湛江湾抗生素抗性基因的时空分布及其影响因素_叶映仪.pdf

第 38 卷第 2 期大连海洋大学学报Vol38 No22 0 2 3 年 4 月JOUNAL OF DALIAN OCEAN UNIVESITYApr 2 0 2 3DOI:1016535/jcnkidlhyxb2022-184文章编号:2095-1388(2023)02-0291-11湛江湾抗生素抗性基因的时空分布及其影响因素叶映仪1，2，侯庆华1*，蓝东和1，张际标2(1.广东海洋大学 近海海洋变化与灾害预警实验室，广东 湛江 524088;2.广东海洋大学 化学与环境学院，广东 湛江 524088)摘要:为探究湛江湾抗生素抗性基因(antibiotic resistance gene，AGs)的时空分布特征及环境因子对其分布的潜在影响，采用实时荧光定量 PC(qPC)技术，研究了湛江湾表层沉积物中磺胺类、四环素类和氟喹诺酮类 AGs(sul1、tetQ 和 qnrS)，整合子基因(intI1)，以及 16S rNA 基因 4 个季节的丰度变化。结果表明:湛江湾表层沉积物中，AGs 各基因的平均绝对丰度均呈现冬季最高、夏季最低，而其平均相对丰度均呈现夏季最高，说明 AGs 存在明显的季节性分布特征;从站位分布来看，3 种 AGs 的平均绝对丰度均呈现出 Z21Z04Z06，而平均相对丰度均表现为 Z06Z21Z04，说明 AGs 的分布存在明显的空间分布特征;斯皮尔曼(Spearman)相关性分析显示，AGs 基因之间，以及 AGs、intI1 分别与16S rNA基因绝对丰度之间均呈显著正相关(P0.05)，intI1 与 sul1 相对丰度之间呈显著正相关(P0.05)，AGs 的绝对和相对丰度分别与四环素类和氟喹诺酮类抗生素及 Mn、Cu 等重金属存在一定程度的相关性;基因与环境因子的 DA 和 VPA 分析结果共同表明，重金属对 AGs 的时空分布具有重要贡献。研究表明，湛江湾表层沉积物中 AGs 的分布受到细菌总量、intI1、理化因子、抗生素及重金属的潜在影响，且环境因子中重金属的潜在影响最大，周围的城市、工业污水排放均是影响其季节和空间分布的潜在污染源。关键词:海湾;抗生素抗性基因;表层沉积物;时空分布中图分类号:S 913;P 735文献标志码:A自 1929 年人类发明抗生素以来1，抗生素在人类医疗及畜牧养殖等行业得到了广泛使用2，2015 年 全 球 抗 生 素 使 用 量 较 2000 年 增 长 了65%3。有研究预测，在无政策干预的情况下，2030 年全球抗生素消费量可能比 2015 年高出200%3。长期过量使用抗生素促进了细菌耐药性的产生，从而导致抗生素抗性基因(antibiotic re-sistance gene，AGs)的出现4。水生生态系统中的抗生素通过河流和小溪等途径进入到河口和海湾，进而导致抗生素和 AGs 在河口和海湾的污染4-5。释放到这些环境中的抗生素通过多种途径不断地传播、扩散和积累，给近海生态、海洋资源利用及人类健康带来了严重威胁6。因此，研究AGs 在环境中的分布及其影响机制，对于环境治理及生态风险的预防具有极其重要的意义。有关抗生素和 AGs 在河口、海湾和近海海洋环境中的分布状况已有报道5，7。对海湾中 AGs的研究包括澳大利亚的菲利普港湾8，以及中国的渤海海湾(辽州湾、渤海湾和莱州湾)9-10 及东海海湾(杭州湾、香山湾和台州湾)7 等。研究显示，生活污水、工业废水和养殖废水的排放，导致了海湾理化因子、抗生素和重金属等污染物的变化，影响了海湾 AGs 的分布7，9-11。目前，对AGs 的研究主要集中在海湾中的空间分布特征，对其时间尺度(如 4 个季节的变化)上的分布特征，仅见 Guo 等12 对长江河口环境进行了相关研究，而有关海湾中 AGs 4 个季节的变化特征及其影响因素尚缺乏相关研究。本研究中，对湛江湾的重金属、抗生素和环境理化因子等指标进行了测定，采用实时荧光定量PC(qPC)方法，对四环素类、磺胺类和氟喹诺酮类 AGs 在湛江湾表层沉积物中的时空分布特征进行了分析，同步检测可移动遗传元件的一类整合子基因(intI1)作为 AGs 水平转移的指示剂，并结合重金属、抗生素和环境理化因子等指标，探讨了自然环境和人为污染对海湾 AGs 季节分布的潜在影响，以期为 AGs 在海湾环境中的风险评估及控制提供科学依据。