真核表达纯化的SARS-C...群血清检测中的应用性能分析_杨燕.pdf

病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月真核表达纯化的 SARSCoV2 N 蛋白在不同人群血清检测中的应用性能分析杨燕1，王慧娟2，黄梦婧3，黄保英2，赵莉2，邓瑶2，沈晓玲3，谭文杰1，2*（1.温州医科大学 检验医学院 生命科学学院，浙江省医学遗传学重点实验室 325035；2.中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，国家卫生健康委员会生物安全重点实验室，北京 102206；3.内蒙古医科大学 基础医学院微生物教研室，呼和浩特 010010）摘要：通过真核系统表达纯化新型冠状病毒（SARSCoV2）的全长核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，N 蛋白），分析其抗原性与应用性能。将 SARSCoV2 N 蛋白表达质粒转染 HEK293T 细胞后，通过 Western Blot和免疫荧光验证蛋白表达以及表达定位。对 N 蛋白进行纯化后，通过 Western Blot和 ELISA 并采用多种血清样本（WHO 参比品血清、正常人血清、新冠灭活疫苗接种后血清、新冠感染者恢复期血清）对该 N 蛋白在血清抗体检测中的应用性能进行分析。比较真核系统与原核系统表达的 N 蛋白抗原性上的差异，并分析基于真核系统表达 N 蛋白构建的 IgG 抗体 ELISA 检测体系与获批的商品化新冠 RBD（Receptor binding domain）IgG抗体 ELISA 检测试剂盒及用于检测中和抗体的活病毒微量中和试验结果间的相关性。结果显示，真核系统表达的全长 N 蛋白主要定位于胞质，作为抗原检测新冠 IgG 抗体，具有比原核系统表达的 N 蛋白更高的检测灵敏度。针对新冠感染者恢复期血清，基于哺乳动物细胞表达的 N 蛋白构建的 ELISA 体系检测的 IgG 抗体滴度与试剂盒检测的 RBDIgG 抗体滴度以及中和抗体滴度之间具有良好的相关性。本研究表明真核系统表达纯化的 SARSCoV2 N 蛋白具有良好的抗原性与检测性能，为 SARSCoV2血清学检测方法的建立与优化以及进一步明确 N蛋白诱发的免疫反应特点提供了参考。关键词：新型冠状病毒；核衣壳蛋白；真核表达；抗原性；ELISA中图分类号：R373.1 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02031309DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004278截 至 2022 年 7 月 1 日，新 型 冠 状 病 毒 肺 炎（COVID19）疫情已在全球造成超过 5 亿人感染，630 万人死亡1，其病原体新型冠状病毒（SARSCoV2）含有四种结构蛋白，分别为刺突蛋白（Spike protein，S 蛋白）、核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，N 蛋白）、包膜蛋白（Envelope protein，E 蛋白）、膜蛋白（Membrane protein，M 蛋白），在病毒的生命周期中发挥不同的作用。其中 N 蛋白与病毒 RNA 结合形成核糖核蛋白复合体，参与病毒的复制，组装和释放过程2。针对抗体的血清学检测可以反映机体的免疫水平，提供流行病学数据以及评估疫苗免疫后的效力。SARSCoV2 作为一种新发现的病毒，其血清学检测技术已得到广泛应用但仍待评价优化，其各个主要抗原诱发的的抗体反应特点及其生物学意义仍有待阐明。N 蛋白是冠状病毒中含量最丰富的蛋白，具有较强的免疫原性，可以诱发机体产生高水平的抗体，并且在感染的早期阶段，利用 SARSCoV2 N 蛋白进行抗体检测比 S 蛋白更灵敏；N 蛋白可在临床症状出现前 1 d检测到，是最理想的感染早期诊断标志物之一35。