微生物检验专题知识讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,微生物检验专题知识讲座,微生物检验专题知识讲座,第1页,主要内容,第一节 核酸探针技术检测食品微生物,（第六章,p108,）,第二节,PCR,技术检测食品微生物,（第七章,p121,）,第三节 环介导等温扩增技术检测食品微生物,（第八章,p161,）,第四节 基因芯片技术检测食品微生物,（第九章,p172,）,微生物检验专题知识讲座,第2页,第一节 核酸探针技术检测食品微生物,一、探针定义,定义：探针,(probe),，,是指与特定靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊方法探知分子。,类型：,抗体,-,抗原、生物素,-,抗生物素蛋白、生长因子,-,受体,核酸探针：,是指带有标识物已知序列核酸片段，它能和与其互补核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列检测。,微生物检验专题知识讲座,第3页,二、核酸探针工作原理,两条碱基互补,DNA,链在适当条件下按碱基配对标准形成杂交,DNA,分子。依据,DNA,遗传序列相对稳定性和互补标准，用已知特异碱基序列作成有标识一小段单链,(,或核苷酸序列,),与被检测材料进行分子杂交。假如被检测材料中病原遗传序列与探针含有互补碱基序列，就会形成杂交双链，从而证实它们之间含有一定程度同源性。（,p108,）,微生物检验专题知识讲座,第4页,微生物检验专题知识讲座,第5页,三、核酸探针种类,（一）按起源及性质划分,1.,基因组,DNA,探针,2.cDNA,探针,3.RNA,探针,4.,寡核苷酸探针,（二）按标识物划分,1.,放射性标识探针：用放射性同位素做为标识物,2.,非放射性标识探针：生物素,(Biotin),和地高辛,(digoxigenin),。,微生物检验专题知识讲座,第6页,四、核酸探针制备方法（略,p109,）,（一）探针制备,要求：长度普通以,50300bp,为宜。,制备方法：,(1)DNA,重组技术,(2)PCR,扩增,(3),化学合成,微生物检验专题知识讲座,第7页,四、核酸探针制备方法,（二）核酸探针标识方法,（略,p109,）,1.,核酸探针放射性同位素标识,（,1,）缺口平移法,（,2,）末端标识法,（,3,）应用特异单引物法标识,DNA,探针,2.,核酸探针非放射性标识法,（,1,）核酸探针生物素标识,（,2,）核酸探针地高辛标识,（,3,）核酸探针光敏,DNP,标识,（,4,）核酸探针三硝基苯磺酸（,TNBS,）标识,（,5,）核酸探针辣根过氧化物酶标识,微生物检验专题知识讲座,第8页,四、核酸探针制备方法,理想标识物（核酸探针）应满足：,(1),标识前后探针基础结构、化学性质相同,;,(2),特异性强、本底低、重复性好；,(3),操作简单、节时；,(4),安全、无环境污染。,微生物检验专题知识讲座,第9页,五、核酸探针杂交方法,分子杂交：,把亲源关系较近，不一样生物个体起源变性,DNA,或,RNA,单链，经退火处理形成,DNA-DNA,或,DNA-RNA,这一过程叫,分子杂交。,应 用：,(1),检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；,(2),用来揭示核酸片段中某一特定基因存在是否、拷贝数及表示丰度。,微生物检验专题知识讲座,第10页,微生物检验专题知识讲座,第11页,杂交类型,（,1,）按杂交对象：,DNA-DNA,RNA-DNA,（,2,）按作用环境：,固相杂交：是将参加反应一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸（,标识探针）,游离在溶液中。,液相杂交：所参加反应两条核酸链都游离在,溶液中,微生物检验专题知识讲座,第12页,（一）印迹杂交,基础过程：,第一，经过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上；,第二，用标识探针与支持物上核酸片段进行杂交；,第三，杂交信号检测。,主要类型：,斑点印迹杂交,(Dot-blot),Southern,印迹,(Southern blot),Northern,印迹,(Northern blot),微生物检验专题知识讲座,第13页,1.Southern,印迹法,Southern,印迹法,(Southernblotting),是最早,DNA,探针杂交技术，,1975,年，由英国分子生物学家,E.M.Southern,所创造。就是将凝胶上,DNA,片段转移到硝酸纤维素滤膜上后，在进行杂交。