
反复HCV感染
CSA
8/34
(23.4%)
5.25
3.75
[11]
2007
Brussels
1
2
PTLD
TAC
1
0.17
4.75
[2]
2009
Korea
105
3
PTLD
不服从
TAC
5/105
(4.8%)
3.75
(1.12-5)
2.67
[17]
缩写词：IS: Immunosuppressive,免疫抑制剂 TAC：Tacrolimus，他克莫司 AZA：azathioprine，硫唑嘌呤 CSA：Ciclosporin A,环孢素A
PTLD（Posttransplantation Lymphoproliferative disorders）是器官移植后淋巴细胞增殖紊乱疾病的总称（非单一病种）。
*指患者不遵医嘱服用免疫抑制药物。

三 免疫嵌合理论在免疫耐受诱导中的作用
自从“免疫嵌合”诱导免疫耐受这一假说被提出以后，各国学者不断在各种器官移植实践中以该学说为指导，开展临床免疫耐受诱导试验[18]。免疫嵌合理论的发展经过了三个阶段，即完全嵌合、混合嵌合与微嵌合。最初研究学者发现一些患者因血液疾病而进行骨髓移植，之后患者接受源于同一供者的实体器官移植，移植成功后部分患者不需要服用免疫抑制剂而长期维持移植物功能[19]，这样经历过传统清髓后骨髓移植的患者体内的所有造血细胞（100%）均来自供者，因此被称为完全的免疫嵌合（full chimerism）。但诱导完全免疫嵌合需要对患者进行严格的预处理，包括全身放射清髓、细胞毒药物处理以及免疫抑制剂治疗等，严重地损害受体全身的免疫系统功能。

与完全嵌合相比混合嵌合（mixed chimerism）是一种对受体更加温和的方案，它能够使供者的造血细胞在受者体内持续表达，也就是说供者和受者的造血细胞能在受体内共存。与完全嵌合相比混合嵌合更好的保存了受体免疫活性，同时对移植物抗宿主疾病（graft-versus-host disease，GVHD）有更强的抵抗力[20]，尽管早期诱导混合嵌合的方案需要对患者进行严格的预处理，但很快就被“非清髓”（nonmyeloablative）方案所取代[21]。该方案对患者损伤相对较小，目前大部分临床上关于嵌合诱导免疫耐受的研究都是围绕诱导混合嵌合而展开的。

20世纪90年代Starzl提出的微嵌合（microchimerism）状态[22]是指在受者体内供者起源的造血细胞小于1%。微嵌合往往需要通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）等精密的方法才能检测出来，而混合嵌合通过流式细胞术即能测出。在实体器官移植中，供者白细胞随着移植器官而被带入到受者体内，因此微嵌合经常能够被发现。起初在移植非常成功且移植器官功能良好的一些患者中发现微嵌合现象，他们大多只需要少量的免疫抑制剂，同时部分患者被认为已经存在免疫耐受[23, 24]。然而另一些人却发现尽管微嵌合的存在，仍有部分患者发生了急性排斥反应，微嵌合在本质上对诱导免疫耐受并不具有预示诊断价值[25]。

目前，免疫嵌合理论中应用最广的是混合嵌合的诱导，完全嵌合清髓预处理给患者带来了极大的痛苦，在临床上的应用越来越少，而微嵌合在器官移植中的普遍性使得其在移植免疫耐受中作用受到了极大的关注。对于混合嵌合的诱导，大致需要三个基本过程，首先需要抑制患者骨髓，以促进供者造血细胞的增殖，常用细胞毒药物如环磷酰胺；然后为防止器官移植排斥反应和GVHD，我们需要消灭或灭活受者现有的效应T细胞和移植后产生的特异性效应T细胞。在动物实验模型及临床应用中通常用低剂量的全身放射 (Total Body Irradiation，TBI)、全身淋巴照射(Total Lymphocyte Irradiation，TLI)、抗胸腺细胞球蛋白 (anti-thymocyte globulin，ATG)[26]或者使用共刺激分子通路阻断剂对受体周围淋巴系统进行克隆删除[27]；最后要进行异体造血干细胞的引入，常用骨髓移植（Bone Marrow Transplantation，BMT）或造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)。