因此无论是 N 蛋白还是针对 N 蛋白的抗体，均是检测 SARSCoV2 感染的重要靶标6。目前用于新冠血清学检测的 SARSCoV2 N 蛋白主要采用原核表达系统尤其是利用大肠杆菌进行表达7，但是由于原核表达系统不能进行翻译后的折叠、修饰等加工过程，表达的 N 蛋白在结构、功能和生物学活性上可能与天然蛋白存在一定差异8。SARSCoV2 N 蛋白本身是二聚体结构，包含众多修饰（如磷酸化，乙酰化），因此利用大肠杆菌表达 N蛋白无法完全还原其自然构像9。采用真核系统表达纯化 N 蛋白进行生物学结构与功能研究理论上具有更高的科学性，其在 SARSCoV2 血清学检测中的应用及性能分析尚未见报道。本研究构建 SARSCoV2 全长 N 蛋白真核表达质粒，利用 293T 细胞快速制备与纯化了 N 蛋白，收稿日期：20220712；接受日期：20220922基 金 项 目：北 京 市 科 学 技 术 委 员 会（项 目 号：Z211100002521017），题目：变异毒株生产用疫苗株筛选及有效成分检测方法研究作者简介：杨燕（1997），女，从事冠状病毒相关研究，Email：通讯作者：谭文杰（1966），男，研究员，从事冠状病毒和痘病毒相关研究，Email：开放科学（OSID）病 毒 学 报39卷比较其与大肠杆菌表达的 N 蛋白在抗原性及应用性能上的差异。采用多种血清分析了其 IgG 抗体检测结果与获批商品化新冠 IgG 抗体检测试剂盒的符合率，以及与 RBD IgG 抗体检测试剂盒与活病毒微量中和试验结果的相关性，为 SARSCoV2 血清学检测方法的建立、优化与应用并进一步明确其免疫应答特点提供了参考数据。材料与方法1 主要试剂与仪器DMEM 培 养 基、FBS（美 国 Gibco 公 司）；HP DNA 转染试剂（Roche，瑞士）；LabTek腔室盖玻片（Thermo Fisher）；质粒大提试剂盒（TIANGEN，中国）；抗 SARS CoV 2 N 蛋 白 小 鼠 单 克 隆 抗 体（ABMAX，中 国）；红 外 标 记 山 羊 抗 小 鼠 IgG（Abbkine，中国）；FITC 标记山羊抗小鼠 IgG（中杉金桥，中国）；Histrap镍离子亲和层析柱及 AKTA 蛋白纯化系统（美国 GE 公司）；BCA 蛋白定量试剂盒（TIANGEN，中国）；抗人 IgGHRP（Sigma，美国）；新型冠状病毒 IgG 抗体 ELISA 检测试剂盒（Cat.No：COV0296，购自北京万泰生物公司）；新型冠状病毒 RBDIgG 抗体 ELISA 检测试剂盒（Cat.No：DD3103，购自南京诺唯赞公司）；激光扫描共聚焦显微镜（Leica）。2 细胞、质粒、蛋白、血清人类胚胎肾脏细胞（HEK293T，购自 ATCC，本 科 室 保 存）使 用 含 10%胎 牛 血 清（FBS）的DMEM 于 37，5%CO2培 养 箱 中 孵 育。SARSCoV2 N 基因真核表达质粒 pcDNA3.1N 由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，是将 SARSCoV2（武汉原型株，GISAID 序列号：EPI_ISL_402119）全长N 蛋白编码基因经过哺乳动物细胞偏爱的密码子优化，插 入 到 带 有 6His 标 签 的 真 核 表 达 载 体 pcDNA3.1中构建而成（图 1A），经酶切鉴定（图 1B）与测序确定构建正确，进行质粒提取纯化后转染293T 细胞，通过 SDSPAGE 凝胶电泳后利用考马斯亮蓝染色及 Western Blot 进行表达检测与验证。原核表达纯化的 SARSCoV2（武汉原型株）N 抗原蛋白由中国科学院微生物研究所宋豪博士惠赠10。血清样本盘为 7 例 WHO 参比品血清（WHO 提供，其中 H 为正常阴性对照血清，其他为新冠感染后不同抗体滴度血清）、56 例健康人血清（2010 年采集，由本科室收集保存）；100例新型冠状病毒灭活疫苗两针免疫后人群血清（免疫后 1 个月、3 个月各 50例）（由北京生物制品研究所惠赠）；95 例新冠肺炎康复人群血清（愈后 6 个月，于 2021 年 1 月份采集，感染的病毒分型为 614G，为欧美流行株输入），血清采集人群为 1859 岁，均签署知情同意书，血清采集获得中国疾病预防控制中心医学伦理委员会伦理批准（批准文号：202101）。