收稿日期:2022-06-06基金项目:广东省重点领域研发计划项目(2020B1111020004)作者简介:叶映仪(1998)，女，硕士研究生。E-mail:yeyingyi0506 通信作者:侯庆华(1979)，女，博士，副教授。E-mail:huaqingh 1材料与方法1.1研究区域和样品采集分别于 2017 年 4 月(春)、8 月(夏)、11 月(秋)及2018 年1 月(冬)在湛江湾海域(1094011058E，20132157N)的 3 个代表性站位采集表层沉积物样品(图 1)。湛江湾属于半封闭海湾，海水流动交换较缓慢13。其中，Z04 站位设置在接近湛江市霞山区附近的排污口，用以表征城市生活污水区域;Z21 站位设置在东海岛上的湛江宝钢钢铁厂的排污口，用于表征工业污水区域;Z06 站位则是远离污水口的站位，用以表征远离污水污染区域，将其作为对照站位。使用抓取式采样器采集各站位表层沉积物(03 cm)，立即收集到无菌塑封袋中，4 低温下贮存并快速运输到实验室。用于后续基因丰度检测的样品使用 5 mL 冻存管贮存于80 超低温冰箱中，其余样品在20 下保存用于后续理化性质分析。本图基于自然资源部标准地图服务网站 GS(2019)3266 号标准地图为底图，底图边界无修改。The figure is based on the standard map GS(2019)3266 in theStandard Map Service website of Ministry of Natural esources of thePeoples epublic of China，with no modifications of the boundariesin the standard map图 1湛江湾采样站位图Fig.1Sampling sites in the Zhanjiang Bay1.2方法1.2.1环境理化因子检测温度和 pH 的测定在采样时现场测定，使用 pH 计(雷磁，上海仪电科学)测定 pH，使用温度计(雷磁，上海仪电科学)测定沉积物的温度。将适量沉积物装入离心管中，以 12 000 r/min 离心后收集孔隙水，并使用 WYY-盐度计测定盐度。采用碘量滴定法测定沉积物上覆水的溶解氧(DO)含量。参照 土壤农化分析14 中的方法，用 2 mol/L 的 KCl 恒温振荡浸提沉积物样品，离心收集上清液，再用聚醚砜针式滤头(13 mm，0.45 m，安普，上海)进行过滤，采用连续流动分析仪(Skalar Analytical B.V SAN+)测定滤液中的营养盐含量(NH+4-N、NO3-N)。1.2.2抗生素检测选取中国近海环境中检出频率较高的四环素类、磺胺类和氟喹诺酮类抗生素进行湛江湾抗生素季节分布特征的分析15。其中，四环 素 类 的 代 表 包 括 土 霉 素(oxytetracycline，OTC)和四环素(tetracycline，TC)，磺胺类的代表包括磺胺嘧啶(sulfadiazine，SD)和磺胺甲基异恶唑(sulfamethoxazole，SMX)，氟喹诺酮类的代表包括诺氟沙星(norfloxacin，NFC)、环丙沙星(ciprofloxacin，CFC)和 氧 氟 沙 星(ofloxacin，OFC)。所有沉积物样品均送至中国广州分析测试中心进行抗生素检测，具体过程:取适量沉积物样品，加入适量乙腈-磷酸缓冲液(体积比为 1 1)，涡旋超声后，离心取上清液过滤，随后采用超高效液相 色 谱 串 联 质 谱 方 法(LC-MS/MS，Agilent1290，US)，对上述 7 种抗生素进行检测。1.2.3重金属检测选取近海沉积物中出现频率较高的重金属16，结合前期研究对湛江湾重金属的检测结果17，对湛江湾表层沉积物中 9 类重金属总浓度进行检测，包括铬(Cr)、铜(Cu)、锌(Zn)、镉(Cd)、铅(Pb)、锰(Mn)、镍(Ni)、砷(As)和汞(Hg)。所有沉积物样品均送至广东海洋大学分析测试中心进行检测，具体过程:沉积物样品经冷冻干燥后研磨，过孔径为 120 m 的筛，利用安东帕微波消解仪(Multiwave PO 41HVT56)，在室温下用盐酸与硝酸混合溶液对样品进行微波消解后，过滤、定容，用电感耦合等离子体质谱法(HY/T 147.22013/6)，在电感耦合等离子体质谱仪(安捷伦，7500Cx)上分别测定提取液中 Cr、Cu、Zn、Cd、Pb、Mn、Ni 和 As 8 种重金属的总浓度;采用原子荧光法(GB 17378.52007/5.1)，在金索坤 SK-锐析 AFS 双道原子荧光光谱仪上检测 Hg 浓度。