玉米bZIP转录因子ZmbZIP26的分子特征、亚细胞定位及响应非生物胁迫的表达分析.pdf
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1、华北农学报():收稿日期:基金项目:中央引导地方科技发展资金()河南省农业科学院杰出青年科技基金()河南省青年人才托举工程项目()国家自然科学基金青年基金()作者简介:曹丽茹()女河南濮阳人副研究员博士主要从事玉米逆境生理与分子生物学研究及种质创制和新品种选育通信作者:鲁晓民()男河南许昌人研究员博士主要从事玉米新品种选育及示范推广玉米 转录因子 的分子特征、亚细胞定位及响应非生物胁迫的表达分析曹丽茹马晨晨庞芸芸叶飞宇王振华鲁晓民(.河南省农业科学院 粮食作物研究所河南 郑州.神农种业实验室河南 郑州)摘要:转录因子广泛存在于植物中在调节植物生长发育和非生物胁迫应答中起着重要作用 为探究 转录
2、因子在玉米干旱胁迫响应中的功能在玉米苗期干旱胁迫处理 和复水 时利用转录组测序技术对转录因子基因的表达变化进行分析筛选到一个响应干旱和复水处理的 转录因子()共表达网络分析发现 处于网络调节的核心节点位置 基因含有 的开放阅读框编码 个氨基酸属于亲水性蛋白 蛋白质进化树及保守序列分析发现 蛋白与高粱和芒草同源蛋白的同源性较高而且在同一氨基酸位置上的保守基序相同 启动子顺式作用元件分析表明 上游 区域内含有干旱响应元件、激素响应元件和光响应元件等 分析发现 是组成型表达基因在幼茎、雌穗和根中高表达且 基因积极响应干旱、高温、高盐、氮胁迫及恢复正常的过程可能在植物的抗逆过程中发挥着重要作用 亚细胞
3、定位分析发现 属于核蛋白定位在细胞核上 蛋白质互作预测发现 可能与锌指蛋白、丝氨酸蛋白、钙依赖性蛋白、谷胱甘肽转移蛋白等互作构建了一张调控网络协同调控玉米生长发育和胁迫应答过程关键词:玉米 转录因子干旱复水处理非生物胁迫中图分类号:.文献标识码:文章编号:():./.(.):.().华 北 农 学 报 卷 .:随着全球气候变暖加剧了极端干旱天气发生的程度和频率导致植物在生长过程中受到干旱的影响愈加严重使粮食生产受到严重威胁 玉米(.)是世界上主要的粮食作物之一在全球的种植范围较为广泛其产量在粮食作物中居于首位 我国是农业大国玉米不仅是我国重要的粮食作物和饲料作物工业生产中也是必不可少的原料 随
4、着我国人口数量的增加以及对能源的需求逐渐增长在有限的耕地面积下保证玉米的高产、稳产是保障粮食安全的重要途径 玉米在生长过程中需水量大对水分胁迫十分敏感干旱会导致玉米产量降低甚至严重时导致玉米绝收应对干旱胁迫最有效的途径是培育抗旱玉米新品种而利用分子育种技术改良创制抗旱新种质是最有效的途径之一因此对玉米抗旱基因的挖掘和遗传解析是当前重中之重的工作植物体内都存在着自我调节机制和自我恢复能力当环境发生改变时作物会出现恢复原生长的趋势 干旱胁迫条件下作物为适应环境会减慢生长在干旱后复水又会加快生长在一定程度上弥补干旱胁迫造成的损失产生了补偿效应或者超补偿效应 补偿效应在自然界普遍存在是植物应对逆境胁迫
5、的自我调节机制 等研究发现籼稻幼苗在干旱胁迫程度未超过其耐受阈值时对其补水后可以产生补偿或超补偿效应表现出其恢复力和适应性 刘婷婷等通过对高粱幼苗干旱复水处理发现干旱时高粱的相对含水量、叶绿素含量等生理指标均有所下降复水后各项生理指标恢复正常高粱干旱适应能力与复水后的恢复性呈正相关 饲料大麦的株高、穗长、单株产量等指标随着干旱胁迫时间的增加显著下降在复水后这些指标都得到了不同程度的恢复且恢复程度随着复水量的增加而增加植物面临干旱胁迫时体内除了生理生化发生变化在分子水平和蛋白质水平也会发生一系列的变化分子水平上的改变起着决定性作用 响应干旱胁迫的基因按照其作用的方式可以分为 种即功能基因和调控基
