实验指导-微生物学检验实验技术指导.docx

微生物学检验实验指导
2009．7
一、《微生物学检验》实验目的要求
1．通过实验验证理论知识，并掌握比较全面的微生物学基本操作技术。
2．在微生物学实验过程中建立无菌观念，掌握无菌操作技术。
3．通过实验进一步掌握临床常见病原微生物的生物学性状、分离培养和鉴定的方法、各种临床标本的微生物学检验程序和方法。
4．在实验过程中逐渐培养独立思考问题、分析问题和解决问题的能力。

二、微生物学实验室规则及实验室意外处理方法
1．微生物学实验室规则
由于微生物学实验是以病原微生物为研究对象，在实验过程中任何疏忽大意都有可能引起实验人员的自身感染或实验室和周围环境的污染。因此，实验中应严格遵守实验规则，建立无菌观念，严格无菌操作，防止实验过程中出现意外情况，并确保实验结果的准确。
（1）试验前须预习实验内容，了解实验目的、方法和注意事项，做到心中有数，避免发生错误，提高实验效率。
（2）进入实验室必须穿工作服，必要时还须戴口罩、帽子和手套，并做好实验前的各项准备工作。
（3）非必需物品禁止带入实验室，带入实验室的物品应远离操作区，放在指定的区域。
（4）实验室内不准大声喧哗、嬉戏，应保持实验室的安静、整洁和有序。不准在实验室内吸烟、饮水和进食，尽量避免用手触摸头、面部，防止感染，尽量减少室内活动，以免引起风动。
（5）实验中注意节约试剂，爱护仪器，避免有菌材料的污染，如有传染性材料污染桌面、地面、手、衣服或发生其他意外情况，应立即报告老师及时作适当处理。
（6）用过的污染物品应放到指定的地点，经专人消毒灭菌之后再进行清洗，切勿乱丢或冲入水池中。禁止将本实验室的物品带出实验室外。需送温箱培养的物品，应标记清楚后送到指定地点。
（7）实验完毕后应将桌面整理清洁，试剂、仪器放回原处，并用浸有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，打扫卫生，关好水、电、门窗。
（8）离室前脱下工作服，反折放在指定的地方；双手在2％来苏液中浸泡5min左右，再用肥皂、清水洗净，方可离开实验室。
2．实验室意外的紧急处理方法
（1）发生皮肤破损或刺伤：首先用肥皂和水冲洗伤口，尽量挤出损伤处的血液，并用70%乙醇或其他皮肤消毒剂进行消毒，立即进行医疗处理。
（2）化学药品腐蚀伤：若为强酸，用大量清水冲洗后再以5%碳酸氢钠溶液中和；若为强碱，用大量清水冲洗后再以5%醋酸或5%硼酸溶液中和；若受伤处是眼部，经上述方法处理后，再滴入橄榄油或液体石蜡1~2滴。
（3）烧伤：局部涂凡士林、5%鞣酸或2%苦味酸。
（4）菌液误入口中：立即将菌液吐入消毒容器中，再用1∶1000高锰酸钾或3%过氧化氢漱口，根据菌种服用适当抗生素预防感染。
（5）菌液污染环境：将适量2~3%来苏或0.1%新洁尔灭浸泡污染面半小时后除去，如手上有菌污染，也可浸泡于上述消毒液中3~5min，之后用肥皂和清水洗净。