1.2.4DNA 提取与目的基因的 qPC 定量检测称取 0.25 g 表层沉积物样品，用 PowerSoilDNAIsolation Kit(MoBio Laboratories，Carls bad，CA)对每个样品的总 DNA 进行提取。使用 Nano VueTMPlus 微量分析仪(GE Healthcare Life S，UK)测定DNA 的浓度，DNA 的 OD260 nm/OD280 nm值为 1.8 2.0 时，方可进行下一步试验。选取四环素类抗性基因(tetQ)、磺胺类抗性基因(sul1)、喹诺酮抗性基因(qnrS)、整合子基因(intI1)和总细菌292大连海洋大学学报第 38 卷16S rNA 作为目标基因，各基因的引物和退火温度见表 1。qPC 反应体系配制和反应程序设置参照 Guo 等12 使用的方法。表 1目的基因的 qPC 引物序列Tab.1qPC primer sequences of target genes基因gene引物序列(5-3)primer sequence(5-3)长度/bpsize退火温度/annealingtemperature参考文献reference16S rNAF:ACGGTCCAGACTCCTACGGG:TTA CCGCGGCTGCTGGCAC17956.5West 等18 sul1F:CGCACCGGAAACATCGCTGCAC:TGAAGTTCCGCCGCAAGGCTCG16356Pei 等19 tetQF:AGAATCTGCTGTTTGCCAGTG:CGGAGTGTCAATGATATTGCA16955Aminov 等20 qnrSF:GTGAGTAATCGTATGTACTTTTG:AAACACCTCGACTTAAGTCT16960Guillard 等21 intI1F:CAGTGGACATAAGCCTGTTC:CCCGAGGCATAGACTGTA16056Koeleman 等22 通过对目标基因进行 PC 扩增后构建质粒，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。对测序正确的质粒按照 10 倍梯度稀释构建质粒标准曲线，所有目的基因的标准曲线结果均满足 20.99，扩增效率在 90%100%，达到试验质量标准。根据标准曲线和质粒浓度计算出基因绝对丰度拷贝数。为了消除生物量的影响，通过16S rNA基因将 AGs 和 intI1 的绝对丰度标准化19，通过计算各个基因与 16S rNA 基因拷贝数的比值得到基因相对丰度。1.3数据处理采用 IBM SPSS Statistics 25 软件进行单因素方差分析，显著性水平设为 0.05，探讨 AGs 之间及其与环境理化因子、抗生素和重金属之间的相关性。采用 Ocean Data View 5.3 软件绘制站位图，采用 OriginPro 2021 软件绘制基因丰度柱状图和相关性热图，采用 Canoco 5 软件进行 DA 分析，采用美吉生物云工具进行 VPA 分析。2结果与分析2.1湛江湾表层沉积物中环境因子的时空分布对湛江湾表层沉积物的 6 种理化因子检测显示:温度、盐度、pH 和溶解氧的季节变化较明显，但站位变化不显著，在春、夏季温度和 pH 较高，盐度和溶解氧较低;铵盐的站位变化较明显，在Z04 站位的平均浓度高于 Z06 和 Z21 站位，硝酸盐的平均浓度在春季最高、夏季最低，最高浓度出现在春季 Z04 站位(表 2)。对沉积物样品中三大类共 7 种抗生素的时空分布特征分析显示:磺胺甲基异恶唑和氧氟沙星在所有样品中均检出，磺胺嘧啶在所有样品中均未检出，其余抗生素在部分样品中检出;在已检出的样品中，平均浓度最高的抗生素类型为氟喹诺酮类，其次为四环素类，磺胺类平均浓度最低;结合站位和季节变化来看，三类抗生素的最高浓度均出现在冬季 Z04 站位，且四环素类和氟喹诺酮类的平均浓度季节变化均为冬季最高、夏季最低(表 2)。对沉积物样品中的重金属分析显示:在所有样品中均检出 9 种重金属，其中 Mn 是 4 个季节中平均浓度最高的重金属;从季节变化上看，大部分重金属的平均浓度在夏季达到最低值;从站位变化上看，大部分重金属平均浓度在 Z04 站位最高，在Z21 站位最低(表 3)。