栀子AP2基因家族成员鉴定及其在盐胁迫下的表达模式.pdf

收稿日期：修回日期：基金项目：福建省科技厅产学研合作项目（）；福建省科技创新领军人才专项（）。作者简介：张麒功（），女。研究方向：药用植物栽培与利用。：。通信作者邹小兴（），男，副教授，博士。研究方向：林木遗传育种与药用植物栽培。：。栀子 基因家族成员鉴定及其在盐胁迫下的表达模式张麒功，林协全，叶泽霖，徐易溱，邹双全，邹小兴（自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心 福建农林大学林学院，福建 福州）摘要：栀子耐干旱、耐瘠薄，适应性强。（乙烯反应元件结合因子）基因家族成员在调控植物胁迫中起着关键作用，分析 转录因子家族成员对探究栀子耐盐机制具有重要意义。基于全基因组数据，鉴定栀子 基因家族成员并进行理化性质和系统发育分析，明确栀子在不同浓度盐胁迫下的表达模式。结果表明：在栀子中鉴定出 个 基因家族成员，所编码蛋白平均分子质量为 ，等电点为，脂肪指数为，蛋白不稳定且亲水；蛋白二级结构以无规则卷曲（）为主，大部分定位在细胞核中，和 亚家族成员定位在细胞质中的概率较大；基因家族成员分属（个）、（个）、（个）和（个）亚家族；基因家族成员进化的主要动力是纯化选择；大部分 基因家族成员的基因复制类型属于分散复制或片段重复；基因家族成员启动区域中含有较多、和 顺式作用元件；亚家族成员类基因、和 积极响应盐胁迫，这 个基因将为栀子盐胁迫研究提供初步思路。盐胁迫试验结果表明栀子生长的土壤盐浓度应小于 。开放科学（资源服务）标识码（）关键词：栀子；转录因子；全基因组鉴定；系统发育；盐胁迫中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：（），（，）：，（）；，（），（），（）（），：；福建农林大学学报（自然科学版）第 卷 第 期 （）年 月栀子（）为茜草科（）栀子属（）植物，具有良好的经济价值和观赏价值，药用成分多达 种，主要成分栀子苷可用于抗肿瘤和抗抑郁等。栀子适应能力强，分布在全国大部分地区。本课题组成员在福建泉州和福鼎等地野外实地考察发现，栀子在沿海盐碱地生长良好，但其对盐胁迫的响应机制尚不清楚。参与植物的生长发育和非生物胁迫响应的调控，按其结构域可分为：含有 个 结构域的 家族、含有 个 结构域和 个 结构域的 家族、含有 个 结构域的 家族（结构域中第 和 位的残基分别是丙氨酸和天冬氨酸）、家族（结构域中第 和 位的残基分别是缬氨酸和谷氨酸）和 个 基因。家族可分成 组。盐胁迫下，亚家族蛋白可以提高植物的耐受性；转录因子参与调节植物的防御反应。（乙烯反应元件结合因子）广泛参与植物盐胁迫应答等生物学进程，该基因家族中的一些成员已经被证明在拟南芥（）中的过表达可增强植物对逆境的耐受性。如：大豆（）的 可以提高转基因品系对高盐和干旱的抗性；家族的（）在拟南芥中能够直接与水通道蛋白基因的启动子结合来控制植物的水平衡，其过表达可增强转基因植株的耐旱性；大豆的 受干旱和盐胁迫时表达上调，可提高植物的耐旱性；棉花（）的 为拟南芥 的同源基因，可诱导植株的盐胁迫耐受性；将菜花（）的 转入拟南芥中，可以增强拟南芥对盐和干旱的耐受性；转入拟南芥后使得拟南芥积极响应高盐度和脱水胁迫；烟草（）和番茄（）的过表达可提高植株的耐盐性；辣椒（）的 可以提高拟南芥对高浓度盐环境的耐受性；黑麻黄（）的 在盐胁迫下表达上调；的过表达增强了甘蔗（）的耐盐性；过表达小麦（）的 增强了拟南芥对干旱和盐胁迫的敏感性。盐胁迫影响植物细胞的渗透性。野生大豆（）的 在拟南芥中的过表达增强了转基因植物对碳酸氢钠的耐受性。栀子 转录因子如何响应盐胁迫需进一步研究。