鲜益母草提取物及其复方调节小鼠免疫力的药效研究_周丹英.pdf

Federation of American Societies for Experimental Biology，2000，14(2):418.19 孙旭日，李新丰，王伟，等.ac1 VEGF 在肝细胞癌中的表达和肿瘤血管形成关系 J.中国肿瘤临床，2013，40(4):5.20 张帅民，张毅，刘振华，等.钙激活中性蛋白酶抑制剂对肝癌细胞生物学行为及 Src 基因表达的影响及意义J.当代医学，2020，26(24):98-100.21 Da SM，Natali AJ，Da SE，et al.Attenuation of Ca2+homeostasis，oxi-dative stress，and mitochondrial dysfunctions in diabetic rat heart:in-sulin therapy or aerobic exercise J.Journal of Applied Physiology，2015，119(2):148-156.22 郭登方，王若涛，黄建成，等.姜黄素衍生物 C086 通过 PI3K-Akt通路诱导肝癌 HepG2 细胞凋亡J.中国老年学志，2021，41(06):1270-1274.23Chakraborty C，Mitra S，oychowdhury A，et al.Deregulation ofLIMD1-VHL-HIF-1-VEGF pathway is associated with different sta-ges of cervical cancerJ.Biochemical Journal，2016，473(19):3221-3236.鲜益母草提取物及其复方调节小鼠免疫力的药效研究周丹英*，张娟，业康，黄晶晶，姚佳丽，金捷，金祖汉(浙江省中药研究所有限公司，浙江杭州 310023)摘要:目的研究鲜益母草提取物干粉及其复方对小鼠免疫力的影响。方法IC 小鼠连续给药 45 天后进行迟发性变态反应试验与单核巨噬细胞吞噬试验，考察其对小鼠免疫器官指数、外周血血细胞、耳肿胀以及吞噬速率、吞噬指数的影响。结果迟发性变态反应研究结果表明益母草干粉高、中剂量以及复方可显著提高小鼠耳肿胀水平，上调了机体免疫力;小鼠单核巨噬细胞吞噬功能研究结果中，益母草干粉高剂量与复方组可显著提高小鼠单核巨噬细胞吞噬速率，且高、中剂量与复方组吞噬指数较对照组有显著提高。结论鲜益母草提取物干粉及其复方可提高小鼠机体免疫水平。关键词:鲜益母草提取物;复方;免疫力中图分类号:95文献标识码:A文章编号:1006-3765(2023)-02-0014-04作者简介:周丹英，女。职称:高级工程师。主要从事中药与保健品的开发。基金项目:宁波市“科技创新 2025”重大专项(2019B10060)Study on Immune egulation of Fresh Leonurus japonicus Extract and ItsCompound in MiceZHOU Dan-ying*，ZHANG Juan，YE Kang，HUANG Jing-jing，YAO Jia-li，JIN Jie，JIN Zu-han(Zhejiang e-search Institute of Traditional Chinese Medicine Co.，Ltd.，Hangzhou 310023，China)ABSTACT:OBJECTIVEStudy on the effect of fresh Leonurus japonicus extract and its compound on the immu-nity of mice.METHODSAfter 45 days of continuous administration of fresh Leonurus japonicus extract and itscompound，the delayed type hypersensitivity test and the phagocytosis of mononuclear macrophage test were performedin IC mice to investigate the effects on the immune organ index，peripheral blood cells，ear swelling，phagocytosisrate and phagocytic index of mice.ESULTSThe results of delayed type hypersensitivity test showed that high andmedium doses of Leonurus japonicus extract and compound could significantly improve the level of ear swelling andenhance the immunity of mice;In the results of phagocytic function of mononuclear macrophages，the high dose andcompound group could significantly improve the phagocytic rate