重症监护病房耐碳青霉烯类肺...的耐药基因型及系统进化分析_胡小骞.pdf

安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Aug，27（8）重症监护病房耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药基因型及系统进化分析胡小骞，王琴作者单位：安徽医科大学第二附属医院医院感染管理办公室，安徽 合肥230601通信作者：王琴，女，副主任医师，硕士生导师，研究方向为分子诊断学，Email：基金项目：国家自然科学基金资助项目（81902056）摘要：目的 通过分析某三甲医院重症监护病房（ICU）的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）的耐药基因及系统进化关系，为耐药菌防控的管理提供参考依据。方法 收集安徽医科大学第二附属医院 2018 年 37 月 ICU 住院病人分离的 19 株CRKP，使用VITEK-2 Compact系统进行细菌鉴定及药敏试验，应用Illumina Hiseq 2500平台进行全基因组测序（WGS），应用MLST软件测定ST型，应用Kaptive软件检测荚膜型，应用Staramr软件筛查菌株的耐药基因，应用Ridom SeqSphere+软件进行cgMLST分型及最小生成树（MST）的构建，并应用CSI Phylogeny 1.4软件及FigTree v1.4.4软件构建最大似然树（MLT），以分析其系统进化关系。结果 19株CRKP除了对替加环素敏感，对其他常用抗菌药物均呈现耐药，19株CRKP均携带blaKPC-2耐药基因，均属于ST11-KL64型，MST图中以AY7007、AY7003为中心聚集为一簇，cgMLST分型均为CT1774型，MLT图显示分为四组克隆型，组内亲缘性关系相近。结论 该院ICU分离的CRKP以ST11-KL64-CT1774型为主，并具有多重耐药性，存在医院内播散的风险。关键词：肺炎克雷伯菌；碳青霉烯类；抗药性，细菌；重症监护病房；耐药基因型；系统进化分析Analysis of the antimicrobial resistance genotype and phylogenetic evolution of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in the intensive care unitHU Xiaoqian,WANG QinAuthor Affiliation:Department of Hospital Infection Management,The Second Hospital of Anhui Medical University,Hefei,Anhui 230601,ChinaAbstract：Objective To analyze the relationship of resistance genes and phylogenetic evolution of Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae(CRKP)in the intensive care unit(ICU)of a tertiary hospital,so as to provide a reference for the management of antibiotic resistant bacteria prevention and control.Methods Nineteen strians of CRKP isolateed from ICU inpatients in the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University from March to July 2018 were collected.The VITEK-2 Compact system was used for bacterial identification and drug sensitivity test.The Illumina Hiseq 2500 platform was used for whole genome sequencing(WGS).The MLST software was used to detect the ST types of strains.The Kaptive software was used to detect the capsular types.The Staramr software was used to screen the antimicrobial resistance genes of the strains.The Ridom SeqSphere+software was used to perform cgMLST typing and construct minimum spanning tree(MST).The CSI Phylogeny 1.4 software and FigTree v1.4.4 software was used to construct a maximum likelihood tree(MLT)to analyze the phylogenetic