,被检测对象为,DNA,微生物检验专题知识讲座,第14页,Southern,印迹操作方法有三种,毛细管转移,(,或虹吸印迹,),进行毛细管转移时，,DNA,片段由液流携带从凝胶转移到固相支持物表面。,电转移,利用电场电泳作用将凝胶中,DNA,转移到固相支持物上，可到达简单、快速、高效目标。,真空印迹法,利用真空作用将转膜缓冲液从凝胶上层容器抽到下层，凝胶中核酸片段将随缓冲液移置到凝胶下面固相支持物上。,微生物检验专题知识讲座,第15页,微生物检验专题知识讲座,第16页,2.Northern,印迹法,Northern,（,Northern blotting,）印迹杂交技术是,1979,年，,J.C.Alwine,发展出来一个新方法,检测目标,RNA,存在是否及含量。,是指将,RNA,片段变性及电泳分离后，转移到固相支持物上过程,微生物检验专题知识讲座,第17页,Northern,印迹方法与,Southern,印迹基础相同，可参考进行。,但,RNA,变性方法与,DNA,不一样。,DNA,样品可先经过凝胶电泳进行分离，再用碱处理凝胶使,DNA,变性。而,RNA,不能用碱变性,因为碱会造成,RNA,水解。所以，在,Northern,印迹前，须进行,RNA,变性电泳，在电泳过程中使,RNA,解离形成单链分布在凝胶上，再进行印迹转移。,微生物检验专题知识讲座,第18页,3.,斑点杂交,将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。为使核酸牢靠结合在膜上，通常还将点样后膜进行,80,真空烘烤,2h,。,特点：,可在一张膜上同时进行多个样品检测，操作简便、快速，在临床诊疗中应用较广。,适用范围：,特定基因定性及定量研究，,微生物检验专题知识讲座,第19页,（二）原位杂交,用探针对细胞或组织切片中核酸杂交并进行检测方法称之为核酸原位杂交,特点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在载玻片上，以固定细胞代替纯化核酸，然后将载玻片浸入溶有探针溶液里，探针进入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子仍固定在细胞内。,微生物检验专题知识讲座,第20页,检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系,1.,待检菌株,DNA,双链,2.,用碱或热变性使双链解开（,DNA,变性）,3.,将单链,DNA,在硝酸纤维素膜上固定,4.,加放射性标识,DNA,或,RNA,5.,保温（普通是,66,，,24h,）进行互补碱基配对（杂交）,6.,用缓冲溶液洗脱未杂交个别,7.,测定膜放射性，计算杂交率,微生物检验专题知识讲座,第21页,关键：固定、冲洗。,杂交率,=,标识参考菌株,DNA,与待测菌株,DNA,杂交分子放射性计数,100%,标识参考菌株,DNA,与未标识参考菌株,DNA,杂交分子放射性计数,微生物检验专题知识讲座,第22页,（三）结果判断：,杂交率,75%,，高重组表示两分子差异小。,杂交率,25%,，低重组表示两分子不相关,杂交率,60%,，认为是同一个种,杂交率,6070%,，是同一个种中不一样亚种,杂交率,70%,，以上是同一亚种不一样菌株,杂交率,20%,以下，应考虑是不一样属菌株,微生物检验专题知识讲座,第23页,DNA-DNA,主要判别同一科中种属间菌株,DNA-RNA,主要判别不一样科菌株，因其,DNA-DNA,杂交率,=0,微生物检验专题知识讲座,第24页,金黄色葡萄球菌检验,金黄色葡萄球菌能产生各种与毒力和致病力相关毒素和酶,其中由,nuc,基因编码耐热核酸酶（,Thermostablenuclease,Thermonuclease),不但为金黄色葡萄球菌所特有,而且在不一样菌株之间含有较高保守性,5,。可依据已经发表金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因序列设计引物,用技术从金黄色葡萄球菌菌株中扩增基因特异片段,经生物素标识作为核酸探针,建立了斑点杂交试验,能够从试验动物及其组织中快速、敏感、特异地检测出金黄色葡萄球菌。,微生物检验专题知识讲座,第25页,探针检测技术中存在问题,1.,存在假阳性和假阴性问题。,2.DNA,探针还不能完全取得常规检验提供细菌特征信息，,3.,检测食品时，样品中待检菌量低杂质成份复杂，样品,DNA,纯度不够高等都会限制探针检测敏感性。,4.,不能检测基因序列表示产物，所以在评价食品安全卫生上存在一定不足。