早期，多数通过诱导免疫嵌合成功诱导免疫耐受的方案仅对啮齿类动物有效，但也有一些学者成功的诱导大型动物和灵长类动物免疫耐受。Storb等人采用白细胞抗原（dog lymphocyte antigen，DLA）相匹配的犬类进行了非清髓的骨髓移植，为诱导混合嵌合，采用了TBI（200cGy）和甲氨蝶呤（methotrexate，MTX），为预防GVHD和急性排斥反应还用了一段时间的免疫抑制剂，包括环孢菌素（cyclosporine，CSP）和吗替麦考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）。经过5年观察，发现不仅初期成功的诱导了混合嵌合，同时这些成功诱导混合嵌合的犬类在进行了相同供者肾移植后能够长期存活（>1年）而不需要免疫抑制剂[28, 29]。与此同时，麻省总医院的Kawai等人也进行了大量的诱导混合嵌合以诱导免疫耐受的动物实验。他们采用TBI，胸腺放射（thymic irradiation，TI），ATG，BMT以及4个星期的免疫抑制剂环磷酰胺，成功诱导灵长类动物免疫耐受[30]。

在大型动物实验的基础上，很多学者尝试把这一理论方法运用于临床。在临床上，治疗多发性骨髓瘤伴有肾衰的患者很困难，因为肾衰很大程度上限制了化疗药的使用，同时肾移植也因为恶性疾病的存在而变得不适合。只有同时进行肾移植和BMT才可以彻底治疗这类疾病。正因为如此，这类患者被选来进行诱导混合嵌合的临床免疫耐受诱导试验[31]。我们把通过诱导免疫嵌合来诱导免疫耐受的经验总结如下表（表2）。

2002年，Stanford大学Millan等人报道了HSCT（动员的CD34+外周干细胞）联合肾移植的临床试验。在HLA不匹配的情况下，于器官移植后使用了TLI(10×0.8Gy)和ATG的处理，然后输注供者粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)动员的造血干细胞（CD34+），最后用环磷酰胺和强的松作为维持治疗的免疫抑制剂。4个患者中有3个成功诱导了混合嵌合，其中有两个患者在移植后成功停药，一个完全停药长达12个月，另一个患者停用强的松超过8个月[32]。在此经验之上，该团队利用相似的方案对HLA相匹配的3个患者(TLI，10×80cGy)行肾移植联合BMT，其中一个患者成功的诱导了稳定的混合嵌合并且免疫耐受长达2年，另一个患者只取得了暂时的混合嵌合，在尝试停药后发生了排斥反应[33]。

麻省总医院Kawai等人在灵长类动物实验的基础上，建立了2种通过肾移植联合BMT来诱导免疫耐受的临床方案。第一种临床方案针对那些多发性骨髓瘤伴有终末期肾衰的患者，根据嵌合诱导的思想，同时进行肾移植和BMT很可能在治好骨髓瘤的同时，成功诱导免疫耐受，达到双赢。他们的整个实验方案包括了：用环磷酰胺进行骨髓抑制治疗；采用马ATG和TI(7Gy)灭活T细胞；随后从同一个HLA相匹配的供者，进行了肾移植联合BMT；参与实验的6个患者最初都成功的诱导了嵌合，有4个患者为混合嵌合，2个患者为完全嵌合。最后2个完全嵌合的患者发生了GVHD，另外4个患者的混合嵌合虽然只维持了3个月，但是成功诱导了免疫耐受，而且在随访3-9年后肾功能仍然很好[31, 34, 35]。尽管上面实验结果很令人满意，但在实际临床工作中要找HLA相匹配的患者并不是那么容易，麻省总医院的第2种肾移植联合骨髓移植的方案就是在HLA单基因错配的患者中展开的。在此方案中，作者用抗CD2单克隆抗体希普利珠单抗(Siplizumab，MEDI 507)取代了之前ATG治疗，并且在第4和第5个病人中还加入了利妥昔单抗(Rituximab)作为补充。参与实验的5个患者有4个成功停药获得免疫耐受，1个患者发生不可逆的体液排斥反应，5个患者都存在短暂的混合嵌合，但均在3周后消失了。体外实验检测发现受者体内的T淋巴细胞对供者特异抗原无免疫反应，提示其可能是免疫耐受一方面的原因[36]。这项临床实验首次成功跨越HLA障碍，成功诱导肾移植免疫耐受。

