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脱氢姜酮通过调控miR-2...p-2增殖、迁移及血管形成_吴俊.pdf
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1、基金项目:安徽省高校自然科学研究重点项目(KJ2020A0590);蚌埠医学院自然科学重点项目(2021byzd061)作者简介:吴俊,男,1984 02 生,硕士,主治医师,E-mail:cland1229163 com收稿日期:2022 08 28脱氢姜酮通过调控 mi-223-3p 抑制喉癌细胞 Hep-2 增殖、迁移及血管形成吴俊,王文忠,吴娟,于宁静,孙哲,周兰柱*(蚌埠医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科,蚌埠233000;*通讯作者,E-mail:lanzhu 07163 com)摘要:目的探讨脱氢姜酮(DZG)对喉癌细胞 Hep-2 增殖、迁移及血管形成的影响及其相关机制。方法分
2、别以不同浓度的 DZG(0,75,150,300 mol/L)处理 Hep-2 细胞 24 h,MTT 法、Transwell、Western blot 法、实时荧光定量 PC(T-PC)分别检测 Hep-2 细胞的存活率、迁移能力、迁移蛋白波形蛋白(Vimentin)、N 钙黏蛋白(N-cadherin)和血管形成蛋白血管内皮生长因子(VEGF)以及基质金属蛋白酶 2(MMP-2)相对表达水平和 mi-223-3p mNA 相对表达量。将 Hep-2 细胞分别分为:空白对照组(control 组)、模拟物阴性对照组(mi-NC)、mi-223-3p 组(转染 mi-223-3p);空白对照组
3、(si-control 组)、阴性对照组(si-NC)及 mi-223-3p 小干涉 NA 组(si-mi-223-3p)。MTT 法检测细胞增殖抑制能力,Transwell 检测细胞迁移能力,Western blot 检测细胞 VGEF、MMP-2、Vimentin、N-cadherin 蛋白相对表达量。结果0,75,150,300 mol/L 的 DZG 培养Hep-2 细胞,MTT 结果显示,24 h 细胞存活率随 DZG 浓度增加而下降(P0 05);Transwell 结果显示,细胞迁移能力随 DZG 浓度增加而下降(P0 05);Western blot 结果显示,VGEF、MMP
4、-2、Vimentin、N-cadherin 蛋白相对表达量随 DZG 浓度增加而降低(P0 05);T-PC 结果显示,mi-223-3p mNA 相对表达量随 DZG 浓度增加而增加(P 0 05)。将 Hep-2 细胞进行转染后,T-PC 结果表明,mi-223-3p 组 Hep-2 细胞 mi-223-3p 相对表达量较 mi-NC 组和 control 组明显升高,si-mi-223-3p 组Hep-2 细胞 mi-223-3p 相对表达量较 si-NC 组和 si-control 组明显降低(P0 05)。MTT 法结果显示,mi-223-3p 组细胞存活率较 mi-NC 组明显降
5、低(P0 05)。不加 DZG 单独使用正常培养基培养验证 mi-223-3p 对 Hep-2 细胞存活率时发现,mi-223-3p 组细胞存活率较 mi-NC 组和 control 组细胞明显下降,si-mi-223-3p 组细胞存活率较 si-NC 组和 si-control 组明显升高(P0 05);Transwell 结果显示,mi-223-3p 组细胞迁移率较 mi-NC 组和 control 组明显降低,si-mi-223-3p 组细胞迁移率较si-NC 组和 si-control 组明显升高(P0 05)。Western blot 结果显示,mi-223-3p 组 VGEF、MM
6、P-2、Vimentin 和 N-cadherin 蛋白相对表达量较 mi-NC 组和 control 组明显降低,si-mi-223-3p 组 VGEF、MMP-2、Vimentin 和 N-cadherin 蛋白相对表达量较 si-NC 组和 si-control 组明显升高(P 0 05)。结论DZG 可通过调控 mi-223-3p 抑制喉癌细胞 Hep-2 增殖、迁移及血管形成,其机制可能与下调迁移及血管形成相关蛋白 VGEF、MMP-2、Vimentin 和 N-cadherin 相关。关键词:喉癌;mi-223-3p;增殖;侵袭;迁移;血管形成中图分类号:739 65文献标志码:A
7、文章编号:1007 6611(2023)04 0446 08DOI:1013753/j issn1007 6611202304006Dehydrogingerone inhibits proliferation,migration and angiogenesis of laryngeal cancer cells Hep-2 by regulating mi-223-3pWU Jun,WANG Wenzhong,WU Juan,YU Ningjing,SUN Zhe,ZHOU Lanzhu*(Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery
8、,First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Bengbu 233000,China;*Corresponding author,E-mail:lanzhu 07163 com)Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of dehydrogingerone(DZG)on proliferation,migration and angiogenesis of laryngealcancer cells Hep-2 and its related mechanismMethodsHep-2
