玉米品种真实性SSR分子检测体系优化_林显凤.pdf

玉米品种真实性 分子检测体系优化林显凤，罗友明，尚 玥，赵长坤，龚 辉，杨 腾，白体坤，毛若涵，李仕伟，游 宇，（南充市农业科学院，四川南充；南充市种子质量监督检验站，四川南充；南充市种子管理站，四川南充；中国农业大学农学院，北京）摘要 对南充市农业科学院提供的 份玉米品种，随机选用 主要农作物品种真实性和纯度 分子标记检测 玉米中的 个 位点，利用琼脂糖凝胶电泳检测法、变性 银染检测法和毛细管电泳分析法，分析了不同的扩增程序、仪器设备和反应体系等对 产物质量的影响。结果表明：退火温度和 聚合酶有利于玉米品种真实性 标记的检测；种 扩增仪对扩增结果并无较大区别。，即 退火温度，扩增仪（），聚合酶，毛细管电泳法相结合为最优组合，可作为四川品种真实性快速检测候选方法。关键词 标记；玉米；真实性；检测体系中图分类号 文献标识码 文章编号（）：开放科学（资源服务）标识码（）：，（，；，；，），；，（），；基金项目 南充市科技计划项目（）。作者简介 林显凤（），女，吉林前郭尔罗斯人，农艺师，硕士，从事种子质量监督与检验研究。通信作者，助理研究员，硕士，从事花生遗传育种研究。收稿日期 玉米（）是全球重要的粮食和饲料作物及工业生产原材料，在我国农业生产中起着巨大的影响作用。随着我国玉米育种技术的更新换代，审定品种数量呈现“井喷式”增长，但遗传基础却越来越狭窄，以及玉米种子经营渠道多、乱、杂，各地普遍存在以假充真、以劣充优的现象，严重限制了农业生产的发展，使许多农户和经济组织遭受极大的经济损失。玉米品种真实性和纯度检测的方法可以根据原理的不同，通过形态法、生理生化法、物理化学法、细胞学法、分子生物学法进行鉴定；还可以根据检验对象的不同分为种子测定法、植株测定法、幼苗测定法；还可以根据检验场所的不同分为田间小区种植鉴定和室内检验等。国内一般采用田间小区种植鉴定和室内检验作为后控。传统的品种真实性鉴定有形态鉴定法和田间小区种植鉴定法，这 种方法存在费工、费时、鉴定周期长、费用高等缺点，且这 种方法受环境和人为影响较大，鉴定者的观察经验也制约着鉴定的准确性。用分子标记技术鉴别植物品种真实性，具有检测速度快，准确性高，重复性好，操作简单，且不易受季节和环境变化影响等特点，是一种快速、精准鉴定品种真实性的有效方法。微卫星（，），是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列，其重复单位为 个核苷酸，由 个重复单位串联组成。标记呈共显性遗传，可分辨出杂交种子的纯合体和杂合体，每个位点均有许多等位形式，多态性高，结果重演性和稳定性高，是目前较受欢迎的分子标记技术。检测 产物扩增结果的方法大致有以下 种：琼脂糖凝胶电泳检测；琼脂糖毛细管电泳检测；放射自显影检测；利用 银染法进行检测；利用全自动核酸蛋白分析系统进行结果分析。目前已有学者利用琼脂糖凝胶电泳 分子检测鉴定出玉米品种真实性和纯度检测最适宜的部位。笔者选取、个方法分析扩增程序、仪器设备和反应体系等因素对四川玉米品种真实性 分子测定结果质量的影响，筛选出适宜的试验条件以适应四川目前真实性室内分子检测工作开展的需要。材料与方法 试验材料 供试玉米种子样品，由南充市农业科学院玉米研究所提供。共 个种子样品，分别为南、南。植物基因组 提取试剂盒（），聚合酶：（）、（）、四通道卡夹（）。智能人工气候箱（）；研磨仪（）；扩增仪（）；扩增仪（）；微量紫外分光光度计（）；全自动凝胶成像系统（）；聚丙烯酰胺凝胶电泳仪（）；荧光毛细管电泳设备（安徽农业科学，（）：）。试验方法 提取。采取对玉米种子进行发芽试验，利用植物叶片直接提取的方法，每个试样取 粒种子的叶片混株样品，使用研磨仪进行研磨，用 提取试剂盒提取玉米全基因组，方法详见试剂盒说明书。提取的 用微量紫外分光光度计检测 质量和浓度，并稀释到 。扩增。反应采用 体系，上、下游引物各 ，。引物使用 主要农作物品种真实性和纯度 分子标记检测 玉米中的 对引物（表）进行 扩增。反应程序：预变性 ；变性，退火 ，延伸 ，共 个循环；延伸 ，保存。