作为早期、系统、全面的进行器官移植耐受研究的两个中心，Stanford大学和麻省总医院在诱导免疫耐受的方案上都有自己的特点（图1）。前者在肾移植后对患者进行了一系列处理后才引进供者造血干细胞，而后者则是在进行了一定预处理后才进行的肾移植和BMT；在处理细节上也有一些不同，前者TLI分次少量进行（10×80cGy），而后者则是一次性TI，700cGy。从目前临床数据来看，Stanford大学成功诱导了3/7（43%）患者耐受；麻省则成功诱导了8/11（73%）患者耐受。

图1：Stanford大学诱导耐受流程与麻省总医院诱导耐受流程对比

进行肾移植联合BMT并成功诱导免疫耐受的机构除了Stanford大学和麻省总医院以外，还有印度的肾脏疾病研究中心，其中Trivedi等人在非清髓的预处理中，使用环磷酰胺作为骨髓抑制剂，用ATG和低剂量特殊部位放射（腹部、腹股沟淋巴结、腰椎和部分盆骨段骨髓，4Gy）灭活T细胞。与前两个机构不同的是这些患者在移植前接受了供者的肾组织移植到患者胸腺内、两次供者白细胞输注以及大剂量多部位造血干细胞的输注。接受移植的33个患者中只有5个患者HLA是匹配的，最后，有4个患者完全停药210天而没有任何排斥反应，然而文章没有对患者嵌合和免疫方面进行详细的报道[37]。

在肾移植联合BMT取得良好成果的同时，也有一些学者尝试把这一理论应用于肝移植。正如上文所提及，肝脏作为免疫特惠器官，肝移植在临床上更易被患者所接受，目前也有一些通过嵌合成功诱导肝移植免疫耐受的报道（表2）。

Tryphonopoulos等人认为供者骨髓细胞移植在诱导肝移植患者COT具有很重要的作用。他们把104个患者分为两组：组1患者在移植后进行了供者骨髓细胞的移植，组2患者没有进行骨髓细胞移植。这次研究的结果令人不太满意，组1和组2的患者发生急性排斥和COT的比例十分相似，没有比较意义。而且这两组在嵌合的发生上也无任何有意义的差别。与其他机构不一样的是，他们在BMT前没有进行任何预处理，最后仍然有20%的患者能够完全停用免疫抑制剂[38]。

Karin Mellgren等人报道了1位1岁的患者在HSCT后进行了肝移植并成功诱导免疫耐受。这位小女孩被诊断为急性粒细胞白血病，常规化疗之后接受了源于其父亲的干细胞移植。术后因严重静脉闭塞而导致不可逆的肝衰，再次从HLA相匹配的父亲那里获得部分肝，进行活体肝移植。术后第一周，停用强的松，术后第一个月逐渐停止TAC，随访长达2年。遗憾的是作者并没有进行嵌合相关的报道[39]。

Donckier等人提出了一个系统的非清髓预处理联合HSCT诱导肝移植免疫耐受的方案[40, 41]，包括环磷酰胺抑制骨髓，ATG灭活T细胞，利用动员的外周血CD34+干细胞进行移植。预防GVHD所用免疫抑制剂为:TAC、强的松以及雷帕霉素（Rapamycin，第3个患者）。参与实验的3个患者，包括2个肝细胞癌和1个胆管上皮细胞癌，前两位患者在成功停药1年多后因肿瘤复发而去世，第3个患者由于胆管问题和肝功能不全而并未成功完全停药。