,微生物检验专题知识讲座,第26页,六、分子信标技术检测微生物,1996,年,Tyagi,和,Kramer,报道了一个含有发夹结构新型荧光核酸探针,分子信标,(molecularbeacon),。,微生物检验专题知识讲座,第27页,（一）基础原理,分子信标技术是基于荧光共振能量转移,(,),设计一段与特定核酸互补寡聚核苷酸探针，空间结构上呈茎环结构，其中环序列是与靶核酸互补探针；茎一端连接上一个荧光分子，另一端连上一个淬灭分子。当靶序列不存在时,分子信标呈茎环结构,茎部荧光分子与淬灭分子非常靠近,(7,10,),，可发生，即荧光分子发出荧光被淬灭分子吸收并以热形式散发，此时检测不到荧光信号；当有靶序列存在时，分子信标环序列与靶序列特异性结合，形成稳定双链体比分子信标茎环结构更稳定，荧光分子与淬灭分子分开，此时荧光分子发出荧光不能被淬灭分子吸收，可检测到荧光。,微生物检验专题知识讲座,第28页,（二）分子信标结构,(1),环状区，普通为长度,15,30,碱基序列，能与目标分子特异结合；,(2),信标茎干区，通常为长度,5,8,碱基互补序列，茎干区与杂交后环状区,-,目标分子双链结构之间热力学平衡关系，使分子信标杂交特异性显著高于常规线状探针；,(3),荧光基团和猝灭基团，荧光基团普通联接在信标分子,5-,端；,微生物检验专题知识讲座,第29页,（三）分子信标检测特点,1.,能够进行液相杂交检测,2.,有效消除核酸交叉污染,3.,可进行核酸实时检测,4.,特异性强,5.,灵敏度高,6.,可实现核酸大规模自动化检测,7.,可对活体内核酸动态进行检测,微生物检验专题知识讲座,第30页,应用,分子信标用于核酸检测分析,1.,实时定量,PCR,测定靶标浓度,2.,分子信标用于活体内核酸动态检测,3.,利用多色分子信标对多个靶核苷酸同时定量检测,4.,分子信标用于检测双链,DNA,分子信标用于研究,DNA-,蛋白质相互作用,1,分子信标用于核酸酶研究,2.,分子信标用于非特异性单链,DNA,结合蛋白研究,3.,分子信标用于蛋白质直接检测,依据分子信标原理,NobukoHama,分子信标用作生物芯片和生物传感器探针利用,微生物检验专题知识讲座,第31页,第二节,PCR,技术检测微生物,微生物检验专题知识讲座,第32页,一、,PCR,反应基础原理,聚合酶链反应,(Polymerase Chain Reaction,PCR),就是模板,DNA,、引物以及四种脱氧核糖核苷三磷酸,(dNTPs),在,DNA,聚合酶催化作用下所发生酶促聚合反应，,PCR,反应是由变性,-,退火,-,延伸三个基础反应步骤组成。,微生物检验专题知识讲座,第33页,PCR,技术简史,DNA,复制,核酸体外扩增构想,聚合酶链反应创造,1971,年，,Khorana,提出：经过,DNA,变性，与适当引物杂交，用,DNA,聚合酶延伸引物，并不停重复该过程便可克隆,tRNA,基因。,但因为测序和引物合成困难，以及,70,年代基因工程技术创造使克隆基因成为可能，所以，,Khorana,构想被大家遗忘了,微生物检验专题知识讲座,第34页,（一）,PCR,技术简史,DNA,复制,核酸体外扩增构想,聚合酶链反应创造,1985,年，美国,PE-Cetus,企业,Mullis,等人创造了聚合酶链反应（,PCR,）,基础原理是在试管中模拟细胞内,DNA,复制,最初采取,E-coli DNA,聚合酶进行,PCR,，因为该酶不耐热，使这一过程耗时，费劲，且易犯错,耐热,DNA,聚合酶应用使得,PCR,能高效率进行，随即,PE-Cetus,企业推出了第一台,PCR,自动化热循环仪,1993,年，,Mullis,等所以项技术获诺贝尔化学奖,微生物检验专题知识讲座,第35页,（二）,PCR,基础原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,特点,标准,PCR,反应体系,4,种,dNTP,混合物 各,200umol/L,引物 各,10,100pmol,模板,DNA,0,.,1,2ug,Taq DNA,聚合酶,2,.,5u,Mg,2+,1,.,5mmol/L,微生物检验专题知识讲座,第36页,基础步骤,1,、变性,(Denaturation),模板双链,DNA,加热至,94,左右一定时间后，使模板,DNA,双链或经,PCR,扩增形成,DNA,双链两条链碱基对之间氢键破裂，双螺旋解开，使之成为单链，方便它与引物结合，为下轮反应作准备,这一过程咱们称之为变性。,微生物检验专题知识讲座,第37页,2,、退火,(Annealing),模板,DNA,经加热变性成单链后，当温度降至,55,左右，引物与模板,DNA,单链互补序列配对结合；咱们把这一过程称之为退火。