三、生物安全防护知识简介
医学检验工作人员长期接触有潜在传染性的血液、粪便、体液等标本，这些标本往往是各种细菌、病毒等病原微生物的传播载体，无论是实验人员感染，还是造成实验室和周围环境的污染，都将导致严重的后果。因此实验室工作人员在实验过程中必须高度重视实验室生物安全防护，强化生物安全意识，熟悉生物安全防护有关知识，严格无菌操作。
1．微生物的分类等级
根据世界卫生组织（WHO）出版的《实验室生物安全手册》，将微生物分为四个不同危险度等级：危险度1级是指不能引起人或动物致病的微生物，此类微生物无或仅具有极低的个体和群体危险；危险度2级的病原体具有中度个体危险，低度群体危险，能引起人或动物致病，但对实验室工作人员、社区、家畜或环境不易导致严重危害，所引起的感染具有有效的预防和治疗措施，并且疾病传播的危险有限；危险度3级的病原体具有高度个体危险，低度群体危险，通常能引起人或动物的严重疾病，但一般不会发生感染的播散，并且对感染具有有效的预防和治疗措施；危险度4级的病原体具有高度的个体危险和群体危险，通常能引起人或生物的严重疾病，并且很容易发生个体之间的直接或间接传播，对感染一般没有有效的预防和治疗措施。
基于以上划分标准，结合微生物的致病性、传播方式、目前所具有的预防和治疗措施等因素，我国卫生部于2006年制定了《人间传染的病原微生物名录》，对各种病原微生物的危害程度及其相关实验活动需要达到的生物安全实验室级别做了详细分类，各实验室进行有关实验均需参照此标准。
2．生物安全实验室分级与要求
由于各种病原微生物的危险度等级不同，因此实验室必须达到相应的生物防护等级才能开展有关实验。根据WHO《实验室生物安全手册》和我国卫生部2002年颁布的《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》，实验室从生物安全防护的角度共分为四级：一级生物安全防护实验室（BSL-1）为实验室结构设施、安全操作规程、安全设备适用于危险度1级的微生物，依据标准操作程序可进行开放性操作，如用于教学的普通微生物实验室即属此类。二级生物安全防护实验室（BSL-2）适用于对人或环境具有中等潜在危害的微生物，即危险度2级的病原体，该级别实验室应具备生物安全柜和密封的离心管，以免发生泄漏和产生气溶胶。三级生物安全防护实验室（BSL-3）适用于有明显危害、可以通过空气传播的病原微生物（如结核杆菌、伯氏立克次体等），通常已有预防传染的疫苗，该级别实验室除了有严格的一级和二级安全设施要求外，还需具备合适的空气净化系统。四级生物安全防护实验室（BSL-4）适用于对人体具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒素。BSL-4实验室必须与其他实验室隔离，并具备特殊的空气和废物处理系统，实验操作须在Ⅲ级生物安全柜内或全身穿戴特制的正压防护服。
根据以上定义，医院内的临床实验室因接触可能含有致病微生物的标本，通常应达到二级生物安全防护实验室要求。根据《实验室生物安全认可准则》，二级生物安全实验室结构设施需符合以下几点：（1）实验室需具有防止节肢动物和啮齿动物进入的设计，有可开启的窗户，有纱窗，实验室门有可视窗带锁并能自动关闭。（2）每个实验室均应设置洗手池，宜设置在靠近出口处。（3）实验室工作区域外有足够的存储空间及摆放个人衣物的设施。（4）实验室内墙壁、地面应平整、防滑、易于清洁，不适宜用地毯。（5）实验台面应能防水、耐腐蚀、耐热。（6）实验室内应保证工作照明，避免反光和强光。（7）在实验室内应穿戴隔离衣、帽、手套，必要时戴防护眼镜。实验室应备有生物安全柜。（8）有适当的消毒设施，如高压蒸汽灭菌器，并设置洗眼装置、应急喷淋装置、急救药箱、灭火器等。（9）有可靠的电力供应和应急照明。（10）在实验室出口处设有在黑暗中可明确辨认方向、通道的标识。（11）在实验室入口处和装有传染性物质的设备表面贴有生物危险标志。
3．实验室生物安全管理制度
实验室生物安全制度建设对于临床实验室而言是生物安全防护的核心，实验室生物安全管理制度应包括：实验室准入制度、生物安全培训制度、生物安全责任制和责任追究制度、生物防护与安全制度、安全检查制度、个人防护制度、实验室管理制度、清洁消毒制度、安全计划审核制度、废弃物处理制度、事故报告制度、生物安全防护应急预案、标准操作程序等。
建立健全了各项生物安全制度，还应成立生物安全管理领导小组，加强生物安全制度实施情况的监督管理，实验室入口处须粘贴生物安全标志，注明危险因素，生物安全级别，负责人姓名和电话，进入实验室的特殊要求及离开程序，禁止非工作人员进入实验室，如需参观实验室等特殊行为需经实验室负责人的批准后方可进入。
4．实验室常见生物危险
实验室生物污染的途径包括：空气传播（临床标本中的污染源在空气中传播、微生物气溶胶的吸入）、直接传播（工作中偶然刺伤、割伤，碎玻璃划伤直接感染）、皮肤粘膜接触（临床标本中的传染源通过破损皮肤粘膜接触造成的感染）、其他不明原因的实验室相关感染。
实验室伤害以及与工作有关的感染主要是由于人为失误﹑不良实验技术以及仪器使用不当造成的。因此，实验室人员必须提高生物安全意识，认真学习生物安全相关的各种法规和文件，定期进行生物安全防护知识培训，熟悉生物防护有关知识，加强基本技能的培养，严格执行操作规程。实验室管理者应对实验室的风险级别进行分析，尤其对风险级别较高的、接触高危标本几率较大的区域如微生物和分子生物学室予以高度重视，保护实验室工作人员和环境的安全。
5．生物废弃材料的管理
实验室内所有用过的样本、培养物及其他生物性材料等废弃物，严禁未经处理就随意丢弃，应置于贴有生物危害标志的专用废弃物处理容器内，注意容器的充满量不能超过其设计容量，利器（如针头、小刀、玻璃等）应置于耐扎锐器盒内，在去污染或最终处置前应存放在指定的安全地方，经过高压灭菌或其他无害化处理后再安全运出实验室；有害气体、气溶胶、污水、废液等均需经无害化处理后排放；动物尸体、组织的处置和焚化应符合国家相关要求。处理危险废弃物的人员需经过专业培训，并使用适当的防护设备。