据此，本研究基于全基因组数据筛选栀子 基因家族成员并分析其在不同浓度盐胁迫下的表达模式，明确栀子响应盐胁迫的关键基因，旨在为栀子后续栽培和利用提供参考。材料与方法 栀子 基因家族成员鉴定及理化性质预测准备拟南芥的 蛋白序列（：，）和栀子的全基因组数据。搜索（：，）且下载栀子的（）同源蛋白序列，通过本地 程序（：）获得栀子同源蛋白序列，将以上两个蛋白序列文件合并后去重复，然后查看（：，）并删除不含 结构域的基因。预测栀子 候选基因编码蛋白的理化性质（：，）、二级结构（：？，）、亚细胞定位（：，）和信号肽（：，）。栀子 基因家族成员基因结构预测和多序列比对准备栀子基因组 文件、基因家族成员、成员的树文件、蛋白保守基序的鉴定文件（：，）和结构域的预测文件（：，），将以上文件用 软件进行可视化。采用 软件对鉴定出的栀子 候选基因序列进行多序列比对，参数均为默认值。福建农林大学学报（自然科学版）第 卷 栀子 基因家族成员系统发育树的构建准备拟南芥和栀子的 蛋白序列，利用 软件的 功能进行序列比对，值设为 ，选择泊松矫正和配对删除选项，其余参数不变，用临近相邻法（）构建系统发育树，并美化（：，）系统发育树。栀子 基因家族染色体定位及基因复制事件和物种间共线性分析基于 软件完成以下分析：利用 功能进行染色体定位；利用 和 等功能进行 及基因复制事件的分析；利用 等功能进行物种间共线性分析。使用 软件整理数据。栀子 基因家族成员启动区域顺式作用元件预测利用（：）网站和 软件预测含有 的启动区域的顺式作用元件，用 软件绘图。盐胁迫试验于 年 月 日在大棚中选择长势基本一致且健康的半年生栀子扦插苗，参考蒋海燕的方法进行盐胁迫处理。试验共设 个处理：、，每个处理重复 次。、和 处理分别用去离子水，、每天定时浇灌 次植株，每次每盆浇 ，加盐过程中尽量减少盐分的损失。于胁迫 和 时取各处理功能正常且无病害的叶片，用液氮速冻后置冰箱（）中保存，用于测定不同盐浓度下栀子叶片 基因家族成员的表达量。对试验植株定期拍照，记录不同浓度盐胁迫对栀子表型的影响。栀子 基因家族成员在不同浓度盐胁迫下表达模式的检测对“”中保存的栀子叶片进行转录组测序，获得不同浓度盐胁迫下 基因家族成员的表达量，利用 软件绘制表达量热图，分析 基因家族成员在不同浓度盐胁迫下的表达模式。结果与分析 栀子 基因家族成员的鉴定及理化性质初步鉴定了 个栀子 基因家族成员，验证并最终确定了 个，分析了该家族成员的理化性质（附件表，扫 码可见）。栀子 蛋白序列的氨基酸数量为 个；分子质量为 ，平均分子质量为 ；等电点（）为，含 个碱性蛋白（）、个中性蛋白（）、个酸性蛋白（）；脂肪指数为；不稳定性指数（）为，所有蛋白均属于不稳定蛋白（）；平均疏水性（）为，所有蛋白均为亲水性蛋白（）。蛋白二级结构中 螺旋、延伸链、转角和无规则卷曲的平均比例分别为、，表明所有 蛋白均以无规则卷曲为主。其中，、和 亚家族成员无规则卷曲的平均比例分别为、，螺旋平均比例分别为、，延伸链平均比例分别为、，转角平均比例分别为、。各亚家族成员蛋白二级结构类型数量的大小表现为：无规则卷曲螺旋延伸链转角。亚细胞定位预测表明，大部分 基因家族成员定位在细胞核中，和 亚家族成员定位在细胞质中的概率较大。和 所编码的蛋白有信号肽，其余蛋白均无信号肽。栀子 基因家族成员的基序和基因结构栀子 蛋白基序（附件图，扫 码可见）均含有高度保守的 结构域 和。利用 在线网站查看各亚家族的结构域（附件图，扫 码可见），各保守结构域分别为（）、（第 期张麒功等：栀子 基因家族成员鉴定及其在盐胁迫下的表达模式）（）和（）。栀子 基因家族成员的基序（附件图，扫 码可见）数量为 个，个 蛋白含有基序，个 蛋白含有基序。