relationships.Results In addition to being sensitive to tigecycline,nineteen strians of CRKP were resistant to other commonly used antibacterial drugs.The nineteen strians all carried the blaKPC-2 resistance gene and belonged to the ST11-KL64 type.The MST showed that nineteen strians clustered into a cluster with AY7007 and AY7003 as the center.The cgMLST types of the strains were all CT1774 types.The MLT showed that they were assigned into four groups of clonotypes,and the genetic relationships within the groups were similar.Conclusions The CRKP isolated from the ICU mainly belongs to ST11-KL64-CT1774 type.The CRKP strains have multidrug resistance,and there is a risk of spreading in the hospital.Key words：Klebsiella pneumoniae;Carbapenemes;Drug resistance,bacterial;Intensive care unit;Antimicrobial resistance genotype;Phylogenetic evolution肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）约占医院重症监护病房（intensive care unit，ICU）革兰阴性杆菌感染的15%1，是人体内呼吸道和肠道的常见定植菌，易引起免疫力低下病人呼吸道、血液、消临床医学引用本文：胡小骞，王琴.重症监护病房耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药基因型及系统进化分析 J.安徽医药，2023，27（8）：1605-1610.DOI：10.3969/j.issn.1009-6469.2023.08.025.1605网络首发时间：2023-07-06 14:55:55网络首发地址：https:/ 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Aug，27（8）化道等部位的感染。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）最初于1996年在美国的北卡罗来州被Yigit等2发现，随后传播至全球各大洲国家。由于碳青霉烯类抗生素的抗菌活性强、抗菌谱广，近年来临床治疗重症感染病人时广泛应用碳青霉烯类药物，致使CRKP逐年增加，而治疗CRKP的抗菌药物的选择有限，感染病人的死亡率较高3，国内文献报道为29.53%76.19%4，国外文献报道为42.14%5，给临床抗感染工作带来了艰巨的挑战。近年，我国CRKP的耐药形势逐渐严峻，全国细菌耐药监测网（China antimicrobial resistance surveillance system，CARSS）“20132017年的全国细菌耐药监测报告”分析显示，5年期间CRKP检出率与其他常见耐药菌的检出率相比仍处于持续上升的状态。CHINET（China antimicrobial surveillance network）统计 20052019年15年的监测数据显示KP对亚胺培南和美罗培南的耐药率呈持续上升趋势（3.0%、2.9%对25.3%、26.8%）6。本研究对某三甲医院 ICU 的 19株CRKP进行全基因组测序（whole genome sequencing，WGS），通过分析其耐药基因型、多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、核心基因组多位点序列分型（core genome multilocus sequence typing，cgMLST）、荚膜型，以及构建最小生成树（minimum spanning tree，MST）、最大似然树（maximum likelihood tree，MLT），研究该院ICU内CRKP菌株的分子生物流行病学特点，旨在指导临床合理使用抗生素，为医院感染防控措施的落实提供参考依据，遏制多重耐药菌在院内的播散。1材料与方法1.1菌株来源及药敏鉴定收集安徽医科大学第二附属医院2018年37月ICU分离的19株CRKP，排除同一病人的重复菌株。应用法国 VITEK-2 Compat全自动细菌分析系统和配套试剂GN/GN13，进行革兰阴性菌的鉴定及药敏试验。以大肠埃希菌 ATCC 25922，肺炎克雷伯菌 ATCC 700603，铜绿假单胞菌ATCC 27853，阴沟肠杆菌ATCC 700323为质控菌株，质控菌株购自国家卫健委临床检验中心。