of mononuclear macrophages，and the phagocytic in-dexofhigh，mediumdoseandcompoundgroupwassignificantlyhigherthanthatofthecontrolgroup.CONCLUSIONThe extract of fresh Leonurus japonicus and its compound can improve the immune level ofmice.KEY WODS:Fresh Leonurus japonicus extract;Compound;Immunity41海峡药学2023 年第 35 卷 第 2 期益母草为唇形科植物益母草 Leonurus japonicus Houtt.的新鲜或干燥地上部分，苦、辛，微寒1。具有活血通经、利尿消肿的功效，目前临床常用于痛经、功能性子宫出血等妇科疾病的治疗2，近年来在免疫系统方面，益母草的药效研究也有着较大的进展3。此试验拟研究鲜益母草干粉及其复方对小鼠迟发性变态反应与小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响，明确其药效作用。1材料与试剂1.1材料鲜益母草干粉:鲜品经提取、浓缩、喷雾干燥后制得(得率为 5%)，浙江省中药研究所有限公司自制，批号:210705;鲜益母草复方:浙江省中药研究所有限公司工程室，批号:210930;二硝基氯苯:Fluorochem 公司，批号:FCB037434;印度墨汁:北京诺博莱德科技有限公司，批号:20200510;无水碳酸钠:国药集团化学试剂有限公司，批号:20190801。1.2动物IC 小鼠，40 只，清洁级，雌性，体重18 21 g，由杭州医学院提供，动物质量合格证号:20210426Abzz0100018517。饲养于清洁级动物房内，温度 20 26，相对湿度 40 70%，光照明暗交替各 12 h，通风15 次/h;动物使用设施条件合格证号:SYXK(浙)2018-0011。1.3仪器全自动血液分析仪:XT-2000i，日本 SYSMEX 公司生产;分析天平:ME204，METTLE TOLEDO 公司生产;多功能酶标仪:M200 PO，意大利 TECAN 公司生产。2方法2.1剂量与分组鲜益母草干粉给药剂量:低、中、高剂量组小鼠每日给药剂量分别为 0.05 gkg1、0.10 gkg1、0.30gkg1，使用纯净水充分溶解后经口灌胃给药。剂量折算:益母草鲜品经提取、浓缩、喷雾干燥后得率为 5%，药典鲜品用量为 12 40 g，故对应鲜益母草喷雾粉用量 0.6 2.0 g，以60 kg 成人体重换算给药剂量为 0.01 0.033 gkg1，则小鼠给药剂量为0.1 0.33 gkg1，以0.30 gkg1为高剂量，0.10 gkg1为中剂量，0.05 gkg1为低剂量。鲜益母草复方制备方法:加入药材(鲜益母草 24 g、人参1.5 g，川芎 4 g)，纯水提取 2 次，每次提取 1 h，2浓缩、离心、喷雾干燥后得到，得率约 11%。剂量折算:鲜益母草复方成人日用剂量为 1 日 3.27 g，折算成小鼠给药剂量为 0.545 g/(kgd)。试验共分为 5 组，每组 8 只小鼠，分别为对照组、鲜益母草干粉高/中/低剂量组以及鲜益母草复方组，共连续给药 45天，对照组给予同等剂量的纯净水。2.2动物处理2.2.1迟发性变态反应实验:连续给药40 天后每只小鼠腹部皮肤脱毛，范围约3 cm 3 cm，用二硝基氯苯溶液 50 L 均匀涂抹致敏;5 天后，用二硝基氯苯溶液 10 L 均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击;攻击后 24 h 眼内眦取血置于 EDTA-2K 抗凝管中迅速摇匀，使用全自动血液分析仪进行血细胞分类计数检测，颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径 8 mm 的耳片，称重;取胸腺、脾脏，并称重。2.2.2单核巨噬细胞吞噬实验:末次给药 24 h 后各组别小鼠按体重从尾静脉注入稀释的印度墨汁(10 mLkg1)，待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后 2、10 min 分别从内眦静脉丛取血 20 L，并立即将其加到 2 mL 0.1%Na2CO3溶液中摇匀。以 Na2CO3溶液作空白对照，用酶标仪在 600 nm 波长处测光密度值(OD)。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数 a。受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。K=lgOD1 lgOD2t1 t1吞噬指数 a=体重肝重+脾重3k公式中 a:吞噬指数;K:廓清指数;OD1:t1时的吸光度值;OD2:t2时的吸光度值;t1:给墨汁后第 1 次取血的时间(2min);t2:给墨汁后第 2 次取血的时间(10 min)。2.3统计方法采用 SPSS 20.0 统计软件分析统计，以(xs)表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-T 法，P 0.05 为差异有统计学意义。