2008年“N Engl J Med”报道了一个罕见肝移植病例：9岁小女孩在爆发性肝炎肝衰竭后，从一个死亡的HLA不匹配的12岁男孩获得了供肝，患者的血型是O，RhD(-)，供者的血型为O，RhD(+)。移植后，患者服用TAC和糖皮质激素防止GVHD，9个月之后，患者发生了急性血管内溶血，血红蛋白尿、肾衰。在进行了输血（RhD-）和高剂量的免疫抑制剂治疗后好转。13个月后，在患者的骨髓中发现了男性的染色体，提示发生了嵌合。为了促进嵌合进一步进展，在1个月内撤掉了所有免疫抑制剂，移植后随访5年，患者没有使用任何免疫抑制药，而没GVHD发生[42]。上述患者在无意中诱导了完全造血细胞嵌合，按照传统的诱导完全嵌合的方法往往需要对患者进行清髓处理，给患者带来很大的伤害，但是这个小女孩竟在一次溶血中就慢慢发生了嵌合，提示在嵌合理论体系中很多东西对于我们来说仍然不是很清楚。

成功的嵌合需要机体允许完全不同的骨髓细胞在自己的体内增殖，这就需要找一种既能使外源细胞增殖，又对患者损伤小的方案。尽管这一直是近20年研究的热点，但是目前妨碍混合嵌合推广最主要的原因还是因为缺少低毒副作用的嵌合预处理方案。同时关于嵌合诱导免疫耐受的机制，目前也只是处于研究阶段，具体的免疫机理还不清楚，是否诱导免疫嵌合后能够一定诱导免疫耐受，目前还没有明确的结论。

表2：各移植中心通过免疫嵌合诱导免疫耐受的报道
时间
机构
患者数量
免疫配型
嵌合比例
结果
随访时间
参考文献
肾移植联合造血肝细胞（骨髓）移植
2002
Stanford大学
4
HLA不匹配
3/4短暂混合嵌合
2/4完全停药
1年
[32]
2008
Stanford大学
3
HLA匹配
2/3混合嵌合
1/3完全停药并耐受
2年
[33]
1999-2006
麻省总医院
6
HLA匹配
4/6短暂混合嵌合，2/6短暂完全嵌合
4/6完全停药（混合嵌合）
9年
[31, 34, 35]
2008
麻省总医院
5
HLA不匹配
5/5短暂嵌合
4/5停药并耐受
5年
[36]
2005
Ahmedabad
33
HLA匹配×5，HLA不匹配×28
成功停药的患者存在微嵌合或混合嵌合
4/33患者完全停药
210天
[37]
肝移植
2004
Miami
104
未知
1%微嵌合（实验组）
20/104停药
26月
[38]
2005
Gothenburg
2
HLA匹配
未知
1/2停药
25月
[39]
2006
Gent-Brussels
3
HLA不匹配
1/3短暂混合嵌合
2/3停药
分别为543,356天
[40, 41]
2008
Sydney
1
HLA不匹配
稳定完全嵌合
1/1,完全停药并耐受
4年
[42]

三．调节性T细胞与免疫耐受
调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）是不同于Th1和Th2的具有调节功能的T细胞群体，由于其具有负向免疫调节作用，而被学者广泛应用于自身免疫疾病[43]和器官移植免疫耐受[44]的研究之中。很多具有调节功能的T细胞像CD8＋T细胞[45]、NK T细胞和γδT细胞[46]都被不少学者描述过，但是这些T细胞都不如CD4＋T调节性细胞研究的清楚。早在10多年前，CD4+CD25+FOXP3+天然调节性T细胞就被认为是诱导外周免疫耐受的主要T细胞群[47]。叉头翼状螺旋转录因子(forkhead box protein P3，FoxP3)是一种编码转录阻遏蛋白的基因，作为一类Treg的标志物，在调节机体免疫稳态中起重要作用。随着各国学者频繁的对其进行描述和报道，CD4+CD25+FOXP3+Treg在临床前和临床研究中吸引了大量的目光[48]。