,微生物检验专题知识讲座,第38页,3,、延伸,(Extension),在适宜温度下，,DNA,模板,-,引物结合物在,TaqDNA,聚合酶作用下，以,dNTPs,为反应原料，靶序列为模板，发生酶促聚合反应，咱们把这一过程称之为延伸。延伸时是按照碱基互补配正确标准与，从而合成了一条新与模板,DNA,链互补半保留复制链。,微生物检验专题知识讲座,第39页,所以重复循环变性,-,退火,-,延伸这三个过程，就可取得更多“半保留复制链”，而且这些新合成链又能够成为下次循环模板。,PCR,反应最终结果是，经过,n,次循环之后，反应混合物中所含有双链,DNA,分子数，即两条引物结合位点之间,DNA,区段拷贝数，在理论上最高值应该是,2n,。而每完成一次循环大约需要,2,4,分钟，所以，,2,3,小时就能将待扩增目标基因扩增放大几百万倍。,微生物检验专题知识讲座,第40页,微生物检验专题知识讲座,第41页,（三）,PCR,特点,PR,反应条件,PCR,过程,PCR,特点,特异性强,1.,引物与模板,DNA,特异、正确结合；,2.,碱基配对标准；（,A,和,T,G,和,C,配对）,3.Taq DNA,聚合酶合成反应忠实性；,4.,靶基因特异性与保守性。,灵敏度高,皮克,(pg=10,-12,),量级扩增到微克,(ug=10,-6,),水平,能从,100,万个细胞中检出一个靶细胞,病毒检测灵敏度可达,3,个,RFU,细菌检测最小检出率为,3,个细菌,简便、快速,一次性加好反应液，,2,4,小时完成扩增,扩增产物普通用电泳分析,微生物检验专题知识讲座,第42页,（三）,PCR,特点,PR,反应条件,PCR,过程,PCR,特点,能够扩增,RNA,或,cDNA,用一小段寡核苷酸引物和逆转录酶将,mRNA,逆转录成主链,cDNA,，再将得到,cDNA,进行,PCR,扩增,对标本纯度要求低,血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织粗提,DNA,PCR,技术含有一定程度错误渗透,核苷酸错误渗透几率大约是每,2109,个核苷酸中错误渗透一个核苷酸,微生物检验专题知识讲座,第43页,PCR,反应应用,1,、在法医判定上应用；,2,、在亲子判定上应用；,3,、在古生物学中应用；,4,、在生态学研究中应用；,5,、在食品中有害微生物检测应用,微生物检验专题知识讲座,第44页,二、,PCR,反应体系,一个标准,PCR,反应反应体系为：,10,扩增缓冲液,10uL4,种,dNTP,混合物,200umol/L,引物,1umol/L,模板,DNA,0.1,2ug,Taq DNA,聚合酶,2.5u,Mg,2+,1.5mmol/L,加双或三蒸水至,100uL,PCR,反应体系五个要素：,PCR,扩增所需引物（,primer,）、,Taq DNA,聚合酶（,Taq DNA polymerase,）、,4,种,dNTP,混合物（,dNTPs,）（,dATP,dGTP,dCTP,dTTP,）、模板（,template,）和缓冲液。,微生物检验专题知识讲座,第45页,（一）引物,PCR,扩增引物是指与待扩增靶,DNA,区段两端序列互补人工合成寡核苷酸短片段。包含正向引物（,Forward Primer,）和反向引物（,Backward Primer/Reverse Primer,）。,（,1,）引物设计软件和引物合成,能够在线设计引物，比如,etPrimer,；也能够使用,Primer Premier 5.0,和,Oligo 6.22,、,DNAMAN,等设计软件。,设计好引物则完全由专业引物合成企业来进行合成。,微生物检验专题知识讲座,第46页,（,2,）引物设计标准,1,）引物长度（,primer length,）,2,）产物长度（,product length,）,3,）引物及产物,GC,含量（,composition,）,4,）序列,T,m,值,(melting temperature),5,）,G,值,(internal stability),6,）引物二聚体及发夹结构（,duplex formation and hairpin,）,7,）错误引发位点（,false priming site,）,8,）对引物进行修饰，比如在引物,5,末端添加限制性酶切位点,9,）有时候，在设计引物时仅了解有限序列信息。比如仅知道氨基酸序列，这时咱们能够设计简并引物。,10),引物特异性：设计好引物应该含有很好特异性即设计出引物应与核酸序列数据库中其它序列无显著同源性。,微生物检验专题知识讲座,第47页,（二）,Taq DNA,聚合酶,TaqDNA,聚合酶发觉是促进反应自动化一个关键原因。,在,PCR,反应体系中用热稳定性,Taq DNA,聚合酶代替,DNA,聚合酶,Klenow,大片段,当前主要有两种,Taq DNA,聚合酶供给，一个是从栖热水生杆菌中分离提纯天然酶，另一个是大肠杆菌合成基因工程酶。