1.2仪器与试剂仪器主要为法国生物梅里埃VITEK-2 Compat全自动细菌分析系统，英国Biochrom超微量分光光度计，上海一恒科学仪器有限公司恒温培养摇床，美国 Bio-Rad电泳仪，美国 Bio-Rad凝胶成像系统。试剂主要为Oxoid公司的药敏纸片、M-H 培养基，DNA Marker D、上海生工生物工程股份有限公司的 4S Red plus 核酸染色剂、上样缓冲液，天根生化科技有限公司的细菌 DNA 提取试剂盒。1.3菌株DNA提取挑取CRKP菌株接种于LB固体培养基上，37 复苏24 h后，挑取单克隆菌落于LB液体培养基中，于37 摇菌过夜。取1 mL细菌培养液，10 000 r/min 离心 1 min，弃上清液，并用DNA提取试剂盒提取细菌DNA。1.4基因组 DNA 提取物质量控制标准取适量DNA提取产物进行琼脂糖凝胶电泳，并用超微量分光光度计检测纯度和浓度。纯度要求 OD260 OD280值于1.82.0范围内，以避免RNA干扰；DNA浓度要求数值20 g/L，并且电泳条带清晰无杂带，总量于1.02.0 g范围内。1.5细菌全基因组测序运用Illumina Hiseq 2500第二代高通量测序平台进行2100 bp Paired-End测序，主要步骤包括对细菌DNA样本进行建库、扩增测序及质控。1.6测序结果组装在Linux系统中运行SPAdes-2.0 软件将测序原始 FASTQ 结果拼接为 FASTA 文件，运 行 命 令 参 考 SPAdes-2.0 软 件 网 址 https：/ staramr 软件的 ResFinder，PointFinder和PlasmidFinder数据库，通过与数据库的耐药基因进行比对，预测菌株携带的耐药基因7。1.8MLST分型、荚膜型、cgMLST分型及MST构建、最大似然树构建应用MLST软件对CRKP基因组的7个管家基因：gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB进行比对，以检测CRKP的ST型8，CRAB菌株的荚膜型鉴定应用 Linux 系统运行 Kaptive 软件检测。应用 Ridom SeqSphere+软件进行 cgMLST 分型及MST构建，其通过将菌株基因组与www.cgMLST.org网站上的4 647个参考核心基因组进行比对，扫描基因序列间的差异，将特定等位基因类型的菌株定义为相应的CT型（complex type）编号。菌株间的比对结果被可视化以构建MST，相同CT型编号的菌株聚拢为一簇，并对每个菌株的差异等位基因数进行计数，同簇菌株间等位基因差异的阈值为15，差异的等位基因数越少表示亲缘性关系越近9。同时，依据全基因组序列的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）分 析，以AY7001号菌株序列作为参考，应用CGE的CSI Phylogeny1.4工具（网址：https：/cge.cbs.dtu.dk/services/CSIPhylogeny/）及 FigTree v1.4.4 软 件 构 建 19 株CRKP的最大似然树，按亲缘性远近分组，分析其系统进化关系。1606安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Aug，27（8）1.9统计学方法采用 WHONET 5.6软件对数据进行分析处理，计数资料以率和例数进行描述。2结果2.1CRKP 的临床资料19 株 CRKP 菌株标本来源分别为痰（16株84.21%）、腹水（1株5.26%）、血（1株5.26%）、静脉导管尖端（1株5.25%），病人性别分别 为 男 性（14 例 73.68%）、女 性（5 例 26.32%）。见表1。2.2CRKP 的药敏试验结果19 株 CRKP 对头孢菌素类、青霉素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、磺胺类等抗菌药物的耐药率均为100%，而对替加环素均敏感，耐药率为0%。见表2。2.3耐药基因分析结果19株CRKP的WGS结果显示，其共携带11种耐药基因和4种质粒，包括3种-内酰胺酶，19株（100%）携带blaKPC-2、blaTEM-1B，15株（78.95%）携带blaSHV-66；2种氨基糖苷类中，19株（100%）携带 rmtB，17株（89.47%）携带 aadA2；喹诺酮类耐药基因只有 1 种为 qnrS1，19 株（100%）均携带该基因；磺胺类耐药基因有2种，分别为19株（100%）携带的sul2，17株（89.47%）携带的sul1；19株（100%）均携带磷霉素耐药基因fosA6、四环素耐药基因 tet（A）。另外，19株（100%）CRKP均携带四种不同的质粒，包括 ColRNAI、IncFII、IncHI1B、IncR。见图1。2.4MLST 分型、荚膜型、cgMLST 分型及系统进化分析结果19 株 CRKP 的 MLST 分型结果均为ST11型，其荚膜型结果均为KL64型，初步结果显示19株CRKP具有较高亲缘性。通过 cgMLST 分型，19 株 CRKP 为一个谱型：CT1774型，同一谱型聚集为一簇，簇中心菌株与周围菌株具有115个等位基因的差异，本研究的中心菌株与周围菌株具有较近的亲缘性关系。