9、 cells were treated with DZG at different concentrations(0,75,150,300 mol/L)for 24 h MTT method,Transwell,Western blot and T-PC were used to detect the survival rate of Hep-2 cells,themigration ability,the protein expression of Vimentin,N-cadherin,angioforming protein vascular endothelial growth fac
10、tor(VEGF)andmatrix metalloproteinase-2(MMP-2)and relative mi-223-3p mNA level,respectively Hep-2 cells were divided into:blank controlgroup(control group),negative analog control group(mi-NC),and mi-223-3p group(transfected with mi-223-3p);blank con-trol group(si-control group),negative control grou
11、p(si-NC group)and mi-223-3p small interference NA group(si-mi-223-3pgroup)MTT assay,Transwell assay and Western blot were used to detect the cell proliferation,the cell migration,and the relativeexpression levels of VGEF,MMP-2,Vimentin and N-cadherinesultsMTT and Transwell results showed that 24 h c
12、ell survivalrate and the cell migration ability were statistically decreased by DZG in a concentration-dependent manner(P 0 05)Western blotresults showed that the relative expression levels of VGEF,MMP-2,Vimentin and N-cadherin were decreased with the increase of DZG644J Shanxi Med Univ,Apr 2023,Vol
13、 54 No 4concentration(P0 05)T-PC results showed that the mNA relative expression level of mi-223-3p was increased in a concen-tration-dependent manner(P0 05)T-PC results showed that the relative expression level of mi-223-3p in Hep-2 cells in mi-223-3p group was significantly higher than that in mi-
14、NC group and control group and the relative expression level of mi-223-3p inHep-2 cells in si-mi-223-3p group was significantly lower than that in si-NC group and si-control group(P 0 05)The results ofMTT assay showed that the cell survival rate in mi-223-3p group was significantly lower than that i
15、n mi-NC group(P0 05)Undernormal culture medium without DZG,the survival rate of mi-223-3p cells in mi-223-3p group was significantly decreased comparedwith mi-NC group and control group The cell survival rate in si-mi-223-3p group was significantly higher than that in si-NC groupand si-control group
16、(P 0 05)Transwell results showed that the cell mobility in mi-223-3p group was significantly decreasedcompared with mi-NC group and control group,while the cell mobility in si-mi-223-3p group was significantly increased comparedwith si-NC group and si-control group(P 0 05)Western blot results showed
17、 that the relative expression levels of VGEF,MMP-2,Vimentin and N-cadherin in mi-223-3p group were significantly lower than those in mi-NC group and control group,while the rela-tive expression levels of VGEF,MMP-2,Vimentin and N-cadherin in si-mi-223-3p group were significantly higher than those in