,催化一个经典,PCR,反应，普通加入酶量为,2-4U,，通常约需加入酶量为,2.5U(,指总反应体系体积为,100ul,时,),，,微生物检验专题知识讲座,第48页,（三）,dNTP,PCR,反应体系中需要,4,种脱氧核苷三磷酸（,dNTPs,）包含：脱氧腺苷三磷酸（,dATP,）、脱氧胞苷三磷酸（,dCTP,）、脱氧鸟苷三磷酸（,dGTP,）、脱氧核糖胸腺嘧啶三磷酸（,dTTP,）。它们提供靶,DNA,序列扩增原料。,在,PCR,反应中，,dNTPs,浓度普通为,50,200umol/L,，高浓度,dNTPs,会对扩增反应起抑制作用，浓度过低又会降低,PCR,产物产量。需要注意是,4,种,dNTP,浓度要相等,(,等摩尔配制,),。,微生物检验专题知识讲座,第49页,（四）缓冲液,在,PCR,反应体系中，普通提议用,10-50mmol/LTris-HCL,作为缓冲液（,20,时，,pH,值为,8.3-8.8,）。,反应体系中镁离子（,Mg,2+,）浓度对,PCR,反应影响：影响,DNA,聚合酶活性；影响引物退火,普通来说，当游离镁离子浓度较高时，能够增加,PCR,反应产量，不过同时也会增加非特异性扩增几率，降低,PCR,反应特异性；反之，当游离镁离子浓度较低时，会降低,PCR,反应产量。,微生物检验专题知识讲座,第50页,（五）模板,模板制备是,PCR,反应起始步骤,几个常见纯化方法,(1).,浓盐法 利用,RNP,（核糖核蛋白）和,DNP,（脱氧核糖核蛋白）在电解溶液中溶解度不一样，将二者分离，,微生物检验专题知识讲座,第51页,（,2,）,.,阴离子去污剂法,:,用,SDS,或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,能够直接从生物材料中提取,DNA.,因为细胞中,DNA,与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常见阴离子去污剂提取,DNA.,（,3,）,.,苯酚抽提法,:,苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了,DNase,降解作用,.,用苯酚处理匀浆液时,因为蛋白与,DNA,联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相同相溶。蛋白分子溶于酚相，而,DNA,溶于水相。离心分层后取出水层，屡次重复操作，再合并含,DNA,水相，利用核酸不溶于醇性质，用乙醇沉淀,DNA,。此时,DNA,是十分粘稠物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法特点是使提取,DNA,保持天然状态,.,（,4,）,.,水抽提法,:,利用核酸溶解于水性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去,RNA,，然后将沉淀溶于水中，使,DNA,充分溶解于水中,离心后搜集上清液,.,在上清中加入固体氯化钠调整至,2.6M.,加入,2,倍体积,95%,乙醇,马上用搅拌法搅出,.,然后分别用,66%,80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最终在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取DNA中蛋白质含量较高,故普通不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.,微生物检验专题知识讲座,第52页,三、,PCR,反应参数,（一）变性,经典变性条件是在,95,温度下,30s,。,变性步骤应该高温、短时。,假如变性温度过高、时间过长，会加紧,DNA,聚合酶失活；变性温度很低，会造成解链不完全。,微生物检验专题知识讲座,第53页,（二）退火,温度快速冷却至,40,60,，双链模板,DNA,或经,PCR,扩增形成双链,DNA,经加热变性成为单链后，引物与单链模板,DNA,互补序列配对结合,引物长度、碱基组成及其在反应体系中浓度决定了引物退火时间与温度，靶基因序列长度也与退火温度与时间相关。,复性时间,30,60,秒足以使引物与模板之间完全结合。普通退火温度设定比扩增引物熔解温度（,Tm,值）低,5,左右。,选择较高退火温度会大大降低引物二聚体和引物和模板间非特异性结合。,微生物检验专题知识讲座,第54页,（三）延伸,引物延伸温度取决于,DNA,聚合酶最适温度。