MST图显 示 中 心 菌 株 AY7007 与 AY7002、AY7005、AY7008、AY7009、AY7010、AY7012、AY7013、AY7014、AY7016、AY7017、AY7018、AY7019的等位基因差异数为6个以内，亲缘性关系较近；中心菌株AY7003与 AY7001、AY7004、AY7010、AY7011的等位基因差异数为2个以内，亲缘性关系相近；同时，表119株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的分布情况编号AY7001AY7002AY7003AY7004AY7005AY7006AY7007AY7008AY7009AY7010AY7011AY7012AY7013AY7014AY7015AY7016AY7017AY7018AY7019性别男男男女男男女男女男女男男男男男男男女床号12818178791197131611111413151918标本来源痰腹水痰痰痰痰血痰痰痰痰痰痰痰静脉导管尖端痰痰痰痰采样时间2018/3/242018/6/92018/3/132018/4/112018/4/242018/5/42018/7/142018/4/242018/5/22018/7/32018/3/102018/6/242018/7/172018/5/42018/6/62018/5/282018/5/272018/5/212018/4/28表2耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的耐药情况抗菌药物名称头孢唑啉头孢曲松头孢他啶头孢替坦头孢吡肟哌拉西林/他唑巴坦亚胺培南厄他培南美罗培南阿米卡星庆大霉素妥布霉素环丙沙星左氧氟沙星复方新诺明替加环素耐药株数1919191919191919191919191919190耐药率/%1001001001001001001001001001001001001001001000注：横坐标 AY7001AY7019表示 19株 CRKP的编号，纵坐标表示11种耐药基因和4种质粒名称；白色色阶表示横坐标对应的菌株不携带相应纵坐标指示的耐药基因，灰色色阶表示横坐标对应的菌株携带相应纵坐标指示的耐药基因。图119株CRKP的耐药基因分布1607安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Aug，27（8）AY7006与AY7009的等位基因差异数为5，AY7015与AY7016的等位基因差异数为2，其亲缘性关系相近。见图2。19 株 CRKP 的 MLT 结果显示，AY7007 位于进化树的根部，以AY7007为进化祖先向周围进化出分支菌株，19株菌株的进化关系较近。根据分支节点上 Bootstrap 值越大该节点置信度越高的判断标准 分 为 四 组 克 隆 型，组 为 AY7001、AY7003、AY7004、AY7011，组为 AY7006、AY7009，组为AY7012、AY7018，组 为 AY7015、AY7016。见图3。3讨论CRKP的耐药机制较为复杂，主要包括产碳青霉烯酶、高产AmpC酶、膜孔蛋白的缺失、主动外排泵过度表达等。其中，产碳青霉烯酶为其主要的耐药机制，本研究中19株CRKP均携带-内酰胺类耐药基因肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶2型（-lactamase Klebsiella pneumonia carbapenemase，blaKPC-2），与碳青霉烯类抗生素亚胺培南、厄他培南、美罗培南（耐药率均为 100%）的药敏结果相一致，blaKPC-2是一种常见的碳青霉烯类药物的耐药基因，于2007年首次在中国一家医院被发现10，KPCs酶通常由质粒编码，产酶菌株仅对少数抗菌药物敏感，感染病人的死亡率较高11-12。氨基糖苷类耐药基因中，rmtB 检出率为 100%，aadA2 检出率为 89.47%，aadA2检出率小于阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素的药敏结果（耐药率100%），说明aadA2并非引起氨基糖苷类耐药的主要原因。喹诺酮类耐药基因qnrS1检出率100%与环丙沙星、左氧氟沙星的药敏结果（耐药率100%）相一致。19株CRKP均携带四环素类耐药基因tet（A）与替加环素耐药表型（耐药率0%）并不一致，说明tet（A）不是替加环素的耐药基因。tet（A）属于MFS外排泵，而RND型外排泵、AcrAB型外排泵和核糖体蛋白的突变才是导致替加环素耐药的主要机制13-14。同时，质粒在传播细菌的耐药性和毒力方面也起着关键作用15，本研究筛选出四种质粒如ColRNAI、IncFII、IncR、IncHI1B，其中，ColRNAI、IncFII、IncR为耐药性质粒，19株CRKP均携带此三种质粒，并同时存在于产KPC-2的ST11型菌株，与Yu等16的研究相符，此三种质粒可能与携带blaKPC-2耐药基因相关。IncHI1B是一种可携带耐药基因和毒力基因的结合性质粒，国外一家医院曾报道阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和弗劳地氏杆菌的IncHI1B质粒中均携带blaNDM2，该质粒可在不同菌种间进行碳青霉烯类耐药基因的水平传播17。如此严峻的耐药情况和复杂多样的耐药基因给临床抗感染治疗带来了困难，当耐药菌防控措施落实不当、医务人员手卫生依从性低、抗生素的使用不合理等情况发生时，耐药菌将在医院内、科室间进行传播流行，将会给病人带来健康和经济损失，给社会造成一定的危害。