引种姬松茸菌丝体生物学特性及保藏技术_万诚.pdf

北方园艺 （）：食 用 菌第一作者简介：万诚（），男，硕士，助理研究员，现主要从 事 遗 传 育 种 等 研 究 工 作。：责任作者：王莹（），女，博士，副研究员，现主要从事生物学等研究工作。：基金项目：贵州省科技重大专项资助项目（黔科合大专项字 ）；贵州省科技支撑资助项目（黔科合支撑 号）。收稿日期：引种姬松茸菌丝体生物学特性及保藏技术万诚，熊雪，李 蕾 嘉，王莹（贵州省生物研究所，贵州 贵阳 ）摘要：以引进省内外表现优良的 个姬松茸菌株为试材，采用基础生物学研究方法，研究了不同培养基、光照、温度以及 对其菌丝生长的影响，同期进行了姬松茸菌种资源保藏技术研究，以期筛选出姬松茸保藏最适宜保护剂配方。结果表明：姬松茸菌株适合在含麦麸的培养基上生长，菌丝培养时适合在黑暗条件下，适宜温度范围在 ，适宜酸碱环境在 ；姬松茸菌丝呈圆筒状，菌丝尖端排列分为放射形和卷曲形，其锁状联合现象较少、分布不密集；姬松茸菌种保藏时水溶液保护剂最佳配方为的 甘油与蔗糖溶液。关键词：姬松茸；菌丝体；生物学特性；菌种保藏中图分类号：文献标识码：文章编号：（）姬松茸在巴西被称为“”，在日本被称为“”，是一种原产于巴西的蘑菇。年日本学者古本隆寿在巴西采集到一种野生真菌，分离纯化后带回日本，该菌株在三重县津布岩出菌学研究所进行试验培养，年在比利时一位真菌学家海涅曼博士鉴定下，鉴 定为 蘑菇 亚 纲（）蘑 菇 目（）蘑菇科（）蘑菇属（），学名为 。年福建省农业科学院植物保护研究所在国内首次从日本引进姬松茸，对姬松茸开展引种驯化，年水野卓等研究发现姬松茸中含有抗肿瘤的多糖。随后姬松茸的生物活性研究在食用菌界掀起了一阵热潮，国内外学者陆续研究发现姬松茸的多糖、多酚和微量元素具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖血压、抗氧化衰老、增强免疫力和保护肝脏的功能。反而近 年关于姬松茸基础生物学特性的报道却停留在了 世纪 年代，同时在姬松茸生产实践中江枝和学者发现姬松茸菌种保藏稳定性差，在 低温保存下菌丝不生长，陈胤研究发现，姬松茸菌株在 保存时，保存 后菌种就不会萌发开始出现死亡，该团队的刘新锐等在 年发明了一种姬松茸菌种液氮保藏方法，但液氮保藏系统成本极高，并不是每个科研机构都有条件进行液氮保藏。因此，该研究 引进省 内 外 品 种和 种植基地表现型优良的 个姬松茸菌株，对姬松茸菌丝体基础生物学特性进行研究与验证，同时对姬松茸菌种保藏技术进行研究，以期为姬松茸种质资源在贵州省开发利用与示范推广提供参考依据。材料与方法 试验材料收集引进省内外品种和种植基地表现型优良的 个姬松茸菌株，制作姬松茸活化培养基，无菌环境下将试管母种接种到活化培养基平板上，表供试菌株及来源情况 编号 菌株名称 来源 姬松茸 福建南平市农科所姬松茸 武汉新宇食用菌研究所姬松茸 河南省科学院生物研究所姬松茸 福建农林大学姬松茸 四川省农科院食用菌中心姬松茸 广东省科学院微生物研究所姬松茸贵州省农业科学院姬松茸 福建省农科院姬松茸 福建省地热所 姬松茸 遵义市 姬松茸 三明市食用菌研究所 培养，活化备用。培养基：马铃薯 ，葡萄糖，蛋白胨，琼 脂，蒸 馏 水，灭 菌 。活化培养基：麦麸（煮水 ，层纱布过滤），马铃薯 ，葡萄糖，蛋白胨，琼脂，蒸馏水，灭菌 。