,PCR,反应延伸温度普通选择在,70,75,之间，常见温度为,72,，此靠近于,Taq DNA,聚合酶最适反应温度,75,。,延伸反应时间则取决于待扩增片段长度、浓度和延伸温度。,延伸反应时间则取决于待扩增片段长度、浓度和延伸温度。,延伸时间越长，非特异性扩增带出现机率就越大。,微生物检验专题知识讲座,第55页,（四）,PCR,循环次数,PCR,反应扩增程度由循环次数决定。当,PCR,反应其它各项参数都确定之后,PCR,反应循环次数主要取决于模板,DNA,起始浓度。,靶分子数 适宜循环次数,310,5,25-30 1.510,4,30-35 110,3,35-40 50 40-45,微生物检验专题知识讲座,第56页,普通而言，,PCR,适宜循环次数为,25-30,轮。循环次数过多,会使,PCR,产物中非特异性扩增产物大量增加；循环次数过少，会降低,PCR,扩增产量。,微生物检验专题知识讲座,第57页,四、,PCR,扩增产物判定,（一）琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭（,EB,）在紫外光照射下能发射出荧光，当,DNA,样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中溴化乙锭（,EB,）就会插入到,DNA,分子中形成荧光络合物，从而使,DNA,分子发射荧光比最初增强了好几倍。因为,DNA,分子发射荧光强度和样品中,DNA,含量是成正比，所以当用已知浓度标准样品作为琼脂糖凝胶电泳对照时，就能够比较出待测样品浓度。,微生物检验专题知识讲座,第58页,汇报结果,依据引物位置可知目标扩增产物大小为,279bp,，所以咱们能够依据,PCR,扩增产物在琼脂糖凝胶上是否形成,279bp,条带来判断扩增是否发生。假如,PCR,扩增产物在琼脂糖凝胶,279bp,位置有条带，证实乳品中有金黄色葡萄球菌存在。（以下列图）图中最右边为,DNA Marker DL,，然后从右往左依次为阳性对照。阴性对照和扩增产物。假如,PCR,扩增产物在琼脂糖凝胶,279bp,位置处没有形成条带，就证实检测乳品中不存在金黄色葡萄球菌。,279bp,微生物检验专题知识讲座,第59页,（二）免疫检测,免疫检测方法是一个,ELISA,方法，它能快速、灵敏和特异地检测,PCR,产物。,基础原理：,SHARP,信号系统是指首先用一个用生物素修饰引物和一个非修饰引物进行,PCR,扩增。扩增结束后，让一个别反应混合物在变性剂作用下先变性，然后在溶液中加入能与之互补配正确非标识,RNA,探针进行杂交，得到,RNA,：,DNA,杂合体。然后用捕捉板对生物素化,RNA,：,DNA,杂合体进行捕捉。最终用对生物素化,RNA,：,DNA,杂合体特异结合碱性磷酸酯酶抗体进行检测，读取在,405nm,时吸光度。,微生物检验专题知识讲座,第60页,准备探针混合物,取,50l,样品稀释液加到杂交管中,在每个杂交管中加入,25l,变性剂,取,5l,样品或对照加到每个管中，,1000r/min,摇,30,秒,室温孵育,10,分钟,取,25l,探针混合物加到每个管中,室温摇,30,秒,65,水浴温育,30,分钟,从杂交管转移到捕捉板微孔中,捕捉板在,25,摇,30,分钟（准备洗涤缓冲液）,倒掉捕捉板中液体并用吸水纸吸干，然后在每个微孔中加,100l,检测试剂,盖上捕捉板，并在,25,摇,30,分钟,倒掉捕捉板中液体，并用洗涤缓冲液冲洗捕捉板,5,次，再用去离子水冲洗捕捉板,1,次,在捕捉板每个微孔中加,100l,底物，盖上捕捉板，并在,37,孵育,1,小时,在,405nm,读取吸光度,图,7-5 SHARP,信号系统检测基础步骤,微生物检验专题知识讲座,第61页,1,）不对称,PCR,目标：扩增产生特异长度单链,DNA,。,方法：采取两种不一样浓度引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最正确百分比普通是,0.010.5M,关键是限制性引物绝对量。,用途：制备核酸序列测定模板,制备杂交探针,基因组,DNA,结构功效研究,PCR,种类,微生物检验专题知识讲座,第62页,2),反向,PCR(reverse PCR),是用反向互补引物来扩增两引物以外,DNA,片段对某个已知,DNA,片段两侧未知序列进行扩增。,可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知,DNA,片段序列；用于仅知个别序列全长,cDNA,克隆,扩增基因文库插入,DNA,；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,PCR,种类,微生物检验专题知识讲座,第63页,3,）多重,PCR,用于检测特定基因序列存在或缺失。