表 2湛江湾表层沉积物中理化因子与抗生素 4 个季节的检测值Tab.2Detection values of physicochemical factors and antibiotics in surface sediments of Zhanjiang Bay in four seasons季节season站位station温度/temperature盐度salinity酸碱度pH溶解氧/(mg L1)DO铵盐/(mg kg1)ammonium硝酸盐/(mg kg1)nitrate土霉素/(ng g1)OTC四环素/(ng g1)TC磺胺甲基异恶唑/(ng g1)SMX诺氟沙星/(ng g1)NFC环丙沙星/(ng g1)CFC氧氟沙星/(ng g1)OFCZ0423.980.00 22.00.0 8.000.00 6.320.05 2.930.060.850.02 1.200.13 0.160.010.310.020.380.01 0.200.01 0.500.03春季springZ0624.010.00 25.00.0 7.990.01 6.850.03 1.800.020.380.03NN0.220.010.240.01N0.430.01Z2124.460.00 29.00.0 8.020.00 6.950.08 2.860.050.360.02 0.140.02N0.120.010.190.01 0.220.01 0.230.01Z0430.450.00 22.00.0 7.870.01 6.640.02 2.730.020.060.00 0.250.01N0.320.030.260.02N0.480.02夏季summerZ0630.250.00 26.90.0 7.860.00 6.010.01 3.190.070.080.00N0.100.010.280.010.170.02N0.380.01Z2132.040.00 27.00.0 7.980.00 5.970.04 1.750.010.080.01NN0.240.01NN0.260.02Z0422.500.00 28.80.0 6.360.00 7.150.07 2.360.030.250.01 0.680.03 0.130.020.120.011.300.24 0.510.03 1.000.05秋季autumnZ0619.900.00 27.00.0 6.030.01 7.670.01 1.270.020.460.02 0.110.01N0.380.020.200.01N0.380.01Z2121.300.00 29.30.0 6.290.01 7.780.11 2.030.040.150.01 0.110.01 0.100.010.180.000.130.01 0.170.02 0.250.01Z0419.800.00 31.00.0 7.560.00 8.650.02 3.060.030.050.00 1.900.06 0.340.020.390.021.800.09 0.540.01 0.960.04冬季winterZ0618.500.00 30.20.0 7.580.01 8.830.08 2.800.010.160.02N0.110.000.120.020.150.00N0.450.01Z2119.600.00 27.90.0 6.020.00 8.220.03 2.480.010.130.01 1.000.03 0.120.010.190.010.250.01 0.290.01 0.530.01注:磺胺嘧啶未检出;N 为未检出。Note:sulfadizine is undetected;N mean that the item does not detected.392第 2 期叶映仪，等:湛江湾抗生素抗性基因的时空分布及其影响因素表 3湛江湾表层沉积物中重金属 4 个季节的检测值Tab.3Detection values of heavy metals in surface sediments of Zhanjiang Bay in four seasonsg/g季节season站位station铬 Cr铜 Cu锌 Zn镉 Cd铅 Pb锰 Mn镍 Ni砷 As汞 HgZ0477.534.1629.540.6289.010.970.190.0043.353.32189.393.2523.790.2311.950.46 