试验方法 适宜培养基筛选试验培养基：麦粒（煮水 ，层纱布过滤），马铃薯 ，葡萄糖，琼脂，蒸馏水，灭菌 。培养基：麦麸（煮水 ，层纱布过滤），马铃薯 ，葡萄糖，琼脂，蒸馏水，灭菌 。培养基：稻草（煮水 ，层纱布过滤），马铃薯 ，葡萄糖，琼脂，蒸馏水，灭菌 。采用直径 培养皿，在超净台中加入已灭菌的种培养基，待其冷却后，用直径 无菌打孔器，将活化备用的菌种平板菌落打成圆片接入培养皿内，黑暗培养，萌发后打点划线，继续培养，记录生长速度，继续培养至铺满平板，观察菌落形态，每处理次重复。菌丝生长速度测定采用“十”字交叉法，从菌丝萌发开始，记录菌丝萌发时间，菌丝日均生长速度以萌发后菌落平均每日直径增长量统计。菌丝铺满平板时，观察记录菌落的菌丝形态、色泽、菌落形状、菌丝长势和边缘特征等，用“”“”表示菌丝的长势，“”越多表示菌丝生长得越好、越健壮、均匀，“”表示菌丝不生长。光照试验将试验 中得到的适宜培养基作为试验基础培养基，利用活化后的姬松茸菌株和人工气候箱，采用直径 培养皿，在超净台中加入已灭菌的基础培养基 （一个培养皿约 ），待其冷却后，用直径 无菌打孔器，将菌种平板菌落打成圆片接入培养皿内，在 培养条件下，开展光照和黑暗试验，每处理次重复。数据统计同 。温度梯度试验试验步骤和方法同 ，在、不同温度梯度下培养，每天分别记录菌落的直径（“十”字交叉法），每处理次重复。数据统计同 。不同 试验将试验 中得到的适宜培养基作为试验基础培养基，以 和 按不同比例配制，分别设 为、共个处理，用直径无菌打孔器，将菌种平板菌落打成圆片接入备好的培养皿内，每处理次重复，置 恒温箱中黑暗培养，观察记录菌丝生长情况，培养至长势最快的菌株铺满平板为止。选择菌落最大、长势最快的条件作为最适。姬松茸菌丝显微结构观察将试验 中得到的适宜培养基作为试验基础培养基，在培养基中插上盖玻片，待菌丝长满盖玻片，在光学显微镜下用、倍物镜进行菌丝形态特征观察，观察主要内容包括菌丝尖端排列、菌丝锁状联合情况。姬松茸菌种保藏试验保藏 与 解 冻 方 法：选 取 供 试 菌 株 号 与 号开展姬松茸菌株水溶液保藏试验，待菌丝体长满平板后用灭菌的打孔器在离菌种块 的直径处截取同样大小的菌种块装入冻存管中，每管装入块，再加入相对应的保护剂，保护剂组合见表，保存方法按照参考文献 进行，先将冻存管在冰箱预冷，然后放入 冰箱再预冷，最后放入 冰箱中保藏。北方园艺月月（上上）表姬松茸菌种保藏保护剂配方 编号 甘油 蔗糖溶液 黄原胶溶液 总体积 对照为 去离子水 解冻参照文献 进行，取出冻存管后立即放入 左右的水中慢慢摇动 ，保证内部的结冰全部溶解，可以减少解冻过程中形成的冰晶对菌丝细胞造成的伤害。项目测定菌丝脱氢酶活性测定：对不同处理保藏的菌种，在保藏、进行试验，将冻存管取出按照上述方法解冻后，将菌丝转移到备好的培养基中，避光培养，待菌丝长满后按照文献进行菌丝脱氢酶活性测定。数据分析试验 数 据 采 用 统 计 软 件 进 行分析。结果与分析 不同培养基对姬松茸菌丝生长的影响由表可知，在不同培养基上，种菌株萌发时间均为，但生长速度和长势差异显著。在麦麸培养基培养下，种菌株生长速度最快的是号菌株，达 ，生长最慢的为号菌株，为 ，整体菌丝生长快慢表现依次为 ，菌落长势、号菌株长势较佳。麦粒培养基培养下 种菌株生长速度最快的为号菌株，日均生长速度达 ，最 慢 的 是 号 菌 株，日 均 生 长 速 度 为 ，快慢表现依次为 ，菌落长势除、号菌株生长较差之外，其它菌株长势相当。