亚家族独有基序、，该亚家族同时含有基序、；亚家族含有基序、；亚家族含有基序、；亚家族含有基序、，表明不同亚家族具有相似的基序。亚家族中的 只有一个 结构域（附件图，扫 码可见）；亚家族中的类基因 独有 个结构域（、）。基因家族成员的外显子数量为 个（附件图，扫 码可见），同一个亚家族基因的外显子数量相似。亚家族含有 个外显子，亚家族含有 个外显子，亚家族含有 个外显子，亚家族含有 个外显子。基因家族成员仅类基因 和 含有 结构。栀子 基因家族成员的系统发育利用 软件构建拟南芥和栀子 基因家族成员序列的系统发育树（图），表明 个栀子 蛋白属于 类：（）、（、）、（）、（、），且无 同类基因。栀子 基因家族成员可进一步分为（个）、（个）、（个）、（个）、（个）、（个）、（个）、（个）、（个）、（个）类。表示栀子；表示拟南芥。图 栀子和拟南芥 基因家族成员的系统发育树 福建农林大学学报（自然科学版）第 卷 栀子 基因家族成员的染色体定位及进化动力对栀子 基因家族成员进行染色体定位。结果（图）显示，定位在 号染色体上的基因最多（个），定位在 号染色体上的基因最少（个）。进一步计算 对片段复制基因的 （附件表，扫 码可见），其中，对基因的 （中性进化），对基因的 （正选择），其余 对基因的（纯化选择），表明栀子 基因家族成员在进化过程中的纯化选择是主要动力。利用 软件的 功能对栀子全基因组的氨基酸序列进行自我比对，获得了 种 基因家族成员可能存在的基因复制类型（图），大部分成员的基因复制类型属于分散复制（）或片段重复（）。类（）成员中分散复制和串联重复（）的基因较多，均有 个；类成员基因复制类型属于分散复制；类成员基因复制类型可能来自全基因组重复；基因近端复制类型仅存在于和类。为了进一步分析栀子 基因家族成员的潜在进化过程，分别检测到拟南芥与栀子、栀子与水稻的知悉同源性基因数量分别为 和 个（图），表明拟南芥和水稻的同源性基因更多。亚家族基因用粉色表示；亚家族基因用绿色表示；亚家族基因用蓝色表示；亚家族基因用青色表示。图 栀子 基因家族成员的染色体定位 图 栀子 基因家族成员的基因复制类型 第 期张麒功等：栀子 基因家族成员鉴定及其在盐胁迫下的表达模式图 基因家族成员物种间染色体的共线性 栀子 基因家族成员的顺式作用元件在栀子 基因家族成员上游 处共检测到 个顺式作用元件，分属 类：生长发育相关元件（种）、激素响应元件（种）、胁迫响应元件（种）、光响应元件（种）。对每个基因的 类元件进行统计（附件图，扫 码可见），发现 亚家族基因的 和 元件个数较多，尤其类基因 有 个 元件，有 个 元件。每个元件具有各自的功能（附件表，扫 码可见）。光响应元件中最多的是 元件，用来调节光反应；激素响应元件中最多的是 元件，该元件主要参与脱落酸反应；胁迫响应元件最多的是 元件，该元件主要为厌氧诱导所必需；生长发育相关元件最多的是 元件，该元件与分生组织表达有关。不同浓度盐胁迫下栀子 基因家族成员的表达模式图 显示，栀子 基因家族成员在不同浓度盐胁迫下的表达量均较低，表明该亚家族成员对盐胁迫不敏感。随着土壤盐浓度的增加，亚家族类基因 和类基因 及 亚家族的 基因表达上调。亚家族类基因积极响应盐胁迫，、和 在低浓度、中等浓度和高浓度盐胁迫下均高度表达。随着盐浓度逐渐升高，个基因表达上调，个基因表达下调，表明大部分 基因家族成员积极响应盐胁迫。同一个亚家族既有表达上调的基因，也有表达下调的基因，表明亚家族不同成员对盐胁迫的响应具有差异性。不同浓度盐胁迫下栀子的表型变化观察不同浓度盐胁迫 时植株的变化，结果（附件图，扫 码可见）显示：中度胁迫和重度胁迫下的植株，其基部叶片均凋零，茎秆较 缺水；植株叶片从叶缘开始逐渐变黄，脉间失绿。随着盐浓度的逐渐增加，新叶的生长亦受限。