人教版教学生物选修1之蛋白质的提取和分离公开课获奖课件.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第1页,血红蛋白具有四条肽链,每条肽链围绕一种亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因具有血红素而呈红色。,第2页,课题,3,血红蛋白提取和分离,专题,5 DNA,和蛋白质技术,第3页,一、基础知识,:,学生活动,1:,1,、分离生物大分子基本思绪是什么？,2、不一样样蛋白质特性在哪些方面存在差异？,3、本课题我们将运用血红蛋白与杂质蛋白哪方面差异进行提纯？,4,、为何不用鸡血红细胞而用人血红细胞作为试验材料？,5、用什么措施分离相对分子质量不一样样蛋白质？,第4页,一、,基础知识,-,蛋白质提取和分离原理,蛋白质提取与分离根据蛋白质物理化学性质：,形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、,亲和力等千差万别。,提取分离方法,凝胶色谱法,凝胶电泳法,第5页,（,1,）原理：,（,2,）材料,大分子通过多孔凝胶颗粒间隙，旅程短，流动快；,小分子穿过多孔凝胶颗粒内部，旅程长，流动慢。,多孔性多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。,(,一,),凝胶色谱法,第6页,（,3,）分离过程,混合物,上 柱,洗,脱,大分子流动快,小分子流动慢,收 集,大分子,收 集,小分子,洗脱：从色谱柱上端不停注入缓冲液，,促使蛋白质分子差速流动。,(,一,),凝胶色谱法,第7页,(,一,),凝胶色谱法,第8页,凝胶色谱法（分派色谱法）：,1,、什么是凝胶？,2,、什么是凝胶色谱法？,学生活动,2:,3,、凝胶色谱法原理是什么？,4、请用自己话总结出凝胶色谱法分离相对分子质量不一样样蛋白质详细过程。,第9页,第10页,1,、什么是缓冲液？,2,、缓冲液作用是什么？,学生活动,3:,3,、缓冲液是怎样配制？你所学过人体,血液缓冲物质有哪些？,4,、本试验加是什么缓冲液？为何要加缓冲液？,（二）、缓冲溶液,第11页,由弱酸和对应强碱弱酸盐构成。,如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠，NaH2PO4/Na2HPO4等,缓冲溶液洗脱剂,构成：,配制：,作用：,调整缓冲剂比例，可配制不一样样pH缓冲液。,抵制外界酸碱对溶液,pH,干扰而保持,pH,稳定。,（二）、缓冲溶液,第12页,1,、什么是电泳？,2,、影响电泳迁移速度原因有哪些？,学生活动,4:,4、电泳分离多种分子原理是什么？,（三）、电泳,3,、怎样消除电荷对电泳迁移速度影响？,5,、请描述电泳过程？,第13页,2,凝胶电泳法：,（,1,）原理：,不一样样蛋白质带电性质、电量、形状和大小不一样样，,在电场中受到作用力大小、方向、阻力不一样样，,导致不一样样蛋白质在电场中运动方向和运动速度不一样样。,影响蛋白质分子运动速度原因,(,三,),电泳,1.,电泳概念,指带电粒子在电场作用下发生迁移过程,.,第14页,影响蛋白质分子运动速度原因,决定,运动方向,形成,库仑力,形成,阻力,决定,运动速率,电荷性质,电荷量,分子形状,分子大小,第15页,在一定,pH,下，使蛋白质基团带上正电或负电；,加入带负电荷多,SDS,，形成,“,蛋白质,SDS,复合物,”,，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。,（2）分离措施：,（3）分离过程：,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等,。,(,三,),电泳,第16页,电泳检测成果,琼脂糖凝胶电泳,第17页,二、试验操作,蛋白质提取和分离一般分为四步：,（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作搜集到血红蛋白溶液。,（2）粗分离：透析除去分子较小杂质。,（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大杂质蛋白质除去。,（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,第18页,（一）样品处理,1、红细胞洗涤：,目旳是清除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。,2、血红蛋白释放：,在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放,3、分离血红蛋白溶液：,离心分层；滤纸过滤清除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。,4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。,第19页,样品处理,粗 分 离,纯 化,纯度判定,血液组成成份,1.,洗 涤 红 细 胞,2.,释放血红蛋白,3.,分离血红蛋白,4.,透析血红蛋白,二、试验操作,第20页,血液构成成分,阅读思索：,血液由_和_两部分构成。,血细胞中_细胞数量最多，红细胞含量最高有机化合物是_。,该化合物是由 _和_构成，其中每个亚基中都具有一种能与O2和CO2结合_基团。,血浆,血细胞,红细胞,血红蛋白,2,条,-,肽链,2,条,-,肽链,亚铁血红素,课题,3,血红蛋白提取与分离,返回,第21页,1.,洗 涤 红 细 胞,阅读思索：洗涤目旳是什么？