稻草培养基培养下、号菌株日均生长速度均优于其它菌株，但其它菌株生长较差。从长势上看、号菌株菌落长势较好。从菌丝日均生长速度、菌丝长势、萌发时间等指标来看，可得出麦麸培养基更适于姬松茸菌丝生长。表不同培养基条件下不同姬松茸菌株生长情况 处理 菌株 日均生长速度 （）菌丝长势 萌发时间 麦麸培养基 麦粒培养基 稻草培养基 注：日均生长速度为平均数标准误。小写字母表示样本在 水平上显著，下同。：，第第 期期 北方园艺 不同光照对姬松茸菌丝生长的影响由表可知，光照培养下号菌株生长最快，达 ，号菌丝生长最慢，日均生长速度仅为 。而无光照黑暗培养下，生长速度相对光照培养下显著提高，最快的是号菌株，达 ，生长最慢的为号菌株，为 ，整体菌丝生长快慢表现依次为 ，菌落长势、号菌株长势较佳。综上说明，在 条件下是否进行光照培养对姬松茸菌丝生长有较大的影响，光照抑制菌丝生长，菌丝长势也较差。且综合菌落长势及日均生长速度等指标，在黑暗培养中，表现出显著优势的菌株有、号及 号菌株。表不同光照条件下不同姬松茸菌株生长情况 处理 菌株 日均生长速度 （）菌丝长势 萌发时间 光照培养 黑暗培养 不同温度梯度对姬松茸菌丝生长的影响由表可知，对 种不同菌株进行温度差异培养，所有菌株在、及 条件下均不萌发；在 下 所 有 菌 株 仅 萌 发，菌 丝 不 吃 料；下除、菌株需要萌发外，其它菌株均需要。在 下均仅需萌发。虽然所选菌株均能在 条件下正常萌发并生长，但 下各菌株平板放置 后，均不能铺满平板，后期几乎停止生长。号菌株在 下均能较好生长，且生长速度明显快于其它温度（），其中最适温度为，日均生长速度达 。号菌株在 下均能较好生长，且生长速度明显快于其它温度（），最适温度为，日均生长速度达 。号菌株在 下均能较好生长，且生长速度明显快于其它温度（），最适温度为，日均生长速度达 。号菌株在所选温度条件下长势均一般，但 生 长 速 度 明 显 快 于 其 它 温 度（），最 适 温 度 为 ，日 均 生 长 速 度 达 。号菌株在 下长势稍好，但 下生长速度明显快于其它温度（），日均生长速 度 达 ，所以最适 温 度 为。号菌株在所选温度条件下长势均一般，但 生长速度明显快于其它温度（），最适温度为，日均生长速度达 。号菌株在 下长势稍好，但 下生长速度明显快于其它温度（），日均生长速 度 达 ，所以最适 温 度 为。号菌株在 下长势较好，但 下生长速度明显快于其它温度（），日均生长速 度 达 ，所以最适 温 度 为。号菌株在 下长势稍好，但 下生长速度明显快于其它温度（），日均生长速 度 达 ，所以最适 温 度 为。号菌株在 下长势较好，但 下生长速度明显快于其它温度（），日均生长速 度 达 ，所以最适 温 度 为。号菌株在 下长势较好，但 北方园艺月月（上上）表 个姬松茸菌株在不同温度条件下培养的生长情况 菌株 温度 日均生长速度 （）菌丝长势 萌发时间 菌株 温度 日均生长速度 （）菌丝长势 萌发时间 （不吃料）（不吃料）（不吃料）（不吃料）（不吃料）（不吃料）（不吃料）（不吃料）（不吃料）（不吃料）（不吃料）注：“”表示不萌发。：第第 期期 北方园艺下生长速度明显快于其它温度（），日均生长 速度达 ，所 以最适 温 度 为。综上所述，所选菌株在 范围内均能正常萌发和生长，但大部分菌株在 生长较好，且以 最为适宜。