表 对 引物名称与序列 引物编号 引物名称 染色体位置 等位变异范围 引物序列（）：琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物需在 仪上执行变性程序：变性，冷却 以上。采用琼脂糖凝胶进行电泳，点样时同一引物的 个样品相邻，稳压稳流状态电泳后用全自动凝胶成像系统进行照相读带。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。采用 主要农作物品种真实性和纯度 分子标记检测 玉米中的检测方法。扩增产物自带染料，无须加入。扩增产物需在 仪上执行变性程序：变性，冷却 以上。采用 进行灌胶，点样时同一引物的 个样品相邻，电泳 后用银染法显带并观察结果。银染法显带步骤：固定漂洗染色漂洗显影定影漂洗。固定，次，；漂洗，次，；染色，次 ；漂洗，双蒸水，次，；显影，定容至 中，摇床上轻轻晃动至纹带出现；定影，定影，；漂洗，次，。毛细管电泳检测。将样品在 仪上 变性 取出，冷却 以上。用 荧光毛细管电泳设备进行电泳检测。电泳步骤：联机与通气检查放入缓冲液和 放入样品并复位置入卡夹卡夹锁定与校准程序设定，程序设定好后点击，开始电泳分离，可点击 实时监测电泳过程。结果用 软件进行分析。试验设计 采用、个退火温度；种不同来源的 聚合酶；台不同企业不同年度购买的 扩增仪；种不同的电泳方法。为便于图片标记和数据处理，分别对试验数据进行编号（表），并根据表 的试验条件进行试验。结果与分析 模板质量检测 用植物基因组 提取试剂盒（）提取的 模板，采用微量紫外分光光度计（）进行检测。检测结果显示（表），所提取的 模板质量较高，能够满足试验处理的质量要求。每个样品稀释至 备用。安徽农业科学 年表 试验条件及编号 序号项目试验条件 编号扩增程序：退火温度 反应体系：聚合酶 聚合酶（）聚合酶（）仪器设 备：扩增仪 扩增仪（）年购买 扩增仪（年购买）检测方法：电泳琼脂糖凝胶电泳甲 凝胶成像电泳乙 荧光毛细管电泳丙琼脂糖凝胶电泳下不同处理对 产物质量的影响 采用琼脂糖凝胶电泳的方法分析了扩增程序中不同退火温度、不同 扩增仪和不同 聚合酶对玉米品种真实性 标记扩增产物质量的影响。对比 产物电泳谱带的清晰度和干净度可知，退火温度条件下，电泳谱带拖带明显，特异性较低，非特异性产物较多，杂质多；退火温度条件下，条带特异性高，杂质少，条带和背景较 退火温度图谱清晰、干净。利用（）和天根（）聚合酶得到的 产物电泳条带特异性均较高，目标条带比较清晰、杂质少、背景较干净。但天根 聚合酶未能扩增出 甲、甲、甲、甲中 目的条带。使用（）和 仪进行扩增，对比条带特性、背景清晰度可知，不同品牌仪器对结果的影响并不明显（图）。因此，采用琼脂糖凝胶电泳方法，得到结果为 退火温度和 聚合酶较有利于开展玉米品种真实性 标记的检测。表 试验条件组合及代号 组合编号试验条件 甲乙丙组合代号 甲 甲 甲 甲 甲 甲 甲 甲 乙 乙 乙 乙 乙 乙 乙 乙 丙 丙 丙 丙 丙 丙 丙 丙 注：代表组合采用该处理方法。：表 提取的 检测结果 品种编号品种名称 浓度 南 南 聚丙烯酰胺凝胶电泳下不同处理对 产物质量的影响 利用 个试验处理分析了变性聚丙烯酰胺凝胶电泳下不同退火温度、不同 聚合酶和不同品牌的 扩增仪对玉米品种真实性 标记扩增产物质量的影响（图）。处理 乙与 乙、乙与 乙比较，个不同的退火温度对目的条带的特异性并无较大区别，杂质少，条带和背景均较干净；处理乙与乙、乙与乙相 卷 期 林显凤等 玉米品种真实性 分子检测体系优化注：个泳道依次为 和 对 玉米品种真实性和纯度 分子标记检测对南 和南 的扩增产物。：，图 琼脂糖凝胶电泳分析扩增程序、仪器设备和反应体系对 产物质量的影响 ，注：个泳道依次为 和 对 玉米品种真实性和纯度 分子标记检测对南 和南 的扩增产物。：，图 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增程序、仪器设备和反应体系对 产物质量的影响 ，安徽农业科学 年比较，图谱杂质少，背景干净，条带清晰易读取。聚合酶 和 以及不同品牌的 扩增仪对目的片段的扩增结果并无较大区别，但 未能扩增出 乙、乙、乙、乙中 目的条带，这与琼脂糖凝胶电泳结果相一致。