第一章 微生物学检验基本技术

实验一 细菌的形态结构观察及显微镜油镜的使用
【目的和要求】
1．熟悉微生物实验室规则并自觉遵守。
2．掌握细菌基本形态和特殊结构的观察方法。
3．掌握光学显微镜油镜的使用和维护方法，了解荧光显微镜和暗视野显微镜的构造和使用方法。
【试剂与器材】
1．示教片：各种球菌、杆菌、弧菌、荚膜、鞭毛、芽胞的示教片。
2．器材及其他：光学显微镜、载玻片、擦镜纸、香柏油、脱油剂等。
【实验内容】
一、细菌基本形态和特殊构造的观察
1．细菌的基本形态（各种球菌、杆菌、弧菌等）
观察要点：注意细菌的染色性、相对大小、形状及排列方式。
2．特殊结构的观察（荚膜、芽胞、鞭毛）
观察要点：注意这些特殊结构的大小、形状及其在菌体中的位置，均有助于细菌的鉴定。
二、光学显微镜油镜的使用
1．光学显微镜的构造
光学显微镜是观察细菌形态最常用的一种仪器，其构造分为机械部分和光学部分，机械部分包括：镜座、镜臂、载物台、镜筒、镜头转换器、调焦装置等；光学部分包括：接物镜、接目镜、反光镜、聚光器、光圈等（见图1-1）。

图1-1 光学显微镜的构造
显微镜的接物镜有低倍镜、高倍镜、油镜三种，放大倍数依次增高，其识别方法为：
（1）低倍镜：镜头标志为10×或10/0.25，镜头最短，其上常刻有黄色环圈。
（2）高倍镜：镜头标志为40×或40/0.65，镜头较长，其上常刻有蓝色环圈。
（3）油镜：镜头标志为100×或 100/1.30，镜头最长，其上常刻有白色环圈，或“oil”字样。
2．油镜的使用原理