且所有温度下菌丝生长且菌落长势较好的菌株主要集中在、号和 号菌株中，其所得结果同光照试验较为一致。不同 对姬松茸菌丝生长的影响由表可知，对 种不同菌株进行不同酸碱度差异培养，所有菌株在 为、条件下时均不能萌发，在 为时仅菌株和菌 株 萌 发，但 生 长 速 度 极 低，分 别 为 和 。姬松茸菌株在 条件下时，菌落长势较好的菌株为、号菌株，且、号菌株生长速度均优于其它菌株，分别为 和 ，、号菌株生长仅次于、号菌株。号菌株生长速度快于号菌株，但菌丝长势上号菌株稍差于号菌株。姬松茸菌株在 条件下时，菌落长势较好的菌株为号和 号菌株，且长势也最快，其中 号菌株日均生长速度显著快于其它菌株（），为 。综上可知，所选 种姬松茸菌株对酸碱度适宜区间一致，在强酸和强碱环境下均不能正常生长，适宜 范围在。表不同酸碱度条件下 种姬松茸菌株萌发情况 菌株 表不同温度条件下 种姬松茸菌株生长情况 处理 菌株 日均生长速度 （）菌丝长势 自然 （左右）不同姬松茸菌丝显微结构观察经显微结构观察发现，姬松茸的菌丝呈圆筒状，分枝数多，根据品种及生长情况的差异，尖端排列有所不同。部分姬松茸的尖端由排列较为紧北方园艺月月（上上）密、较粗的菌丝组成，菌丝尖端向外排列为放射树枝状（图）；另一类的姬松茸尖端由菌丝交织排列而成，部分菌丝呈卷曲状（图）。在该试验观察的姬松茸菌株中，、号的菌丝尖端呈卷曲状，其它菌株呈放射树枝状。从菌丝显微结构观察中发现，部分姬松茸在生长过程中有锁状联合的情况，且锁状联合部分较少、分布不密集（图）。该试验观察的姬松茸中仅在、号菌株中发现锁状联合现象，其它菌株均没有观察到锁状联合现象。不同水溶液对姬松茸保藏效果的影响在经过、后，由表可知，从菌丝生长 速 度 来 看，供 试 菌 株 的 速 度 在 ，差异不显著；从菌丝长势来看，当菌丝铺满平板时，菌丝长势均较好；从脱氢酶活性来看，种供试菌株均呈 的显图倍物镜下菌丝尖端呈放射树枝状的姬松茸菌株 图倍物镜下菌丝尖端呈卷曲状的姬松茸菌株 第第 期期 北方园艺图 倍物镜下有锁状联合现象的姬松茸菌株 表各种保藏方法与时间的保藏效果 菌株 保藏配方 保藏时间 日均生长速度 （）菌丝长势 脱氢酶活性 北方园艺月月（上上）著变化规律，即水溶液为 甘油与蔗糖以配方 甘油与黄原胶以配方全 甘油配方，全去离子水配方的脱氢酶活性最低。从保藏时间上来看，在保藏 、时的日均生长速度、菌丝长势、脱氢酶活性几乎无显著差异，表明在 内保藏时间对保藏效果影响不大。综上，各保藏配方的菌丝生长速度和菌丝长势均无显著差异，将菌丝脱氢酶活性作为保藏配方的选择依据，筛选出配比的 甘油与蔗糖溶液为最适宜姬松茸水溶液保藏的方法。讨论与结论有关姬松茸的研究随着科学发展的不断推进，其浓郁的杏仁香味与丰富的营养价值广受人们的推崇，姬松茸在我国引进的历史不长，目前针对姬松茸的研究侧重点更多是在营养价值与生物活性方面，而关于生物学特性与引种栽培上的研究 均 比 较 久 远，甚 至 断 层 了 近 年。在 年福建省农业科学院植物保护研究所首次从日本引进姬松茸菌种，展开了生物学特性与营养成分分析等科学研究，在 年时对姬松茸的生物学特性进行了国内的初次报道；在 年江枝和等也进一步报道了姬松茸的生物学特性；随后在 年黄秀治等 以及 年王永庄等 陆续报道了姬松茸的生物学特性与栽培技术，之后国内对姬松茸的研究更多侧重在营养价值与生物活性上。该研究跨越了近 年，引进省内外品种和种植基地表现型优良的姬松茸菌株 个，再一次对姬松茸菌丝体生物学特性进行探索与验证。