18、si-NC group and si-control group(P0 05)ConclusionDZG can inhibit the proliferation,the migration and the angiogenesis oflaryngeal carcinoma cells Hep-2 by regulating mi-223-3p,which may be related to the down-regulation of migration and angiogenesis-related proteins VGEF,MMP-2,Vimentin and N-cadheri
19、nKey words:laryngeal carcinoma;mi-223-3p;proliferation;invasion;migration;angiogenesis喉癌是耳鼻咽喉头颈外科常见的恶性肿瘤之一,其发病率约占全身恶性肿瘤的 1%5%,占头颈部恶性肿瘤的 3 3%8 1%1。与女性相比,喉癌在男性中发病更为普遍2。在世界范围内,喉癌的发病率在逐年增加3,大约 60%的喉癌患者在被确诊时已经为晚期(期或期),因此喉癌的治疗效果及预后较差。近年来,随着医学的进步,喉癌的方式较有所进步,但是近几十年,喉癌患者的生存率却一直很低,并呈下降趋势4。因此,对于喉癌,寻找新的治疗策略非常重要
20、。脱氢姜酮(dehydrogergenone,DZG)是从生姜中提取的一种类似于姜黄素的常见药物,近年来因其化学结构与姜黄素类似而被注意到5。已有研究表明,DZG 可抑制人结肠癌、前列腺癌等多种癌症的进展6,7。mi-223-3p 是一种微小 NA,其被证明在多种癌症中发挥作用8,9。但是 DZG 对喉癌的作用及其相关机制是何并未有相应研究。本研究拟通过观察不同浓度 DZG 对喉癌细胞 Hep-2 增殖、迁移及血管形成的影响,并进一步验证其是否能通过mi-223-3p 产生抑癌效果,旨在为临床医师对喉癌的治疗提供新思路。1材料与方法1 1细胞和主要试剂喉癌 Hep-2 细胞购自上海细胞库。PM
21、I 1640培养基为上海生工公司产品,胎牛血清(FBS)为浙江天杭生物科技股份有限公司产品,脂质体 Lipo-fectamine2000、Trizol 试剂为美国英杰生命技术有限公司 产 品,噻 唑 蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、BCA 定量试剂盒购于上海碧云天公司,血管内皮 生 长 因 子(serum vascular endothelial growthfactor,VEGF)、基质金属蛋白酶 2(MMP-2)、波形蛋白(Vimentin)、N 钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白抗体为安诺伦(北京)生物科技有限公司产品。1 2细胞培养及分组喉癌
22、Hep-2 细胞培养于含 10%胎牛血清的1640 培养液中,并于 37、5%CO2培养箱中培养。首先按照 DZG 浓度将细胞分为 4 组:0,75,150,300mol/L 组。MTT 法、Transwell、Western blot 法、实时荧光定量 PC(T-PC)分别检测 Hep-2 细胞的存活率、迁移能力、迁移蛋白波形蛋白(Vimentin)、N 钙黏蛋白(N-cadherin)和血管形成蛋白血管内皮生长因子(VEGF)以及基质金属蛋白酶 2(MMP-2)相对表达水平和 mi-223-3p mNA 相对表达量。将 Hep-2 细胞分别分为:空白对照组(control 组,不进行转染)
23、、模拟物阴性对照组(mi-NC,转染无关序列)、mi-223-3p 组(转染 mi-223-3p 序列);空白对照组(si-control 组)、阴性对照组(si-NC,转染无关序列)及 mi-223-3p 小干涉 NA组(si-mi-223-3p 组)。MTT 法检测细胞增殖抑制能力,Transwell 检测细胞迁移能力,Western blot 检测细胞 VGEF、MMP-2、Vimentin、N-cadherin 蛋白相744山西医科大学学报,2023 年 4 月,第 54 卷 第 4 期对表达量。1 3MTT 法检测细胞的存活率取未处理 Hep-2 细胞或转染后的 Hep-2 细胞于9
24、6 孔板培养,每孔培养液为 100 l,每孔约 8 000 个细胞。待细胞完全贴壁分别加入不同浓度 DZG(0,75,150,300 mol/L)再加入到各组细胞中。培养24 h 加入 5 g/L 的 MTT 溶液 15 l,4 h 后每孔加入150 l 二甲基亚砜溶液,30 min 检测各组细胞在490 nm 波长处的吸光度值(OD490),并计算细胞存活率:细胞存活率(%)=实验组 OD490/对照组 OD490100%。1 4Transwell 检测 Hep-2 细胞侵袭、迁移能力取生长状态良好的未处理 Hep-2 细胞或转染后的 Hep-2 细胞使用 DZG 浓度分别为 0,75,15
25、0,300mol/L 的无血清培养液溶解为 4 组后加入到上层小室。下层小室配制含 10%胎牛血清的细胞培养基 600 l。控制每个小室细胞数为 2 104个,每组设 3 个复孔。继续 24 h。使用 4%多聚甲醛对细胞进行固定、0 1%结晶紫对细胞染色、PBS 溶液清洗细胞后进行拍照。1 5Western blot 法检测 VGEF、MMP-2、Vimentin、N-cadherin 蛋白表达水平取生长状态良好的未处理 Hep-2 细胞或转染后的 Hep-2 细胞使用 DZG 浓度分别为 0,75,150,300mol/L 的细胞培养液培养 48 h。按照说明书使用裂解液裂解后离心提取蛋白。
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