6、因其中调控基因包括蛋白激酶和转录因子 转录因子()是一种能和基因启动子区中的顺式作用元件特异性结合的蛋白质分子调控植物的生长发育过程并在抵御逆境胁迫过程中发挥着重要作用转录因子在转录因子中家族成员最多且广泛存在于植物中在调节植物响应非生物胁迫的生理过程中起着十分重要的作用 拟南芥中存在多个与抗逆性相关的 基因 干旱胁迫下基因被强烈诱导该基因过表达后拟南芥的抗旱能力明显增强 过表达使拟南芥的抗盐、抗旱能力都提高在拟南芥中过表达玉米 基因发现其激活了、等脱落酸()诱导基因的高表达增强了转基因植株的抗旱性 沉默 基因后发现水稻转基因植株对盐和干旱胁迫十分敏感 基因通过调节 的合成从而影响番茄对盐和旱
7、胁迫的抗性目前有关 转录因子与植物生长发育关系的研究较多其在植物抗逆中的作用研究也逐渐增多 但关于其响应玉米干旱复水处理的研究较少本研究利用高通量测序技术对玉米正常、干旱和恢复浇水条件下的叶片和根系进行转录组测序筛选到一个 转录因子 暂时命名为 对 进行生物信息学分析同时运用 技术分析其在玉米不同组织器官中的表达情况以及在干旱、高温、高盐、氮胁迫处理下的表达特性为深入研究玉米 基因的生物学功能奠定基础也为挖掘抗逆相关分子资源、培育抗逆品种提供依据 材料和方法.试验材料及处理方法以玉米优良自交系郑 作为试验材料当玉米生长到三叶一心时进行干旱胁迫(土壤含水量)和复水浇水(土壤含水量大于)处理取胁迫
8、前、干旱胁迫 以及复水 后的叶片和根系分别命名为、和、株为一个样品每个样品 个生物学重复用于转录组测序和后期差异基因表达量的验证 取在田间正常生长到三叶一心的玉米幼叶、期曹丽茹等:玉米 转录因子 的分子特征、亚细胞定位及响应非生物胁迫的表达分析 幼茎、幼根以及抽雄后的成熟叶、成熟茎、成熟根、雄穗、雌穗组织样品进行基因时空表达分析 温室中采用光培养 、培养温度为 暗培养 、培养温度为 相对湿度 当郑 生长到三叶一心时取生长一致的玉米苗进行处理干旱组用 (营养液 )处理盐胁迫组用浓度 /的 处理氮胁迫组将玉米幼苗移至缺乏铵态氮的 营养液中高温组 培养在处理 以及解除胁迫后的 取玉米根系 株为一个重
9、复取 个生物学重复用于分析基因响应非生物胁迫的表达量变化 取完样品迅速放入液氮中并存放在 的超低温冰箱中.转录组测序与差异表达转录因子基因筛选将样品委托广州基迪奥科技有限公司做高通量测序分析基因表达量的计算采用()算法根据 值计算基因在处理组和对照组之间的差异倍数差异表达转录因子基因筛选标准为()筛选玉米干旱复水过程中的差异表达 转录因子参考(:/./)数据库进行命名.基因的克隆对玉米郑 总 提取利用 多糖多酚植物总 提取试剂盒(天根生化科技有限公 司)的 方 法 根 据 反 转 录 试 剂 盒 ()提供的反应程序()合成 在 网站上搜索()基因的序列设计特异性引物(:和:)以 为模板对 基因
10、的开放阅读框()进行扩增将扩增产物连接到 载体()上转化大肠杆菌 感受态细胞挑选出阳性单克隆(至少 个样品)送到华大公司进行测序测序结果与 数据库进行比对.基因的生物信息学分析利用 对 基因编码蛋白质的分子质量、疏水性及稳定性等进行预测采用 对蛋白质磷酸化位点进行预测利用 对 蛋白的二级结构进行分析利用软件 中的 构建 蛋白与不同物种同源蛋白的进化树利用 对蛋白质的保守基序()进行分析将基序的最大数值设置为 利用 在线工具预测 的互作蛋白从 数 据 库 (:/./.)获取 基因上游 序 列 用 (:/./)对 基因启动子区的顺式作用元件进行分析.实时荧光定量()分析根据 基因序列设计特异的荧光