据此，栀子生长的土壤盐浓度应小于 。讨论 基因家族成员调控植物各种生理和胁迫反应，植物生长发育的许多过程需要细胞间的信号传导。栀子中，仅 亚家族的 和 亚家族的 所编码的蛋白有信号肽，其余均无信号肽，这两个基因在盐胁迫下，表达量变化较小，表明这种信号肽较少且对盐胁迫不敏感。不同亚家族具有相似的基序，也各自存在独特的基序，表明栀子 基因家族成员在进化过程中，各亚家族成员的功能存在分化和功能偏差。栀子 和 亚家族第 位（）和第 位（）氨基酸基本保守，但 和 亚家族第 位氨基酸有部分被替换为 和 ，亚家族第 位氨基酸有部分也被替换为 ，这与 的研究结果一致。亚家族类基因 独有（数据库：）、（数据库：）和 等 个结构域。其中，是一类分布广泛的钙依赖性脂质结合蛋白，和 结构域参与膜运输、蛋白质之间的相互作用，甚至可能参与细胞分裂和生长；结构域的功能尚不清楚。的表达量随着盐胁迫浓度的增加而上调，表明该基因可以响应盐胁迫，还可能参与钙离子的运输。植物的进化会影响内含子的数量和分布。同一个亚家族外显子的数量相似；仅 亚家族类基因 和 含有，福建农林大学学报（自然科学版）第 卷在其他亚组的基因结构上均无内含子，这与小麦、甘蔗（）具有相同的规律。、和 分别表示用去离子水，、处理植株。图 栀子 基因家族成员在不同浓度盐胁迫下的表达量 栀子 基因家族成员在进化的过程中，通过构建栀子和拟南芥的系统发育树，发现栀子 亚家族仅有 个成员，基因数量小于拟南芥、毛白杨（）及大多数植物，该成员在栀子中的调控作用有待进一步研究，此外，栀子 基因家族不存在 同类基因。栀子 基因家族成员的复制类型大部分属于分散复制或片段重复，硬粒小麦（）也具有相同的规律。第 期张麒功等：栀子 基因家族成员鉴定及其在盐胁迫下的表达模式栀子 基因家族成员可以与启动区域的顺式作用元件结合进而调控植株的生长发育。亚家族基因 含有较多 顺式作用元件，含有较多 顺式作用元件，表明该亚家族成员主要参与光反应和脱落酸反应，但这两个基因的表达量均较低，没有积极响应盐胁迫，是否积极响应其他因素值得研究。不同浓度盐胁迫下，栀子 亚家族基因均低表达，表明该亚家族基因对盐胁迫不敏感。土壤盐浓度的增加会影响栀子新叶的生长，而 亚家族类基因 和类基因 的表达量逐渐降低，这两个基因是否调控叶片表型有待后续验证。亚家族基因 含有 个 顺式作用元件，参与胁迫响应，该基因积极响应盐胁迫，表明该顺式作用元件参与调控盐胁迫下植株的生长发育。结论栀子含有 个 基因家族成员；蛋白平均分子质量为 ，等电点为，脂肪指数为，蛋白不稳定且亲水；蛋白二级结构以无规则卷曲（）为主；大部分 基因家族成员定位在细胞核中，和 亚家族成员定位在细胞质中的概率较大；基因家族成员分属（个）、（个）、（个）和（个）亚家族；基因家族成员在进化过程中的纯化选择是主要动力；大部分 基因家族成员的复制类型属于分散复制或片段重复；基因家族成员启动区域含有较多、和 顺式作用元件；亚家族类基因、和 积极响应盐胁迫，这 个 亚家族基因将为栀子盐胁迫研究提供初步思路。栀子生长的土壤盐浓度应小于 。参考文献 ，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，：，：，福建农林大学学报（自然科学版）第 卷，（）：，（）：，（）：，（），：，：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，：蒋海燕盐胁迫下西兰花和花椰菜抗逆性比较生物灾害科学，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），：，（）：，：，（）：（责任编辑：施晓棠）第 期张麒功等：栀子 基因家族成员鉴定及其在盐胁迫下的表达模式