0.080.02春季springZ0662.961.2214.681.1466.212.100.250.0240.805.14230.411.7118.040.698.070.780.040.00Z2144.422.3012.012.4345.801.350.090.0124.881.24 346.9411.2012.932.1310.891.73 0.060.01Z0440.830.6613.055.6354.091.460.090.0033.570.23283.154.5512.611.168.430.070.040.01夏季summerZ0675.943.4510.343.35 116.293.110.090.0133.181.59314.621.2111.610.579.410.630.030.00Z2189.2611.80 10.451.2621.150.060.110.0227.764.36225.274.2613.461.6714.773.11 0.040.01Z0481.558.8728.782.59 102.242.510.200.0044.471.18373.898.4624.730.7612.311.39 0.090.03秋季autumnZ0667.500.8915.350.6769.980.430.150.0045.481.27249.141.3618.706.756.510.240.030.01Z2143.993.148.150.5831.032.000.050.0120.253.01221.340.4411.251.597.510.180.060.01Z0468.861.0125.873.1692.524.120.210.0143.326.11326.720.6920.602.2419.452.46 0.090.02冬季winterZ0658.350.2212.951.3857.461.270.110.0237.204.13221.594.6413.120.388.341.130.040.02Z2151.135.5613.080.4747.982.030.080.0129.110.86390.959.7315.640.7612.171.58 0.050.012.216S rNA、AGs 和 intI1 绝对丰度的时空分布特征从图 2 可 见:16S rNA 基 因、3 种 AGs(sul1、tetQ 和 qnrS)和 intI1 在所有样品中的检出频率均为 100%;16S rNA 基因、sul1、tetQ、qnrS和 intI1 在 4 个季节所有样品中的平均绝对丰度依次为 5.27106、7.23104、2.68104、7.93102、1.62105copies/g。所有基因的平均绝对丰度值均呈现出时间和空间尺度上的差异:从时间尺度来看，16S rNA 基因、3 种 AGs 和 intI1 的平均绝对丰度值均呈现出冬季最高，春、秋季次之，夏季最低的现象;从空间尺度来看，16S rNA 基因在各站位的平均绝对丰度变化规律为 Z04Z21Z06，而 3 种AGs 和 intI1 的平均绝对丰度值均呈现出 Z21Z04Z06 的现象(图 2)。标有不同字母者表示同一季节不同站位间存在显著性差异(P0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P0.05)，下同。The means with different letters in the same season are significantly different between different stations at the 0.05 probability level，and the meanswith the same letter are not significant differences，et sequentia图 2湛江湾表层沉积物中目的基因绝对丰度的季节分布Fig.2Seasonal distribution of absolute abundance of target genes in surface sediments of Zhanjiang Bay492大连海洋大学学报第 38 卷2.3AGs 和 intI1 相对丰度的时空分布特征3 种抗性基因和 intI1 在沉积物样品中的相对丰度分布如图 3 所示，3 种抗性基因 sul1、tetQ 和qnrS 的相对丰度均在夏季 Z06 样品异常高，分别达 4.55102、2.28101、2.08103，而在其余样品中分布较均匀，其余样品 4 个季节的平均相对丰度依次为 1.41102、5.26103和 1.72104。