3 Western Blot分析Western Blot方法简述如下：分别将 pcDNA3.1N、pcDNA3.1 空载体（Mock）质粒通过 HP 试剂转染 HEK293T 细胞，72 h 后收集细胞裂解液或细胞培养上清中的蛋白样本。蛋白样本加入 5loading buffer 煮沸 10 min，经 SDSPAGE 凝胶电泳后转膜（硝酸纤维素膜），以抗 SARSCoV2 N 蛋白小鼠单克隆抗体作为一抗，红外标记山羊抗小鼠 IgG 作为二抗进行检测。4 间接免疫荧光检测分 别 将 pcDNA3.1 N、pcDNA3.1 空 载 体（Mock）转染 HEK293T 细胞（腔室盖玻片），72 h后以抗 SARSCoV2 N 蛋白小鼠单克隆抗体为一抗，FITC 标记山羊抗小鼠 IgG 作为二抗进行免疫荧光检测，加入 4，6二脒基2苯基吲哚（4，6diamidino2phenylindole，DAPI）进行染色后于共聚焦显微镜下观察。5 N蛋白的纯化将细胞量扩大到 12个 T75培养瓶，待细胞密度为 80%90%时将 pcDNA3.1N 质粒按 20g/瓶通过 HP 试剂瞬时转染 293T 细胞，72 h 后弃去培养瓶中的培养基，加入 buffer A（20 mM Tris，150 mM NaCl，20 mM 咪唑，pH=8）后反复冻融收集细胞沉淀，在冰浴状态下超声波破碎细胞，离心后收集上清中蛋白样品，使用 0.45m 滤膜过滤，以镍离子亲和层析柱进行 SARSCoV2 N 蛋白纯化，使用 buffer A 和 buffer B（20 mM Tris，150 mM NaCL，500 mM咪唑，pH=8）进行蛋白梯度洗脱，收集各咪唑浓度下的洗脱液，SDSPAGE 凝胶电泳后进行考马斯亮蓝染色并使用 ImageJ 软件分析蛋白纯度。纯化的蛋白通过 BCA蛋白定量试剂盒进行定量。纯化的 SARSCoV2 N 蛋白通过 Western Blot分析其抗原性，方法同前。6 间接 ELISA将 SARS CoV 2 N 蛋 白 以 100ng/孔 包 被 于ELISA 96孔板，将待测血清从 1 100进行梯度稀释后加入孔中作为一抗，以抗人 IgGHRP作为二抗进 3142期杨燕，等.真核表达纯化的 SARSCoV2 N蛋白在不同人群血清检测中的应用性能分析行酶联免疫反应。读取 450nm 和 630nm 处的吸光度（A）值，计算两者的差值，A 值cutoff（40份疫苗免前已验证为阴性的健康对照血清均值的 2.1 倍）值判定为阳性，以阳性样本最高血清稀释度的倒数为抗体滴度。新型冠状病毒 IgG 抗体 ELISA 检测试剂盒（万泰）检测 100例疫苗免疫后血清；新型冠状病毒 RBDIgG 抗体 ELISA 检测试剂盒（诺唯赞）检测 56例健康人及新冠肺炎康复者血清，皆按说明书进行操作。7 微量中和试验所有 SARSCoV2 活病毒的操作均在 BSL3实验室开展。血清样品从 1 4 开始进行 2 倍梯度稀释，与 等 体 积 100 CCID50的 SARS CoV 2 毒 株19nCoVCDCTanStrain03 混合，37孵育 2 h，之后加入 2104/孔的 Vero 细胞，4 d 后观察细胞病变（Cytopathic effect，CPE），将可保护 50%细胞免受细 胞 病 变 的 血 清 最 高 稀 释 度 的 倒 数（50%neutralization titer，NT50）作为中和抗体滴度。8 统计学方法与试剂盒结果相比，计算真原核表达的 N 蛋白检测 IgG 抗体的符合率，使用 GraphPad Prism 9 软件制图并进行统计学分析，计数资料采用 2检验，采用 Pearson 相关系数（r）确定两组间相关性，P0.05表示差异有统计学意义。