因此，在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳下 退火温度和 聚合酶 较有利于玉米品种真实性 标记的检测。毛细管电泳下不同处理对 产物质量的影响 不同退火温度、聚合酶和 扩增仪下毛细管电泳图谱与琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱相一致。通过胶图（图）和信号图（图）可知，台 扩增仪对玉米品种真实性 标记扩增产物质量的影响无明显区别。不同退火温度处理下，退火温度的 个组合中，丙、丙非特异性条带浓度比目的条带高，丙的非特异性条带的信号明显强于目的条带；退火温度的胶图背景干净，杂质少，特异性较高，信号图中的主峰明显，仅 丙和 丙中存在较多小于 的非特异性条带。聚合酶 扩增结果中，丙、丙、丙、丙非特异性条带较少，背景较干净；扩增结果中，丙、丙、丙、丙小于 和大于 的非特异性条带较多（图），部分条带浓度高于目的条带浓度，这可能与试验条件组合不同有关。因此，在毛细管电泳下 退火温度和 聚合酶 较有利于玉米品种真实性 标记的检测，这与琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果相一致。图 毛细管电泳分析扩增程序、仪器设备和反应体系对 产物质量影响的胶图 ，结论与讨论 扩增是品种真实性分子标记鉴定过程中的重要环节。影响 反应结果的重要因素包括反应体系、扩增程序和仪器设备等。该研究主要针对这 个方面进行组合比较，得出最优组合，以满足分子检测工作的开展需要，能够快速为种子管理部门、执法机关提供技术支撑。结果表明，退火温度有利于玉米品种真实性 标记的检测；聚合酶较适合玉米品种真实性 标记的检测；种不同公司、不同年度采购的 扩增仪对玉米品种真实性 标记的检测并无明显区别。最终得出 丙组合为最佳。琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果中，未能扩增出 目的条带；毛细管电泳检测时，和 组合，无论退火温度是 还是 ，均有目的条带的主峰图存在；和 进行组合时，均无目的条带，这有可能由于某些引物与使用不同的 扩增仪有关，也有可能与人 为操作有关。鉴于只使用 主要农作物品种真实性和纯度 分子标记检测 玉米中的 对引物，对其他引物扩增效果尚不清楚，建议优先使用，即 聚合酶。卷 期 林显凤等 玉米品种真实性 分子检测体系优化图 毛细管电泳分析扩增程序、仪器设备和反应体系对 产物质量影响的信号图 ，安徽农业科学 年图 针对 引物，采用 聚合酶，不同退火温度、不同 扩增仪对 产物质量影响的信号图 种方法检测的片段大小基本一致，琼脂糖凝胶电泳方法可扩增出目的条带的大概位置，分离效率较低，适宜鉴定 个品种是否为同一品种的检测；变性 银染检测法的仪器设备及试剂成本低廉，适合于少量材料的检验分析，特别是 标记的筛选，其过程复杂，因素较多，且工作效率较低。毛细管电泳荧光检测法具备高通量、上样灵活、高灵敏度（）和高分辨率（最佳可达 ）等优势，操作过程无须人工制胶、染色、加样、拍照，操作简便，可自动计算片段大小，结果美观易判断，可替代 凝胶电泳，作为四川大批量材料的检测分析，也为四川 指纹库的构建打下坚实基础。参考文献 沈仁飞 分子标记及其在玉米真实性鉴定上的应用云南农业科技，（）：孙琦，张世煌，李新海，等中国不同年代主推玉米品种品质性状的变化趋势中国农业科学，（）：李巧英，郑戈文，任路路，等 分子标记两种电泳方法快速区分玉米种子杂交种农业科技通讯，（）：孙卫永，尹航，郝德荣玉米杂交种生产中存在的主要问题及关键措施中国种业，（）：郑成超，温孚江 分子标记技术与作物品种纯度鉴定山东农业大学学报，（）：农业部全国农作物种子质量监督检验测试中心农作物种子检验员考核学习读本北京：中国工商出版社，：刘峰，冯雪梅，钟文，等适合棉花品种鉴定的 核心引物的筛选分子植物育种，（）：周会，苏秀，毛双林，等杂交水稻品种真实性和纯度的 分子标记鉴定种子世界，（）：张冰清，陆徐忠，吴新杰，等利用 标记进行杂交油菜品种鉴定中国油料作物学报，（）：王飞 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