从季节尺度看，3 种 AGs 的平均相对丰度均呈现出夏季最高的现象;从空间尺度看，3 种AGs 在各站位平均相对丰度均为 Z06Z21Z04。intI1 4 个季节的平均相对丰度为 2.59102，其分布规律与 3 种 AGs 明显不同，季节平均相对丰度冬季高于夏季，与平均绝对丰度季节变化相似;各站位平均相对丰度均为 Z21Z06Z04(图 3)。图 3湛江湾表层沉积物中目的基因相对丰度的季节分布Fig.3Seasonal distribution of relative abundance of target genes in surface sediments of Zhanjiang Bay2.4各基因丰度间的相关性分析基因绝对丰度间的 Sperarman 相关性分析显示:3 种 AGs(sul1、qnrS 和 tetQ)彼此之间均呈显著正相关(r0.700，P0.01);sul1、tetQ 与intI1 之间均呈显著正相关(r0.600，P0.05)，而 qnrS 与 intI1 无相关关系(P0.05)，且 3 种AGs、intI1 均与 16S rNA 基因间呈显著正相关(r0.600，P0.05)(图 4(a)。基因相对丰度间的 Speratman 相关性分析显示:除了 sul1 相对丰度分别与 qnrS、tetQ 和 intI1 相对丰度间呈显著正相关(r0.600，P0.05)之外，其余基因的相对丰度之间均无相关关系(P0.05)(图 4(b)。2.5各基因丰度与环境因子间的相关性分析5 个基因的丰度与环境因子的 Spearman 相关性分析显示，理化因子仅 DO 与 tetQ 绝对丰度呈正相关(r=0.636，P0.05)(图 4(c)。5 个基因丰度与抗生素的 Spearman 相关性分析显示:四环素类和氟喹诺酮类抗生素与基因丰度间相关性较显著;环丙沙星与 sul1、tetQ 和 16S rNA 基因，以及土霉素与 sul1、16S rNA 基因绝对丰度间均呈显著正相关(r0.600，P0.05)(图 4(c);氧氟沙星与 sul1 相对丰度间呈显著负相关(r 0.500，P0.05)，土霉素、诺氟沙星与 qnrS 相对丰度间均呈显著负相关(r0.500，P0.05)(图 4(d)。5 个基因丰度与重金属的 Spearman相关性分析显示:Mn 与 qnrS、tetQ 的绝对丰度间均呈显著正相关(r0.600，P0.05)(图 4(c);Cu、Pb 与部分 AGs(sul1 或 qnrS)相对丰度间呈显著负相关(r0.500，P0.05)，Cd、Pb 与intI1 相对丰度间均呈显著负相关(r0.600，P0.05)(图 4(d)。将16S rNA 基因、AGs(sul1、qnrS 和 tetQ)和 intI1 基因的丰度与各项理化因子、抗生素及重金属进行冗余分析(DA 分析)(图 5)。基因绝对丰度的 DA 分析显示:仅重金属 Cd 与目的基因绝对丰度的分布和变化密切相关(Pseudo-F=5.8，592第 2 期叶映仪，等:湛江湾抗生素抗性基因的时空分布及其影响因素图 4各基因丰度间及其与环境因子间的 Spearman 相关性分析Fig.4Spearman correlation analysis between AGs，and between AGs and environmental factorsP0.05)(图 5(c)，重金属对基因绝对丰度分布的总解释度为 93.01%，并且该值也为前两个坐标轴(DA1 和 DA2)的累计解释度;其他环境因子对基因绝对丰度影响较弱(图 5(a)、(b)，理化因子和抗生素对基因绝对丰度分布的总解释度分别为 48.21%和 77.44%，两者均未与各基因绝对丰度显著相关。基因相对丰度的 DA 分析显示:重金属 Cu 可能是影响目的基因相对丰度分布和变化的主要环境因子(Pseudo-F=18.3，P 0.01)(图 5(f)，且 Pb、Cr 和 Mn 也是潜在影响目的基因相对丰度分布的重要环境因子(4.7Pseudo-F7.2，P0.05)，重金属对基因相对丰度分布的总解 释 度 为 99.20%，其 中，前 两 个 坐 标 轴(DA1 和 DA2)的累计解释度达 99.13%;其他环境 因 子 对 目 的 基 因 相 对 丰 度 的 影 响 较 弱(图 5(d)、(e)，理化因子和抗生素对基因相对丰度分布的总解释度分别为 51.25%和 45.52%，两者与各基因相对丰度均无显著相关性(P0.05)。