3结果3.1迟发性变态反应实验3.1.1动物免疫脏器(胸腺、脾脏)指数:各给药组小鼠胸腺质量、脾脏质量以及胸腺、脾脏指数与对照组无显著性差异(P 0.05)(见表 1)。3.1.2外周血血细胞检测结果:白细胞计数结果显示，鲜益母草干粉高剂量组较对照组有显著提高(P 0.05);其他指标各组间无显著性差异(见表 2、3)。3.1.3耳肿胀检测结果:左右耳重量之差结果表明，鲜益母草干粉高、中剂量组以及复方组较对照组有显著提高(P 0.05)，低剂量组与对照组无显著性差异(P 0.05)(见图1)。表 1各组别动物胸腺、脾指数变化(x s，n=8)组别胸腺(mg)脾脏(mg)胸腺指数(mgg1)脾指数(mgg1)对照组54.60 16.19146.90 16.431.43 0.363.91 0.33高剂量组52.80 10.85137.50 18.221.51 0.303.92 0.47中剂量组51.40 5.04138.60 19.961.48 0.143.99 0.50低剂量组56.90 10.15146.60 26.531.63 0.294.18 0.67复方组53.27 6.31140.84 20.941.57 0.334.06 0.4951Strait Pharmaceutical Journal Vol.35 No.2 2023表 2外周血血细胞分析结果-1(x s，n=8)组别WBC 白细胞计数(103/L)BC 红细胞计数(106/L)HGB 血红蛋白量(gdL1)PLT 血小板计数(103/L)对照组5.34 1.3710.02 0.51141.30 7.261229.50 138.37高剂量组7.03 1.61*9.73 0.46139.33 6.421110.11 120.25中剂量组6.62 1.969.31 0.79132.89 3.691139.56 146.70低剂量组6.07 1.649.93 0.29137.60 4.501230.40 193.51复方组6.59 2.069.63 0.57135.24 4.381487.54 137.28注:与对照组比较，*P 0.05表 3外周血血细胞分析结果-2(x s，n=8)组别NEUT(%)中性粒细胞百分率(%)LYMPH(%)淋巴细胞百分率(%)MONO(%)单核细胞百分率(%)EO(%)嗜酸性粒细胞百分率(%)对照组16.09 3.6581.00 3.921.27 0.561.64 0.67高剂量组17.08 3.6079.38 4.000.95 0.512.59 1.41中剂量组22.70 9.5274.57 9.150.84 0.341.86 0.83低剂量组17.64 3.8179.61 4.040.76 0.451.97 0.75复方组17.21 6.9578.97 6.360.87 0.291.84 0.97图 1各组别小鼠左右耳重量差(x s，n=8)注:与对照组比较，*P 0.05图 2各组别吞噬速率与吞噬指数检测结果(x s，n=8)注:与对照组比较，*P 0.053.2单核巨噬细胞吞噬实验吞噬速率与吞噬指数检测结果:鲜益母草干粉高剂量组与复方组吞噬速率较对照组显著升高(P 0.05);高、中剂量组以及复方组吞噬指数较对照组显著提高(P 0.05)(见图 2)。4讨论益母草药材在存储过程中，有效部位总生物碱的含量会迅速下降，存储一年后可降至 0.4%以下4，益母草新鲜药材制剂的出现较好的解决了这一问题，其可最大程度的保留益母草中含有的生物碱、黄酮类、二萜类、多糖、微量元素等成分，特别是多糖类成分对于免疫系统调节至关重要。大量免疫学研究表明多糖类成分不仅可以激活 T、B 淋巴细胞、巨噬细胞与自然杀伤细胞等免疫细胞，还可以活化补体，促进细胞因子的生成，调节免疫系统，增强机体免疫力5，6。本试验通过小鼠迟发性变态反应(二硝基氯苯诱导)与小鼠单核巨噬细胞吞噬功能研究(小鼠碳廓清实验)来评价鲜益母草干粉及其复方调节小鼠免疫力的作用，迟发性变态反应研究结果表明益母草干粉高、中剂量以及复方可显著提高小鼠耳肿胀水平，上调了机体免疫力;小鼠单核巨噬细胞吞噬功能研究结果中，益母草干粉高剂量与复方组可显著提高小鼠单核巨噬细胞吞噬速率，且高、中剂量与复方组吞噬指数较对照组有显著提高。试验结果表明鲜益母草干粉高(0.30gkg1)、中剂量(0.10 gkg1)以及复方(0.545 gkg1)可提高小鼠机体免疫水平。益母草中多糖类成分具有较高的含量，约为 6%7，这为益母草调节机体免疫提供了物质基础，通过进一步的研究其有潜力开发成为调节免疫力的药物。参考文献1 国家药典委员会编.中国药典 S.北京:中国医药科技出版社，2020:302-303.2 叶林虎，贺梅，赵欣黔，等.益母草及其制剂的研究进展 J.中国民族民间医药，2019，28(02):56-60.3 叶观宇，陈英，刘钰瑜.益母草的免疫调节作用及其应用研究进展 J.医学综述，2011，17(19):2996-2998.4 王溶溶，陈丹菲，杨明华.鲜益母草胶囊的研制 J.中国现代应61海峡药学2023 年第 35 卷 第 2 期用药学，2003(06):464-466.5 董碧莲，蔡延渠，吕莉，等.中药多糖增强免疫、抗疲劳作用的研究进展 J.中成药，2019，41(05):1119-1124.6 李容，陈华国，周欣.植物多糖免疫调节机制研究进展 J.