,洗涤过程：,血液,100mL,3g,柠檬酸钠,低速离心,2 min,红细胞,血 浆,吸出血浆,红细胞,5,倍体积生理盐水,搅拌,10min,反复洗涤3次，直至上清液没有黄色,课题,3,血红蛋白提取与分离,第22页,采集得到鸡血,第23页,初次离心后成果,第24页,3次洗涤后成果,返回,第25页,2.,释放血红蛋白,阅读思索：,释放血红蛋白过程中，在洗涤好红细胞加入了哪些物质？,为了加速释放过程，采用了什么措施？,目旳分析：,蒸馏水作用是_。,加入甲苯作用是_。,充足搅拌目旳是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞细胞膜,加速红细胞破裂,课题,3,血红蛋白提取与分离,第26页,(2),血红蛋白释放：,加蒸馏水到原血液体积，再加40体积甲苯，置于磁力搅拌器上充足搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。,第27页,磁力搅拌器,返回,第28页,3.,分离血红蛋白,分离过程,红细胞,混合液,高速离心,10min,离心管,滤纸,过滤,脂类物质,烧杯,课题,3,血红蛋白提取与分离,第29页,(3),分离血红蛋白溶液,：,过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以r/min速度离心10 min。试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置半晌后，分出下层红色透明液体。,第30页,甲苯层,（,无色透明,）,白色薄层固体,红色透明液体,杂质沉淀层,（,暗红色,）,试管中溶液层次,返回,第31页,课题,3,血红蛋白提取与分离,4.,透析血红蛋白,20mmol/L,磷酸缓冲液,1mL,1mL,第32页,运用透析袋透析,第33页,透析过程,返回,第34页,课题,3,血红蛋白提取与分离,纯化凝胶色谱操作,1.,凝胶色谱柱制作：,2.,凝胶色谱柱装填：,教材图,5,19,3.,样品加入和洗脱,第35页,（二）凝胶色谱操作,（1）凝胶色谱柱制作：取长40厘米，内径1.6厘米玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管一端。注意事项：底塞中插入玻璃管上部不得超过橡皮塞凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按对应位置组装成一种整体。安装其他附属构造。,第36页,装配好凝胶柱,第37页,返回,第38页,材料：交联葡聚糖凝胶,G-75,；,20mmol/L,磷酸缓冲液,装填,:,课题,3,血红蛋白提取与分离,2.,凝胶色谱柱装填：,步骤,操作要求,立即用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒洗脱液沸水浴,凝胶颗粒蒸馏水充足溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,第39页,（,2,）凝胶色谱柱装填,凝胶选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表达凝胶交联程度，膨胀程度及分离范围。75表达凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。,凝胶前处理：配制凝胶悬浮液：计算并称取一定量凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充足溶胀后，配成凝胶悬浮液。,凝胶色谱柱装填措施：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以减少凝胶颗粒之间空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：由于气泡会搅乱洗脱液中蛋白质洗脱次序，减少分离效果。,第40页,洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高操作压下，用300ml20mmol/l磷酸缓冲液（pH为7.0）充足洗涤平衡12小时。注意：1、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则也许有气泡混入，影响液体在柱内流动与最终身物大分子物质分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒现象。,第41页,3.,样品加入与洗脱,调整缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。,滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁围绕移动加样，同步注意不要破坏凝胶面。,样品渗透凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗透凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。,洗脱：小心加入pH=7.0 20mmol/l磷酸缓冲液到合适高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。,搜集：待红色蛋白质靠近色谱柱底端时，用试管搜集流出液，每5ml搜集一试管，持续搜集。