结果1 pcDNA3.1N的酶切与表达鉴定SARSCoV2 N 蛋白真核表达质粒 pcDNA3.1N 的合成构建（图 1A），使用 BamHI 和 XbaI限制性内切酶对该质粒进行酶切，在 1 000 bp1 500 bp 之间出现阳性条带，酶切片段长度符合理论值（图1B），之后经测序验证序列正确。将 pcDNA3.1 空 载 体（作 为 阴 性 对 照）、pcDNA3.1N 质粒转染 HEK293T 细胞收获的细胞裂解液及细胞培养上清进行考马斯亮蓝染色及Western Blot，考染结果显示在 43 kD55 kD 之间与阴性对照相比，细胞裂解液出现明显条带，而细胞培养上清条带加深不明显；使用 N 蛋白小鼠单克隆抗体进行 Western Blot 结果显示，表达的 N 蛋白可以与小鼠抗体特异性结合，并且在细胞培养上清中也可见 N 蛋白的少量表达（图 1C）。免疫荧光结果显示（图 1D）绿色荧光信号仅出现于胞质，表明 N 蛋白表达于胞质，未在胞核表达。2 真核表达 N蛋白的纯化、生物活性验证及与原核表达 N蛋白抗原性的比较N 蛋白的纯度随洗脱液中咪唑浓度的升高而增加，在 250 mM 咪唑浓度下得到的 N 蛋白纯度经分析高于 90%，可用于后续的研究（图 2A），并且纯化的 N 蛋白可以与小鼠单克隆抗体特异性结合（图2B）。使用纯化的 N 蛋白为包被抗原建立的 ELISA体系检测 WHO 7 份参比品血清，并进行三次独立重复实验，结果显示，阳性样品均可检出，与预期结果一致，说明真核表达的 N 蛋白具有较高的检测灵敏度和特异度（图 2C）。在相同蛋白量的情况下，真核表达 N 蛋白与抗新冠 N 蛋白的小鼠单克隆抗体结合的条带更明显，灰度扫描结果也显示，其灰度值更高（图 2D）。对 100例疫苗免疫后人群血清分别使用商品化试剂盒、以真核或原核表达 N 蛋白为包被抗原建立的 ELISA 检测体系进行 IgG 抗体检测，结果显示与试剂盒检测结果相比，真核或原核表达 N 蛋白检测的阳性符合率分别为 86.5%和 56.3%（表 1）。另外对 56 例健康人血清使用商品化试剂盒检测结果均为阴性，与试剂盒相比，真核或原核表达 N 蛋白检测的阴性符合率均为 91.1%（51/56）。以上结果表明，基于真核或原核表达的 SARSCoV2 全长 N 蛋白建立的 ELISA 体系检测新冠IgG 抗体存在一定的非特异反应，但真核表达的 N蛋白具有更强的抗原活性，用于疫苗接种后新冠IgG抗体检测灵敏度更高。3 新冠肺炎康复人群血清中 N 蛋白 IgG 抗体水平与 RBDIgG 抗体及中和抗体水平间的相关性分析使用活病毒微量中和试验、商品化 RBDIgG 抗体检测试剂盒、以哺乳动物细胞表达的 N 蛋白构建的 IgG 抗体 ELISA 检测体系分别对 95 例新冠肺炎康复人群的中和抗体、RBDIgG抗体、NIgG抗体进行检测。三种抗体检出阳性率分别为 89.47%（85/95）、94.74%（90/95）和 93.68%（89/95）（2=2.159，P=0.33970.05），三种抗体阳性检出率间无显著差异（图 3A）。对三种抗体水平两两间进行定量相关性分析，结果显示中和抗体滴度与 RBDIgG 抗体滴度相关性最强（r=0.84，P0.0001）（图 3B），NIgG 抗 体 滴 度 与 中 和 抗 体（r=0.70，P0.0001）、RBDIgG 抗体（r=0.71，P0.0001）之间相关性也较显著（图 3C、3D）。315病 毒 学 报39卷讨论N 蛋白作为 SARSCoV2 重要的结构蛋白，其生物学特性以及在血清学检测中的应用价值仍有待明确。对冠状病毒的研究表明，N 蛋白含有核定位信号，能够表达于核仁干扰宿主蛋白的转录和翻译，而 严 重 急 性 呼 吸 综 合 征 冠 状 病 毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARSCoV）N 蛋白表达于胞质12，13。本研究的间接免疫荧光实验结果表明，SARSCoV2 的 N 蛋白也表达于胞质。