因此，有效的防控措施至关重要。本研究的19株CRKP均为ST11-KL64型，均携带blaKPC-2耐药基因。ST11已成为我国CRKP的优势克隆型，约占60%百分比18。国内有研究曾报道某院的ST11-KL47型CRKP自2016年后发生亚克隆转移为 ST11-KL64 型，系统进化树显示 ST11-KL64 型由 ST11-KL47 型祖系重组所产生。ST11-KL64型CRKP感染病人的30 d病死率高于其他型别CRKP感染病人，其高毒力表型与生物膜产生较多相关，致使该型抵抗人中性粒细胞的杀灭能力、对大蜡螟幼虫感染模型的杀灭作用均高于 ST11-KL47 型，并且调控黏液表型基因（regulator of mucoid phenotype gene A，rmpA）的 rmpA-rmpA2 共同存在于ST11-KL64型菌株亦使其毒力增强，rmpA-rmpA2基因通过毒力质粒进行亚克隆转移，而该型对于干燥环境的抵抗力较强，进一步促进其在医院内的传播19。blaKPC-2耐药基因的保守移动元件在质粒上的传播致使我国CRKP菌株的广泛流行18。因此，对于携带blaKPC-2耐药基因的ST11-KL64型CRKP进行前瞻性主动筛查，提前对感染病人进行主动干预的意义十分重要。传统的病原菌分型与溯源方法包括聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）20-21等，其中PFGE被视为同源性分析的“金标准”，但亦具有耗时长、操作难度大、批次间差异性大的缺注：基于4674个cgMLST靶位基因的序列比对生成等位基因谱，每个圆圈表示一个菌株，圆圈里的数字表示相应菌株的编号，圆圈的颜色指示CT型，亲缘性关系相近的基因型（15个等位基因差异阈值）聚拢为一簇，由粉色阴影覆盖。图219株CRKP的最小生成树1608安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Aug，27（8）点22。随着全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）技术的迅速发展，及测序成本的降低，WGS结合生物信息学分析的方法已经广泛应用于分子生物流行病学研究中，技术方法包括MLST 分型、cgMLST分型、SNP等，cgMLST分型和 SNP具有较好的分辨率、准确性、可比性、可操作性，有利于实验室间的标准化23-24。本研究同时应用 cgMLST分型和 SNP两种方法对 19株 CRKP 的亲缘性关系进行溯源。其中，基于cgMLST的Ridom SeqSphere+软件根据核心基因组等位基因的差异数目生成MST，亲缘性关系越近距离越近，并聚集为一簇。本研究 MST 图显示 19 株 CRKP 聚集为一簇 CT1774型，以AY7007、AY7003菌株为中心，向周围菌株进化播散，周围菌株与中心菌株的等位基因差异数目阈值为 15 以内，说明 19 株 CRKP 的亲缘性关系相近。同时，应用FigTree v1.4.4软件基于最大似然法的单核苷酸多态性构建MLT图25，结果显示19株菌株以AY7007为进化祖先向周围进化分支，组克隆 型 的 4 株 菌 株（AY7001、AY7003、AY7004、AY7011）分离自2018年3月10日至4月11日，组克隆型的 2 株菌株（AY7006、AY7009）分离于 2018年 5 月 2 日、5 月 4 日，组克隆型的 2 株菌株（AY7015、AY7016）分离于 2018年 5月 28日、6月 6日，这三组组间采样时间间隔较远，但组内采样时间间隔较近。组、组克隆型组内病人床位相邻，且两组病人均接受过床旁共用的纤维支气管镜检测，推测可能由于床旁物体表面、纤维支气管镜或医务人员的手等引起病人间的交叉传播。虽然，组克隆型中病人床位不相邻；组克隆型的2株菌株（AY7012、AY7018）分离于2018年5月21日、6月24日，组内采样时间间隔较远，且床位不相邻或相同，由于CRKP产生生物膜，生物膜可在医院的各类导管及医疗设备内、外表面长期存活，能保护病原菌抵抗外界环境变化26-27，故组、组克隆型仍不能排除医务人员的手或共用检查设备表面引起CRKP的传播。由于本研究是针对ICU的医院感染病例高发情况的调查，因而在菌株收集数目和标本来源方面具有一定的局限性。另外，由于目前缺乏国际通用的细菌基因组数据分析标准化流程，对于判断暴发克隆的SNP阈值缺乏统一标准，致使系统进化分析结果难以实现标准化。后续笔者将对以上不足之处进行深入研究，优化病原菌溯源分析策略，完善菌株数目及标本来源，为多重耐药菌防控工作提供更科学的数据支持。综上所述，该院 ICU的 CRKP主要耐药机制为携带 blaKPC-2 并产 KPC 酶；CRKP 分型为 ST11-KL64-CT1774型，同源相关性高，存在科内克隆性传播的风险。（本文图3见插图8-11）参考文献1 LOCKHART SR，ABRAMSON MA，BEEKMANN SE，et al.Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli causing infections in intensive care unit patients in the United States between 1993 and 2004 J.J Clin 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