,电泳,引物,微生物检验专题知识讲座,第64页,4,）,LP-PCR,（,Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标识，用以直观地检测目标基因。,尤其适合大量临床标本基因诊疗,可同时检测各种基因成份,病毒,1,病毒,2,病毒,3,病毒,4,微生物检验专题知识讲座,第65页,7,）原位,原位聚合酶链式反应（,In Still PCR,，,Is,PCR,）是由,Haase,等于,1990,年首创。它是利用完整细胞作为一个微小反应体系来扩增细胞内目标片段，在不破坏细胞前提下，利用一些特定检测伎俩来检测细胞内扩增产物。,直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。,适合用于检测病理切片中含量较少靶序列,微生物检验专题知识讲座,第66页,8,）,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR,扩增,微生物检验专题知识讲座,第67页,实时,PCR,技术原理,微生物检验专题知识讲座,第68页,应用,PCR,技术检测乳品中金黄色葡萄球菌,试验器材及试剂,1,、试验器材：,PCR,仪，电泳仪，凝胶成像系统,2,、试验试剂,:10PCR buffer,、,dNTPs,、,TaKaRa Taq,、,DNA Marker DL.,溶葡萄球菌酶、无水乙醇、石油醚、氯仿、氨水、糖原、引物,（正向引物,5-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3,，,反向引物,5-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3,）。,操作步骤,利用,PCR,技术从乳品中直接检测金黄色葡萄球菌，其操作方法以下。,微生物检验专题知识讲座,第69页,1,、,DNA,模板制备,详细步骤以下：,（,1,）、将,1ml,无水乙醇、,1 ml,氨水和,1 ml,石油醚分别加入到,5 ml,待检测乳品中，并混匀。,（,2,）、混合物以,12 000 g,，离心,10 min,。弃去上清液，沉淀用,300 ul10 mmo1L-1TE(pH7.8),溶解后，加入,5 ul 10 mg.ml-1,溶葡萄球菌酶，,37,温育,1 h,期间不停猛烈振荡。然后加入,50 ul 10%,SDS,煮沸,5min,。,（,3,）、将等体积氯仿加入上述混合液中，充分振荡混匀，,17 000 g,离心,10 min,，弃沉淀，保留上清液。,(4),将上清液移入一新离心管中，用,0.1,倍体积,2.5 mo1.L-1,乙酸铵,(pH 5.4),，,2.5,倍体积预冷无水乙醇和,5 ul 10 mg.ml-1,糖原沉淀,DNA,混合物,17 000g,，离心,20 min,。,DNA,沉淀干燥后用,100 ul,灭菌双蒸水溶解，备用。,微生物检验专题知识讲座,第70页,2,、配置反应体系,总反应体系为,50 ul,，其中包含,5 ul10PCR buffer,、,4 ul dNTPs,混合物，,0.5 ul40umol,正向引物，,0.5 ul40umol,反向引物，,0.25 ul,（,5U/ul,）,Taq,，模板,2 ul,，水,37.75 ul,。,微生物检验专题知识讲座,第71页,3,、,PCR,扩增,PCR,扩增反应采取冷开启。,94,预变性,4min,，再按,941min520.5min721.5min,进行,35,个循环，最终,72,延伸,3.5min.,4,、,PCR,扩增产物检测,取,5 ulPCR,产物在,2%,琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝胶成像系统观察结果并成像。,微生物检验专题知识讲座,第72页,汇报结果,依据引物位置可知目标扩增产物大小为,279bp,，所以咱们能够依据,PCR,扩增产物在琼脂糖凝胶上是否形成,279bp,条带来判断扩增是否发生。假如,PCR,扩增产物在琼脂糖凝胶,279bp,位置有条带，证实乳品中有金黄色葡萄球菌存在。（以下列图）图中最右边为,DNA Marker DL,，然后从右往左依次为阳性对照。阴性对照和扩增产物。假如,PCR,扩增产物在琼脂糖凝胶,279bp,位置处没有形成条带，就证实检测乳品中不存在金黄色葡萄球菌。,279bp,微生物检验专题知识讲座,第73页,第三节 环介导等温扩增技术,环介导等温扩增技术（,Loop-mediated Isothermal Amplification,，简称,LAMP,），是,年由日本荣研株式会,Notomi,等人开发出来，该方法一经报道就受到各国学者广泛关注。