不管什么方案诱导的免疫耐受，都面临着一个共同的困难——免疫耐受的监测。如果能及时监测出免疫耐受，那么患者就能及时停药避免免疫抑制剂的副作用，同时也能避免盲目停药而诱发的排斥反应。很多研究中心（包括上面所提到的一些中心）在诱导免疫耐受的过程中都监测了Treg的变化（表3），从这些报道来看，器官移植免疫耐受的患者体内Treg大多会升高，这提示我们调节性T细胞可能作为免疫耐受的一项监测指标。机体对于MHC不匹配的外来器官或组织会同时激活损伤移植物的效应性T细胞(effector T cell，Teff)和保护移植物的Treg，两种细胞之前的平衡关系决定了异体移植物的转归。Steger等人的研究表明CD4+CD25+Treg不仅在免疫耐受患者中会增高，而且在发生急性排斥的患者中也会增高，也就是说Treg很可能在机体受到外源抗原刺激就能产生，但这个增高只是相对于患者移植前[49]。而朝阳医院的研究却发现患者发生急性排斥反应时外周血CD4+CD25+Foxp3+T细胞百分率低于未发生急性排斥反应的患者[50]，这个比较是针对移植后患者之间的比较，这也可能提示Treg倾向于优势时，患者发生急性排斥反应的几率较低。这也从某一个角度解释了Teff和Treg之间的平衡关系。

表3：几个中心对器官移植后患者Treg变化的记录
机构
时间
研究内容
Treg变化情况
参考文献
免疫耐受患者
急性排斥患者
慢性排斥患者
非免疫耐受患者
Kyoto 大学
2004
分析肝移植耐受患者外周血单核细胞变化
NKT细胞 下降
CD4+CD25high+T细胞 上升
Vδ1 /Vδ2γδT细胞比率 上升
未提及
未提及
正常
[51]
France
2006
免疫耐受和慢性排斥患者的调节性T细胞对比分析
CD4+CD25hiT细胞foxp3转录物 正常

未提及
CD4+CD25hiT细 foxp3转录物 下降
未提及
[52]
Spain
2007
对肝移植免疫耐受患者进行的免疫分析
CD4+CD25+T细胞 上升
Vδ1 T细胞 上升
（与非免疫耐受患者和健康人相比）
未提及
未提及
未提及
[53]
spain
2008
对肝移植患者停药过程中调节性Ｔ细胞的监测
CD4+CD25T细胞 foxp3转录物　上升（在停药的过程中及完全停药后与患者之前相比）
CD4+CD25T细胞 foxp3转录物 无变化
未提及
未提及
[54]
麻省总医院
2008
对混合嵌合诱导的肾移植耐受患者的体外研究
CD4+CD25+FOXP3+T细胞 上升（与使用免疫抑制剂患者相比）
未提及
未提及
未提及
[36]
北京朝阳医院
2011
肝移植急性排斥反应者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T淋巴细胞的变化
未提及
外周血CD4+CD25+Foxp3+T细胞百分率 降低（相比未发生急性排斥患者）
未提及
未提及
[50]

正因为移植患者体内存在的这种Teff与Treg之前的平衡，那么在体内诱导扩增Treg或者是把体外扩增的特异性Treg输入人体就有可能诱导免疫耐受和改善移植患者的预后。目前有4种规范的免疫疗法被证实能够促进Treg在体内增殖并在移植实验中起作用：1.抗CD3抗体；2.ATG；3.抗CD52抗体；4.mTOR阻断剂[55]。目前我们并不确定Treg的出现是成功移植患者的原因还是结果，那么要识别和影响对供者特异反应的Treg显得十分困难。从而提示在体内扩增Treg盲目性很大。要跨过这些障碍使Treg作为一种临床上可行的细胞疗法就需要使供者特异Treg在体外扩增，然后输给患者以保护移植物。这样，把Treg作为一种细胞疗法也有很多理论的优势：Treg可以置于可增殖的环境中，随用随取并且可以把握量的大小；其次，在临床运用Treg之前可以对其的效应性进行检测。目前，主要有两种途径可以在体外获得的Treg。1.在体外扩增天然调节性T细胞（nature regulatory T cell，nTreg）[56];2.在体外通过供者抗原刺激获得的诱导调节T细胞（induced regulatory T cell，iTreg）(又称适应性调节性T细胞aTreg)[57]。具体的诱导方法在另一篇综述中已详细描述[55]。