（在分离过程中，假如红色区带均匀一致移动，阐明色谱柱制作成功）,注意：对旳加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁围绕移动。,第42页,3.,样品加入和洗脱,第43页,3.,样品加入与洗脱,注意：对旳加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁围绕移动。,第44页,搜集得到纯化后血红蛋白,第45页,课题,3,血红蛋白提取与分离,注意事项,1.红细胞洗涤：,洗涤次数不能过少；低速、短时离心。,2.凝胶预处理：,沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡,3.色谱柱装填：,装填尽量紧密，减少颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。,4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。,为何？,第46页,观测你处理血液样品离心后与否分层（见教科书图5-18），假如分层不明显，也许是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净红细胞，影响后续血红蛋白提取纯度。,三、试验成果分析与评价,1、你与否完毕了对血液样品处理？你能描述处理后样品发生了哪些变化吗？,第47页,三、试验成果分析与评价,2、你装填凝胶色谱柱与否有气泡产生？你色谱柱装填得成功吗？你是怎样判断？,由于凝胶是一种半透明介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直日光灯，检查凝胶与否装填得均匀。此外，还可以加入大分子有色物质，例如蓝色葡聚糖或红色葡聚糖，观测色带移动状况。假如色带均匀、狭窄、平整，阐明凝胶色谱柱性能良好。假如色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,第48页,假如凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也对旳话，能清晰地看到血红蛋白红色区带均匀、狭窄、平整，伴随洗脱液缓慢流出；假如红色区带歪曲、散乱、变宽，阐明分离效果不好，这与凝胶色谱柱装填有关。,3、你能观测到蛋白质分离过程中，红色区带移动吗？请描述红色区带移动状况，并据此判断分离效果？,三、试验成果分析与评价,第49页,课题,3,血红蛋白提取与分离,知识总结,血红蛋白提取和分离,蛋白质分子差异性,凝胶色谱法,原 理,分离过程,凝胶电泳法,缓冲溶液,组 成,作 用,蛋白质,提取分离,样品处理,粗 分 离,纯 化,纯度判定,第50页,教学反馈,1凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质有效措施。,A分子大小 B相对分子质量大小,C带电荷多少 D溶解度,2缓冲液作用是：在一定范围内，抵制外界影响来维持（）基本不变。,A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度,3电泳是指带电粒子在电场作用下向着与其所带电荷（）电极移动。,A相似 B相反 C相对 D相向,4.哺乳动物和人成熟红细胞中（）与氧气运送有关。,A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白,B,B,B,A,第51页,5血液由血浆和多种血细胞构成，其中（）含量最多。,A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞,6为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（）。,A.NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠,7将搅拌好混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中溶液分为4层，其中第3层是（）,A无色透明甲苯层 B脂溶性物质沉淀层,C血红蛋白水溶液 D其他杂质暗红色沉淀物,C,D,C,第52页,练习巩固,1、伴随人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质研究和应用越来越深入，首先要做一步是,A 弄清多种蛋白质空间构造,B 弄清多种蛋白质功能,C 弄清多种蛋白质合成过程,D 获得高纯度蛋白质,第53页,2、用凝胶色谱法分离蛋白质过程中，有关蛋白质论述，对旳是,A 相对分子质量较小蛋白质行程不小于相对分子质量较大蛋白质,B 相对分子质量较小蛋白质行程不不小于相对分子质量较大蛋白质,C 相对分子质量较小蛋白质行程等于相对分子质量较大蛋白质,D 两者主线无法比较,第54页,3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不一样样蛋白质电泳迁移率完全取决于,A 电荷多少 B 分子大小,C 肽链多少 D 分子形状差异,4、在采血容器中加入柠檬酸钠目旳是,A 调整pH B 维持红细胞能量供应,C 防止微生物生长 D 防止血液凝固,第55页,5,、一分子血红蛋白最多可携带,O,2,分子数和,CO,2,分子数分别是,A 4,、,2 B 4,、,4,C 2,、,1 D,、,1,、,1,6,、记住样品处理中血红蛋白溶液离心后分层次序,自上而下,是：,有,机溶剂,-,脂,类物质,-,血,红蛋白溶液,-,红,细胞破碎物沉淀,第56页,