进一步对各类环境因子与 AGs 相对丰度进行方差分解分析，发现重金属对海湾 AGs 相对丰度变化的贡献大于理化因子和抗生素，高达 87.15%，三类环境因子的共同贡献小于 20%(图 6)。3讨论3.1AGs 的季节分布16S rNA 基因的绝对丰度值能反映出对应沉积物样品中的细菌总量，而 intI1 作为一种能携带抗生素抗性基因的整合子，其丰度的分布情况反映了 AGs 水平转移的情况。从绝对丰度来看，湛江湾表层沉积物中各类 AGs 和 intI1 的平均绝对丰度在各季节的分布，整体上呈现出冬季最高、夏季最低的季节分布规律，该结果与中国大陆沿岸水域AGs 和 intI1 的平均绝对丰度值呈现出冬季高于夏季23 的结果相似，但该结果与长江河口区表层沉积物中各类 AGs 夏季高、冬季低的研究结果相692大连海洋大学学报第 38 卷图 5基因绝对丰度和相对丰度分别与三类环境因子的 DA 分析Fig.5edundancy discriminant analysis(DA)of gene absolute abundance and relative abundance with three kinds ofenvironmental factors图 6三类环境因子对 AGs 相对丰度分布解释度的方差分解分析(VPA)Fig.6Variation portioning analysis(VPA)of threekinds of environmental factors on the AGsdistribution(based on relative abundance)反12。从相对丰度来看，3 种 AGs 的平均相对丰度在夏季异常增大的原因与 16S rNA 基因的丰度有关，因为细菌平均绝对丰度在夏季样品中最低。Spearman 相关性分析显示，各类 AGs 的绝对丰度均与 16S rNA 基因绝对丰度间显著相关，进一步验证了这一观点，同时前人对长江河口的相关研究结果也支持这一观点24，说明细菌丰度对 AGs相对丰度与绝对丰度分布有重要影响。本研究中，从 3 种类型的 AGs 在湛江湾表层沉积物中的绝对丰度和相对丰度值可知，磺胺类抗性基因 sul1 是湛江湾表层沉积物中最丰富的AGs，其次是四环素类抗性基因 tetQ，而氟喹诺酮类抗性基因 qnrS 丰度最低。此外，前人在多个河口和近海表层沉积物环境中的研究结果均表明，sul1 基因是 AGs 中最丰富的一类7，10，12，25，sul1基因在多个近海环境中分布最广和最丰富的现象与其在环境中较高的持久性密切相关26。将湛江湾沉积物中各季节不同类型 AGs 的绝对丰度值与相对丰度值同其他近海环境进行比较。与春季东海 3 个海湾(杭州湾、象山湾和台州湾)相比，春季湛江湾沉积物中磺胺类抗性基因 sul1的绝对丰度值(104105copies/g)比东海台州湾(106107copies/g)约低 2 个数量级7;四环素类抗性基因 tetQ 的绝对丰度值(103 104copies/g)远低于东海 3 个海湾(104107copies/g)7。与夏冬季渤海湾相比，夏冬季湛江湾沉积物中磺胺类抗性基因 sul1 的绝对丰度值(103105copies/g)低于渤海湾沉积物(104 107copies/g)25;四环素类抗性基因 tetQ 的绝对丰度值(103104copies/g)792第 2 期叶映仪，等:湛江湾抗生素抗性基因的时空分布及其影响因素低于渤海湾沉积物(105 107copies/g)25;氟喹诺酮类抗性基因(qnrS)的最高绝对丰度值(约103copies/g)比渤海湾沉积物(约 108copies/g)低 5 个数量级，最高相对丰度(103)比其对应值(约 102)约低 1 个数量级25。此外，湛江湾除夏季 Z06 站位样品外，其余站位样品中 sul1 4 个季节的平均相对丰度值(1.41102)与全球河口和近海环境中的数值(1.46102)接近27。上述结果表明，湛江湾沉积物中存在一定程度的 AGs 污染，但污染程度整体低于其他海湾。