N蛋白是唯一能结合病毒核酸的蛋白，本身无外分泌信号肽，但是本研究的结果显示，其可以少量外分泌表达，相关研究显示 N 蛋白为感染早期血清中含量最高的病毒蛋白14，除了其本身表达量高以外，可能与外分泌表达的特性也有关系。研究表明利用重组杆状病毒系统在昆虫细胞中制备的 SARSCoV N 蛋白为高度磷酸化形式，而在大肠杆菌中表达的 N 蛋白为非磷酸化形式，磷酸化提高了蛋白检测特异性抗体的灵敏度15；在酵母细胞中表达的 SARSCoV N 蛋白以及在植物细胞中表达的 SARSCoV2 N 蛋白，也得出了相同的结图 1SARSCoV2 N蛋白真核表达质粒的合成构建鉴定及表达验证注：A：pcDNA3.1N质粒合成构建示意图；B：双酶切验证（箭头标示载体中插入的 N基因片段）；C：考马斯亮蓝染色及 Western Blot验证 SARSCoV2 N蛋白真核表达（箭头标示 SARSCoV2 N 蛋白）；D：间接免疫荧光验证 SARSCoV2 N蛋白真核表达（N蛋白小鼠单抗孵育细胞（绿色）；DAPI染色细胞核（蓝色）；Merge：绿色荧光和蓝色荧光的融合）Figure 1Construction identification and expression verification of eukaryotic expression plasmid for SARSCoV2 N proteinNotes：A：Schematic diagram of plasmid construction；B：Restriction enzyme digestion of plasmid；C：Coomassie brilliant blue staining and Western Blot to verify protein expressed by eukaryotic hosts；D：Indirect immunofluorescence to verify protein expressed by eukaryotic hosts（N protein mouse monoclonal antibody incubated cells（green）；Nuclei were counterstained with DAPI（blue）；Merge：fusion of green fluorescence and blue fluorescence）3162期杨燕，等.真核表达纯化的 SARSCoV2 N蛋白在不同人群血清检测中的应用性能分析图 2真核表达 SARSCoV2 N 蛋白的纯化、生物活性验证及其与原核表达 N蛋白抗原性的比较注：A：纯化过程各组分中蛋白的考马斯亮蓝染色结果；B：Western Blot验证纯化 N蛋白与小鼠单克隆抗体的结合能力；C：ELISA验证纯化N蛋白与 WHO参比品血清的结合能力（H：阴性样品；C、D、I：低滴度样品；B、E、J：中高滴度样品；以 H三次独立重复实验结果均值的 2.1倍划定为 cutoff=0.225）；D：Western Blot分析真核与原核表达的 SARSCoV2 N蛋白抗原性（红色标注区域各条带进行灰度值扫描，具体数值标示在方框上）Figure 2Purification and biological activity verification of eukaryotic expressed SARSCoV2 N protein and comparison of its antigenicity with prokaryotic expressed N proteinNotes：A：Coomassie brilliant blue staining results of protein in each component of the purification process；B：Western Blot verification of the binding ability of purified N protein to mouse monoclonal