天然产物研究与开发，2018，30(11):2017-2022，2031.7 鲍智娟，王惠杰.不同方法提取益母草多糖的比较研究 J.白城师范学院学报，2016，30(08):40-45.低浓度硫酸阿托品滴眼液兔眼毒性试验研究郭妍，安元龙，张智鹏，姜珊*，马俊佼，钟梦婷(辽宁何氏医学院药学院，辽宁沈阳 100163)摘要:目的通过急性眼毒性试验和长期眼毒性试验，评价低浓度硫酸阿托品滴眼液(0.01%)对兔眼的安全性，同时为 0.01%0.1%浓度范围硫酸阿托品滴眼液的开发提供理论支撑。方法采用定期测量瞳孔直径、眼压、眼部 A 超、眼底彩超、裂隙灯眼表检查及组织病理学作为观察指标，评价低浓度硫酸阿托品对兔眼急性毒性。结果未见该药物对兔眼产生毒性反应。结论低浓度硫酸阿托品滴眼液安全性较高，0.01%0.1%浓度范围硫酸阿托品滴眼剂可进一步开发。关键词:低硫酸阿托品滴眼液;急性眼毒性试验;长期眼毒性试验中图分类号:965文献标识码:A文章编号:1006-3765(2023)-02-0017-04作者简介:郭妍，女(1984 )。学历:硕士研究生。职称:副教授。主要从事药品质量及药理毒理研究。通讯作者:姜珊。职称:副教授。基金项目:辽宁省教育厅科学研究经费项目(No.SJ202002)Study on the Ocular Toxicity of Low Concentration of Atropine Sulfate EyeDrops in abbitsGUO Yan，AN Yuan-long，ZHANG Zhi-peng，JIANG Shan*，MA Jun-jiao，ZHONG Meng-ting(School ofPharmacy，He University of Liaoning，Shenyang 110163，China)ABSTACT:OBJECTIVEThe safety of atropine sulfate eye drops with low concentration(0.01%)on rabbiteyes was evaluated through acute and long-term eye toxicity tests，and theoretical support was provided for the devel-opment of atropine sulfate eye drops with concentrations ranging from 0.01%to 0.1%.METHODSThe pupil di-ameter，intraocular pressure，ocular A ultrasound，fundus color ultrasound，slit lamp ocular surface examination and his-topathology were measured regularly as observation indicators to evaluate the acute toxicity of atropine sulfate at lowconcentration to rabbit eyes.ESULTSNo toxic reaction in rabbit eyes was observed.CONCLUSIONLow con-centration atropine sulfate eye drops are safe，and the concentration range of 0.01%-0.1%can be further developed.KEY WODS:Atropine sulfate eye drops;Acute ocular toxicity test;Long-term ocular toxicity test目前控制近视进展的方法中，低浓度阿托品对青少年近视的延缓作用备受医学界关注。研究报道1-3，硫酸阿托品滴眼液控制近视进展的疗效与浓度有关，目前 0.1%、0.05%、0.025%、0.02%、0.01%浓度硫酸阿托品滴眼液报道最多，其中 0.01%浓度控制近视进展的效果较好。Sun 等4研究表明，低浓度阿托品滴眼液控制儿童近视进展的有效性具有剂量依赖性。赵兵新等5通过对 0.005%硫酸阿托品滴眼液临床有效性和安全性研究得出，0.005%硫酸阿托品滴眼液对延缓儿童近视临床效果不明显，建议从略高质量分数如 0.01%开始。本实验旨在评价 0.01%硫酸阿托品滴眼液非临床安全性。项目组选择 0.01%和 0.1%两个浓度开展阿托品滴眼液急性眼毒性实验和长期眼毒性试验，考察低浓度阿托品滴眼液对兔眼的毒性反应，为后续研究不同浓度阿托品滴眼液控制近视奠定研究基础。1材料与方法1.1药品、试剂与仪器硫酸阿托品滴眼液(沈阳何氏眼产业集团有限公司提供，0.01%浓度，批号:20210301;0.1%浓度，批号 20210401);0.5%盐酸丙美卡因滴眼液(爱尔凯因，18C16N);HE 染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司，P0098);中性树脂(北京索莱宝科技有限公司);0.9%氯化钠注射液。眼科裂隙灯(重庆康华科技有限公司，SLM 型);手持式眼底照相机(苏州微清医疗器械有限公司);接触式眼压计71Strait Pharmaceutical Journal Vol.35 No.2 2023