2008年Joffre 等人发表的一篇文章给我们展示了通过体外扩增的iTreg结合临床可接受的放射治疗，成功诱导了小鼠骨髓、皮肤和心脏移植免疫耐受[58]。他们在对小鼠进行心脏移植前进行了放疗、骨髓移植和特异的Treg的输注的预处理。100天后对于输入Treg的小鼠发现其移植的心脏直接和间接的表达供者抗原，并且没有任何急性或慢性排斥反应的迹象，他们认为防止排斥反应主要在于两方面机制：Treg直接抑制淋巴细胞从而有助于机体接受异体移植物；Treg的免疫抑制作用有利于诱导混合嵌合的状态，从而有利于输入的Treg长期存活和患者免疫耐受。最近也有文章报道通过Treg联合低毒性预处理BMT成功诱导了小鼠混合嵌合和移植免疫耐受[59]。

2009年，Trzonkowski在临床上首次报道把体外扩增的Treg作为一种细胞疗法进行移植免疫免疫耐受诱导[60]，他们针对2个骨髓移植后发生GVHD的患者尝试使用了该疗法。其中一个发生慢性GVHD的患者在骨髓移植后接受了2年的三联疗法（泼尼松、Tacrolimus、MMF），然后对该患者使用体外扩增的nTreg（1×105/kg），这些Treg均从供者的骨髓细胞中获得，经过扩增后90%的nTreg均为FoxP3+，之后患者停止了MMF和类固醇的使用，也没再有其它相关的隐形疾病复发。另一个患者在移植后29天被诊断为急性GVHD，这位患者在移植后第75天，82天，93天三次以3×106/kg的量接受了体外扩增的供者nTreg。尽管在第一次输入后有暂时的临床症状好转，但最终患者病情恶化在第112天死于器官衰竭。最近，有另外一个研究关于体外扩增的供者nTreg用于HLA单倍体相匹配的HSCT的患者，他们展示了Treg的输注能在不使用免疫抑制剂的情况下预防GVHD和促进免疫重建[61]。

供体细胞的输入，会引起针对于这些输入细胞的排斥反应，同时也面临临床可行性的问题。如果能够输入受体细胞，那么则可以避免上述问题，不仅可以提供大量的不会被排斥的Treg，还可以保证了该细胞治疗的临床可行。所以扩增受体Treg，诱导免疫耐受也是研究的一个方向。

除了调节性T细胞外，调节性树突状细胞也在免疫免疫耐受中起到了一定的作用[62]。目前，欧洲几个器官移植中心，启动了第一个体外诱导树突状细胞诱导临床免疫耐受的研究。该研究入选患者为活体供肾的移植患者，目前试验的进展初期结果良好，前景诱人。

四 结论
目前器官移植免疫耐受的临床研究正处于十分活跃的状态，很多患者将参与到诱导器官移植免疫耐受的临床实验之中，他们一些人很幸运会成功，另外一些却面临着失败。目前这么多的方法被用来诱导免疫耐受，其中最重要的问题还是安全问题。

诱导移植免疫耐受的机理还没有完全清楚，免疫嵌合理论和调节性细胞治疗，都获得了一些成功的病例报道，但是很多试验的诱导成功比率还是很低，可重复性较差。一些主动诱导的试验，还缺少明确的理论指导。因此针对免疫耐受机理的研究显得很重要，同时针对免疫耐受患者的免疫状态监测，寻找提示或者预测免疫耐受的指标仍然是我们目前还亟待进行的工作。

患者的配合也是临床免疫耐受试验成功的主要因素。患者本身承担了免疫耐受诱导失败的最大风险，因此很多患者即使免疫抑制用药到了极低的用量，但是因为害怕移植物丢失，会拒绝停药。因此加强与患者的沟通与交流，也是临床诱导免疫耐受试验的重要因素。

参考文献
[1] Meier-Kriesche H U, Schold J D, Srinivas T R, et al. Lack of improvement in renal allograft survival despite a marked decrease in acute rejection rates over the most recent era[J]. Am J Transplant,2004,4(3):378-383.
[2] Gras J, Wieers G, Vaerman J L, et al. Early immunological monitoring after pediatric liver t