antibody；C：The binding ability of purified N protein to WHO reference serum was verified by ELISA（H：negative samples；C，D，I：low titer samples；B，E，J：medium and high titer samples；cutoff=0.225）；D：Western Blot was used to analyze the antigenicity of SARSCoV2 N protein expressed in eukaryotic and prokaryotic system表 1对疫苗免疫后人群使用以真核或原核表达 N蛋白为包被抗原的 ELISA与商品化新冠 IgG抗体检测试剂盒结果的定性比较Table 1Qualitative comparison of antibody detection results among inactivated vaccine recipients between N protein（derived from eukaryotic or prokaryotic system）based ELISA and commercial ELISA kits for SARSCoV2 IgG antibodyN（Eukaryotic）basedELISAN（Prokaryotic）basedELISAIgG+IgGIgG+IgGCommercial ELISA kits for SARSCoV2 IgGIgG+（96）83135442IgG（4）3113Positive coincidence rate（%）86.556.3 317病 毒 学 报39卷论11，16。本研究 Western Blot 以及 ELISA 结果表明，哺乳动物细胞表达的 N 蛋白与大肠杆菌表达 N蛋白相比，与抗新冠 N 蛋白的小鼠单克隆抗体结合能力更强，具有更高的检测灵敏度，与商品化新冠IgG 抗体检测试剂盒结果也具有更高的符合率。因此真核系统表达的 N 蛋白更适合作为检测抗原，具有更优越的检测性能。以哺乳动物细胞表达的 N蛋白构建的 IgG 抗体 ELISA 检测体系检测疫苗免疫后 1 个月与 3 个月样本时与本研究所使用的商品化试剂盒检测结果的阳性符合率为 86.5%，一方面由于试剂盒没有说明所包被的是新冠病毒的何种抗原，可能同时包被 S蛋白和 N 蛋白，用以提高检测灵敏度，而疫苗免后主要为 S蛋白诱导抗体免疫应答，因此构建的 N 蛋白 IgG 抗体 ELISA 检测体系与试剂盒检测结果会存在差异，相关研究也报道了不同试剂盒在反映疫苗免疫后样本的抗体水平上会存在区别，仍需要进行进一步的验证17；另一方面针对SARSCoV2不同抗原的抗体变化规律可能存在区别，Li等的研究显示 SARSCoV S 蛋白抗体与 N 蛋白抗体相比，持久性更强18。因此 SARSCoV2 N蛋白在用于疫苗免疫后样本的检测上的应用需要更深入的研究。通过活病毒中和试验检测中和抗体是反映机体免疫保护水平的金标准19。本研究使用活病毒微量中和试验、商品化 RBDIgG 抗体检测试剂盒、以哺乳动物细胞表达的 N 蛋白构建的 IgG 抗体 ELISA检测体系分别对新冠肺炎康复人群的中和抗体、RBDIgG 抗体、NIgG 抗体进行检测，结果表明，三者的检出阳性率（89.47%、94.74%、93.68%）经卡方检验无统计学差异，进一步表明构建的 ELISA 检测 A B C D 图 3新冠肺炎康复者中 NIgG 抗体、RBDIgG 抗体及中和抗体水平分析注：A：中和抗体、RBDIgG、NIgG抗体滴度及检出阳性率；B：中和抗体与 RBDIgG抗体相关性分析；C：中和抗体与 NIgG抗体相关性分析；D：RBDIgG与 NIgG抗体相关性分析。