,我国对,LAMP,法研究起步相对较晚，,年，北京奶牛中心首次引用,LAMP,法进行牛胚胎性别判定。,年新疆农业大学吴阳升等人应用,LAMP,法对牛胚胎性别进行判定。,年广州中医药大学李青雅等人采取,LAMP,法检测乙型肝炎病毒（,HBV-DNA,）。,微生物检验专题知识讲座,第74页,LAMP,法特点,1.,不需要特殊试剂，不需要预先进行双链,DNA,变性。,只需要保持一个恒定温度就能扩增反应,2.,特异性强。,LAMP,反应是针对模板六个区段，设计四条引物，而且这六个区段次序也有要求。,3,、能够快速、高效地进行扩增,4,、灵敏度高，,扩增模板可达,10,拷贝亦或更少。,5,、扩增,RNA,只要在,DNA,基因扩增试剂基础上加上逆转录酶，就能够一步实现,RNA,扩增。,6,、判定简便。,7,、经济性强。,微生物检验专题知识讲座,第75页,LAMP,法引物,四条引物分别是：,引物,FIP,（,Forward Inner Primer,正向内引物）：它是由,F2,区段（与靶基因,3,端,F2c,区段完全互补）和,F1c,区段（与靶基因,3,端,F1c,序列完全相同）组成。其中,F2,区段位于,FIP,3,端，而,F1c,区段位于,FIP,5,端。,引物,F3,（,Forward outer Primer,正向外引物）：它是由,F3,区段组成。（与靶基因,3,端,F3c,区段完全互补）。,引物,BIP,（,Backward Inner Primer,反向内引物）：它是由,B2,区段（与靶基因,3,端,B2c,区段完全互补）和,B1c,区段（与靶基因,3,端,B1c,序列完全相同）组成。其中,B2,区段位于,BIP,3,端，而,B1c,区段位于,BIP,5,端。,引物,B3,（,Backward outer Primer,反向外引物）：它是由,B3,区段组成。（与靶基因,3,端,B3c,区段完全互补）。,微生物检验专题知识讲座,第76页,LAMP,法基础原理,第一步：在,65,左右，模板,DNA,双链处于动态平衡状态，此时正向内引物,FIP,F2,区段和目标序列上,F2c,互补配对，并在链置换型,DNA,聚合酶（,Bst DNA polymerase,）作用下，以,F2,区段,3,末端为起点，开启链置换,DNA,合成。,微生物检验专题知识讲座,第77页,第二步：以正向内引物,FIP,F2,区段,3,端为起点，经过含有链置换活性,DNA,聚合酶作用，合成了模板,DNA,互补链。,微生物检验专题知识讲座,第78页,第三步：正向外引物,F3,与目标序列,F2c,前端,F3c,序列互补，以,F3,3,末端为起点，经过链置换型,DNA,聚合酶作用，一边置换先头由引物,FIP,合成,DNA,链，一边合成本身,DNA,链，如此向前延伸。,微生物检验专题知识讲座,第79页,第四步：最终由引物,F3,合成,DNA,链与模板,DNA,形成双链。,微生物检验专题知识讲座,第80页,第五步：由引物,FIP,先合成,DNA,链被引物,F3,进行链置换反应，从而产生一条单链，这条单链,5,末端存在互补,F1c,和,F1,区段。,微生物检验专题知识讲座,第81页,第六步：,5,末端互补,F1c,和,F1,区段，会发生本身碱基互补配对，形成环状结构。同时，反向内引物,BIP,同该单链杂交结合，以引物,BIP,B2,区段,3,端为起点，合成互补链，在此过程中环状结构被打开，接着，类似于引物,F3,，反向外引物,B3,从引物,BIP,外侧插入，与,B3c,序列互补。,微生物检验专题知识讲座,第82页,第七步：以,B3,3,末端为起点，经过链置换型,DNA,聚合酶作用，一边置换先头由引物,BIP,合成,DNA,链，一边合成本身,DNA,链，如此向前延伸。最终由引物,B3,合成,DNA,链形成双链。,微生物检验专题知识讲座,第83页,第八步：由引物,BIP,先合成,DNA,链被引物,B3,进行链置换反应，产生一条单链，这条单链,DNA,两端存在互补序列。本身发生碱基互补配对，形成环状结构，于是整条链展现哑铃状结构。该哑铃状结构是,LAMP,法核酸扩增起始结构。至此为止，以上全部步骤都是为了形成,LAMP,法核酸扩增起始结构。,微生物检验专题知识讲座,第84页,第九步：以下是,LAMP,法核酸扩增循环：,微生物检验专题知识讲座,第85页,LAMP,法操作流程,（,1,）反应体系配置；,（,2,）扩增；,（,3,）扩增产物检测。,微生物检验专题知识讲座,第86页,微生物检验专题知识讲座,第87页,一个标准,LAMP,反应反应体系是：,20Mm Tris-HCL(Ph=8.8)1.4mM dNTPs,10mM KCL 1.6M FIP,8mM