3.2AGs 的空间分布本研究中，从绝对丰度来看，湛江湾表层沉积物中 AGs 和 intI1 的平均绝对丰度在靠近宝钢钢铁厂的 Z21 站位污染情况最严重，其次是受城市生活污水排放影响的 Z04 站位，而 Z06 站位的污染程度最低。从相对丰度来看，AGs 的平均相对丰度均在 Z06 站位最高，可能是受细菌丰度影响的原因。在其他海湾和河口环境的研究中，也出现类似现象。Chen 等7 发现，在靠近医药基地的站位中检测到 AGs 出现的频率和丰度均相对更高;Guo等12 和 Lu 等23 发现，大多数 AGs 和 intI1 在污水处理厂尾水排放区域的丰度相对较高;Lu 等28 和 Zhu 等5 发现，海岸带和河流样品或不同河口样品中，AGs 和可移动遗传元件的丰度差异显著。Zhang 等25 指出，AGs 的不同空间分布是受到海洋污染和陆基污染的相互作用，以及密集的人为活动影响。这些结果表明，环境中不同区域的AGs 分布普遍存在差异。3.3AGs 与整合子基因 intI1 的关系整合子是可移动遗传元件(mobile genetic ele-ments，MGEs)的一种，当两种微生物接触时，MGEs 可驱动 DNA 从供体微生物转移到受体微生物，从而使受体微生物的基因组发生变化29，这种基因转移机制有利于抗性基因的传播。而整合子(如 intI1)已被报道广泛存在于多个河口和近海环境中27。本研究中，intI1 在湛江湾沉积物中的平均绝对丰度值仅次于 16S rNA 基因，其绝对丰度比整体渤海湾和黄海沉积物中的最高绝对丰度低23 个数量级25，28，而其最高相对丰度(102)比莱州湾中的 intI1(约 103)高 1 个数量级9。湛江湾沉积物中 intI1 的绝对丰度和相对丰度均与磺胺类抗性基因 sul1 显著相关(P0.05)，这与前人在河口和海岸环境中的诸多报道一致5，7，9-10，12，据分析是由于 sul1 能经常叠加于 intI1 基因序列上所致30。除了磺胺类抗性基因外，湛江湾表层沉积物中的 intI1 与四环素类抗性基因 tetQ 的绝对丰度显著相关(P0.05)，与前人在河口和海岸环境中二者显著相关的研究结果一致7，12，23，说明 intI1可能驱动了四环素类抗性基因在近海环境中的传播。本研究中，湛江湾表层沉积物中的 intI1 与氟喹诺酮类抗性基因 qnrS 并无相关关系，该结果与Lu 等28 对渤海、黄海海域的相关研究结果一致，但与 Guo 等12 对长江河口中二者显著相关的研究结果不符，说明 intI1 与氟喹诺酮类抗性基因的关系还需进一步研究。综合以上研究，intI1 可能驱动了近海环境中磺胺类抗性基因和四环素类抗性基因的传播，而对氟喹诺酮类抗性基因的潜在影响有待进一步研究。3.4AGs 与环境因子的关系研究发现，污水处理厂和城市河流排放的重金属、化学需氧量(DOC)和总氮(TN)等污染物与长江口表层沉积物中的 AGs 相关且呈现出相似的季节变化规律，表明沿岸产业的污水排放可能会对 AGs 的局部分布规律产生影响12。对于 AGs的空间分布而言，Zhu 等5 分析了中国近岸多个河口水域表层沉积物中 AGs 的分布特征，指出环境理化因子和细菌群落并不是驱动 AGs 在近岸河口水域分布的因素，而人类活动如城市生活污水的排放、抗生素的污染等是影响海湾 AGs 空间分布的重要因素。3.4.1抗生素本研究中，湛江湾沉积物中三类抗生素的平均浓度依次为氟喹诺酮类四环素类磺胺类，并且三类抗生素最高浓度均出现在 Z04 站位冬季样品中，该结果与前人对水域环境中抗生素浓度冬季高于夏季的结果相似，主要是由于冬季人类患病增多和夏季雨水稀释等原因所致15。虽然湛江湾沉积物中磺胺类抗生素的平均浓度在三类抗生素中最低，但是磺胺类抗性基因 sul1 在 3 种AGs 中占主导地位，磺胺类抗生素与 sul1 之间并无显著的相关性，该现象与前人对河口和近海环境中 AGs 的报道相似，即磺胺类抗性基因可能是由河口附近的污染源排放，而不是经抗生素压力而原位形成12，31。对湛江湾沉积物中氟喹诺酮类抗生素与其抗性基因的相关性研究发现，氟喹诺酮类抗生素在检测的三类抗生素中平均浓度最高，但其对应的抗性基因 qnrS 丰度却在 3 种 AGs 中最低，氟喹诺酮类抗生素诺氟沙星与抗性基因 qnrS 的相对892大连海洋大学学报第 38 卷丰度呈显著负相关，前人对长江河口区的研究中也曾发现，氟喹诺酮类是最主要的抗生素，但氟喹诺酮类抗性基因并不是占主导的 AGs12。此外，AGs 与抗生素的相关性分析还显示，四环素类抗生素(土霉素)