虚线代表 cutoff值，中和抗体 cutoff=0.602；RBDIgG cutoff=1；NIgG cutoff=2 Pearson相关系数（r）代表的相关性强弱：0.000.19，非常弱；0.200.39，弱；0.400.59，中等；0.600.799，强；0.801.00，非常强11Figure 3Analysis of NIgG antibody、RBDIgG antibody and neutralizing antibody in the convalescent serum of COVID19Notes：A：Antibody titer and positive rate of neutralization antibody，RBDIgG and NIgG；B：Correlation analysis of neutralization antibody and RBDIgG；C：Correlation analysis of neutralization antibody and NIgG；D：Correlation analysis of RBDIgG and NIgG.The dotted line represents the cutoff value，the neutralizing antibody cutoff=0.602；RBDIgG cutoff=1；NIgG cutoff=2.The interpretations of Pearsons correlation coefficient（r）were characterized as follows：0.000.19，very weak；0.200.39，weak；0.400.59，moderate；0.600.799，strong；and 0.801.00，very strong11 3182期杨燕，等.真核表达纯化的 SARSCoV2 N蛋白在不同人群血清检测中的应用性能分析体系具有较高的灵敏度。NIgG 抗体与中和抗体（r=0.70，P0.0001）和 RBDIgG 抗体（r=0.71，P0.0001）均具有显著的相关性，表明检测结果之间具有良好的一致性。Deshpande 的研究比较了使用 N蛋白 IgG 抗体检测试剂盒与中和试验检测新冠肺炎患者血清的结果，结果表明试剂盒具有良好的检测灵敏度和一致性19。但 McAndrews 的研究显示仅有 74%的 N 蛋白抗体阳性的新冠患者血清表现出了中和活性，并警告不能仅凭对 N 蛋白的抗体检测来判定机体潜在的免疫水平20。因此，针对 N 蛋白的抗体与保护性抗体之间的关系以及其是否也具有一定的中和作用需进一步研究。另一方面，在检测健康人血清时，使用 RBDIgG 抗体检测试剂盒检测结果均为阴性，而 N 蛋白无论是真核表达还是原核表达均检测到部分假阳性结果，表明用全长 N 蛋白进行抗体检测时，存在一定交叉作用。相关研究也表明，SARSCoV2 的 N蛋白与其他冠状病毒 N 蛋白均具有一定同源性，其中与 SARSCoV N 蛋白的氨基酸序列相似度在90%左 右，而 两 种 病 毒 的 RBD 相 似 度 为73.71%20。提示在用全长 N 蛋白进行抗体检测时需结合其他检测结果综合分析。但也正是由于 N蛋白的保守稳定性，其在作为广谱保护性疫苗研发及 药 物 筛 选 方 面 具 有 一 定 的 优 势，是 潜 在 的靶点21。总 之，本 研 究 基 于 哺 乳 动 物 细 胞 表 达 的SARSCoV2 N 蛋白建立的 IgG 抗体检测体系具有良好的检测性能，但由于在样本类型及数量上有一定局限性，因此仍需要进一步验证，关于 N 蛋白的免疫学特性及其在反映机体免疫水平方面的应用也需要更深入的研究。（致谢：中国科学院微生物研究所宋豪博士惠赠原核表达纯化的 SARSCoV2 N 抗原蛋白；北京生物制品研究所惠赠疫苗免后血清）参考文献：1 World Health Organization.Coronavirus disease（COVID 19）outbreak situationEB/OL.（2022 07 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