11、定量引物(:和:)以玉米 作为内参(引物:和:)以上面不同组织、不同胁迫环境的样品 反转录 作为模板参考 试剂盒上的程序采用两步法(个循环)进行采用 法对数据进行分析.蛋白的亚细胞定位分析亚细胞定位使用表达载体 结合酶切位点 和 设计引物(:和:)对 基因进行扩增经和 双酶切后用 连接酶连接表达载体并转化 将测序正确的重组质粒转到农杆菌 感受态中利用注射法将农杆菌菌液浸染七叶期生长强壮的烟草叶片注射 后对浸染的叶片通过共聚焦显微镜观察烟草表皮组织细胞内绿色荧光蛋白的表达情况 结果与分析.基因的筛选对三叶期玉米幼苗进行干旱和复水处理取根系和叶片部位进行转录组测序对基因的 值和功能注释进行分析发现
12、了 个 转录因子成员响应干旱和复水处理其中 基因的表达量在正常、干旱和复水处理下达到差异极显著水平(.)并将这些基因导入软件 来构建基因共表达网络鉴定处于核心节点的关键基因 通过分析发现 基因在共表达网络上与其他基因有较高的关联度 华 北 农 学 报 卷(图)说明 基因是共表达网络的核心关键基因 对玉米叶片和根系中 进行 分析发现在干旱胁迫后该基因在叶片和根系中相对表达量均显著升高复水后逐渐恢复正常(图)且定量结果与转录组分析结果一致表明 基因在玉米干旱复水过程中发挥着重要的作用图 差异表达 转录因子基因的共表达网络.不同小写字母表示差异显著(.)图 同 (.).图 基因表达的 验证.基因的克
13、隆和编码蛋白质性质分析利用 技术对 基因进行扩增利用.的琼脂糖凝胶电泳得到了一条大小约为 的条带(图)切胶回收后连接克隆载体筛选出阳性单克隆 测序结果表明该段序列是一个完整的 的开放阅读框编码了 个氨基酸与 数据库中 的参考序列是一致的.图 基因 扩增结果.采用 软件对蛋白质性质进行分析结果表明 的相对分子质量为.分子式为 理论等电点为.蛋白质的不稳定系数为.属于不稳定蛋白 分 析 发 现 亲 水 性 值(值)为.属于亲水性蛋白预测 跨膜螺旋区显示该蛋白质无跨膜结构域利用软件 进行预测发现该蛋白质 螺旋占比.转角占比.无规则卷曲占比.表明该蛋白质以 螺旋结构为主(表)分析显示该蛋白质含有 个丝
14、氨酸和 个苏氨酸磷酸化位点表明 蛋白可能被丝氨酸和苏氨酸激酶激活调控下游响应基因从而参与植物的生长发育、信号传导及逆境胁迫过程等表 蛋白性质分析.蛋白质性质 数值相对分子质量/.理论等电点 .不稳定系数 .亲水性值 .螺旋/.转角/.无规则卷曲/.蛋白的系统进化以及保守序列分析为了揭示 的进化关系利用软件 构建了多物种同源蛋白的进化树发现 蛋白与高粱()和芒草()同源蛋白的关系比较紧密且与水稻()同源蛋白的进化关系比较远(图)为进一步分析 蛋白与其他物种同源蛋白的保守性利用软件 鉴定 个保守基序发现玉米不仅与高粱和芒草同源性较高而且在同一氨基酸位置上的保守基序相同与水稻的保守基序相差较大(图)
15、说明了不同物种间的同源性越高保守基序相似度越高其亲缘关系也就越近 期曹丽茹等:玉米 转录因子 的分子特征、亚细胞定位及响应非生物胁迫的表达分析 图 蛋白与其他物种同源蛋白进化树及保守基序分析.基因启动子顺式作用元件分析为分析 基因的潜在功能利用在线软件 对 基因 上游 的顺式作用元件进行了预测结果显示该转录因子基因除了启动子本身含有的最基本元件、等 还 含 有、等多个结合位点(表)参与脱落酸信号传导途径响应干旱胁迫是 结合位点参与干旱诱发过程、参与茉莉酸信号传导途径是水杨酸响应元件诱导水杨酸途径相关基因的表达 此外还有大量的响应光刺激的元件、等因此推测 基因还可能调控植物开花、参与光合作用等表
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