该试验结果表明，引种的 个姬松茸菌株更适宜在含麦麸的培养基上生长，菌丝培养时适合黑暗培养，且适宜温度范围在 ，适宜酸碱环境在 。在显微观察下，姬松茸的菌丝呈圆筒状，尖端排列有种形式，第一种形式的尖端由排列较为紧密、较粗的菌丝组成，菌丝尖端向外排列为放射形，另一种形式的尖端由菌丝交织排列而成，部分菌丝呈卷曲状，且锁状联合部分较少、分布不密集，可能与继代培养造成菌种退化相关。除菌丝生长适宜温度外，以上结果与之前学者所得出的结论基本相符，前辈学者们得出的菌丝适宜温度在 ，该研究得出的适宜温度范围在 ，其原因有以下猜想，可能是由于前辈学者们研究时引进的日本菌株在经历了 余年的发展变更，逐渐演变到各地进化成了适合当地气候特征菌株的原因，该研究引进的省内外表象良好的姬松茸菌株有 个，在该研究中也发现不同的姬松茸菌丝在最适菌丝生长温度上都有一定差异。菌种保藏的目的是为了尽可能保持菌种的原有性状以及活力的稳定，保证菌种不死亡、不发生变异、不会被外物污染，保持菌株的优良性状不发生退化以及优良菌株的存活，关于姬松茸菌种资源的保藏更是鲜有报道，尹中杰 的研究中已发现，姬松茸属于耐高温菌种，其菌株在 保存时，最多能保存，大于 后菌种不会萌发出现死亡，且保存对姬松茸的多酚氧化酶活性、酯酶酶带、过氧化物酶带、蛋白酶酶带有一定的影响。刘新锐等发明了一种姬松茸菌种液氮保藏 方 法，程 序 为 常 温 下 以 降 至，再以 降到，后放入液氮罐中保存。液氮保藏法保藏时间久，同时也不需周期性活化移植，因此可以防止因污染、继代等造成的菌种退化问题，但液氮保藏系统成本极高，甚至普通的菌种保藏中心都不会单独依靠这一门保藏技术，还需要多种保藏方式进行备份保藏 ，因此该研究参考该专利发明的保藏参数采用超低温冰箱保藏，方法为将冻存管在 冰箱预冷，然后放入 冰箱再预冷，最后放入 冰箱中保藏，保藏水溶液的最佳配方为 甘油与蔗糖按配置，该方法保藏时间在个月之内保藏效果均无显著差异，表明该方法可行，该研究的局限性在于只做了个月的保藏时间梯度，保藏时间是否还能延长还需进一步验证。参考文献岩出亥之助，伊滕均 奇跡姬 东京：地球社，水野卓，黄年来姬松茸及药效江苏食用菌，（）：程方慧，张瑞溪，付钰涓，等姬松茸及其活性多糖药理作用研究进展 畜禽业，（）：林戎斌，林陈强，张慧，等姬松茸食药用价值研究进展食用菌学报，（）：第第 期期 北方园艺黄大斌，李开本，陈体强 姬松茸生物学特性研究初报中国食用菌，（）：江枝和，朱丹，杨佩玉 姬松茸生物学特性研究 食用菌学报，（）：陈胤姬松茸菌种特性与液氮保藏研究福州：福建农林大学，刘新锐，谢宝贵，邓优锦，等一种姬松茸菌种液氮保藏方法 中国：，朱华玲，班立桐，黄亮，等几种真姬菇菌种保藏方法的保藏效果对比 微生物学通报，（）：魏奇姬松茸多酚降血糖活性及其作用机制的研究福州：福建农林大学，黄秀治，蔡衍山 姬松茸的生物学特性和栽培技术 浙江食用菌，（）：王永庄，刘建华，班立桐，等 姬松茸的生物学特性及栽培技术要点天津农林科技，（）：刘娜，宋莹，张敏，等香菇继代培养对菌丝特性和显微结构的影响北方园艺，（）：尹中杰低温保存对姬松茸菌株碳氮利用能力和几种酶活性及同工酶谱的影响 延吉：延边大学，刘红，黄建军，许丽娟，等谈食用菌菌种的保藏现代农业科技，（）：刘萍，姜晓坤食用菌菌种的基本保藏方法种子，（）：，（，）：，：；北方园艺月月（上上）