图1-2 显微镜油镜的使用原理
油镜的放大倍数高而透镜很小，自标本片透过的光线，因玻片和空气的折光率不同（玻璃n=1.52，空气n=1.0），部分光线经载玻片进入空气后发生折射，不能进入接物镜，致使射入光线较少，物象不清晰。在油镜和载玻片之间滴加和玻璃折光率相近的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野光亮度增强，物象清晰（见图1-2）。
3．使用方法
（1）采光：使用显微镜时必须端坐，将显微镜放在胸前适当位置。将低倍镜转到中央并对准下面的聚光器，打开光圈，转动反光镜，使光线集中于聚光器（以灯光为光源时，使用凹面反光镜，以自然光为光源时用平面反光镜）。根据所观察的标本，通过升降聚光器和缩放光圈以获得最佳光度。当用低倍镜或高倍镜观察时，应适当缩小光圈，下降聚光器；当用油镜观察时，光线宜强，应把光圈完全打开，并将聚光器上升到最高位置。
（2）低倍镜调焦：将欲观察的标本置载物台上，用弹簧夹和推进器固定，将待检部位移至视野正中央，上升载物台至不能升高为止。用左眼观察接目镜，缓慢调节粗调节器，使载物台下降，待看到模糊的图像时，再调节细调节器，直至看到清晰的图像为止。
（3）油镜的使用：低倍镜找到物象并调至清晰之后，转开物镜头，在玻片的标本上滴加1滴香柏油，将油镜头转换至中央，缓慢调节粗调节器，使镜头浸入油中，当油镜头几乎接触玻片时停止转动（从侧面观察），边观察接目镜边轻轻转动粗调节器（此时只能上升镜头，不能下降，防止压坏玻片及损坏物镜），待看到模糊物象时改调细调节器，直至找到清晰物象。
镜检时应将标本按一定方向呈“弓”形移动，直至整个标本观察完毕，以防漏检。观察时应将两只眼睛同时睁开，左眼观察，右眼用于绘图或记录。标本观察完毕后，先将物镜头移开，再转动粗调节器使载物台下降，取下载玻片，立即用擦镜纸将镜头上的香柏油擦净。
4．注意事项
（1）显微镜是精密光学仪器，在搬放时应右手紧握镜臂，左手稳托镜座，平端在胸前，轻拿轻放。
（2）显微镜放到实验台上时，先放镜座的一端，再将镜座全部放稳，切不可使镜座全面同时与台面接触，这样震动过大，透镜和微调节器的装置易损坏。
（3）避免强酸、强碱、氯仿、乙醚、酒精等化学药品与显微镜接触，避免日光直射，显微镜须经常保持清洁，勿使油污和灰尘附着。
（4）接目镜和接物镜不要随便卸下，必须抽取接目镜时，须将镜筒上口用布遮盖，避免灰尘落入镜筒内。更换接物镜时，卸下后应倒置在清洁的台面上，并随即装入木箱的置放接物镜的管内。
（5）细调节器是显微镜最精细而脆弱的部分，不要向一个方向连续转动数周，应轻微地来回旋转。
（6）镜头必须保持清洁，油镜使用完后应立即用擦镜纸拭去香柏油。若油镜镜头上的油迹未擦干净，应先将1:1醇醚混合液或二甲苯滴在擦镜纸上擦拭镜头，再用干净擦镜纸将镜头上残留的醇醚混合液或二甲苯擦净。
（7）显微镜擦净后，取下标本片，下降聚光器，再将物镜转成“品”字形，送至显微镜室放入镜箱内。
三、暗视野显微镜
1．构造与原理：在显微镜上安装一个特制的聚光器一暗视野聚光器。此聚光器中央为一黑板所遮，光线不能直接通向镜筒，使视野背景黑暗。这样，从聚光器周边斜射到载玻片上细菌等微粒上的光线，就因散射作用而发出亮光，反射到镜简内。故在强光照射下，可在黑色的背景中看到发亮的菌体。正如我们在暗室内，能看到从隙缝漏入的阳光内，有无数颗尘埃微粒跳跃飞舞一样。
2．使用方法：
（1）将显微镜聚光器御下，装上暗视野聚光器，置暗室，使用人工光源。
（2）先用低倍物镜观察，调节光环置中央后，在暗视野聚光器表面滴上香柏油（或水），再将标本夹在移动尺上。
（3）调节暗视野聚光器，使之油滴（或水滴）与镜台上的载玻片底面接触，
（4）其余操作同光学显微镜。
四、荧光显微镜
1．构造：
（1）荧光显微镜光源：能发射丰富的紫外线光和紫兰光，常用150~200瓦高压汞灯。
（2）滤光片：
1）激发滤光片装于光源与聚光器之问，可选择性使紫外光及紫兰光通过，激发荧光素发出荧光；
2）吸收滤光片装于物镜与目镜之间，可吸收紫外光及紫兰光，仅让荧光通过，以便观察标本和保护眼睛。
2．荧光显微镜的使用方法：
（1）将荧光显微镜置暗室，开启光源，待光源稳定并达到一定亮度（约5~10min）后，对准光轴。
（2）装好配对的激发滤光片和吸收滤光片后再作观察。操作同光学显微镜。
3．注意事项
（1）荧光显微镜如用高压汞灯作光源，使用时一经开启不宜中断，断电后需待汞灯冷却后（约15min）方能再启用。
（2）使用荧光显微镜观察标本时间不宜太长．因标本在高压汞灯下照射超过3min，即有荧光减弱现象。
【结果记录和报告】

实验二 细菌的形态学检查
【目的和要求】
1．熟悉细菌染色的常用染料和一般程序。
2．掌握革兰染色的方法、原理、结果观察及意义。
3．熟悉不染色标本检查法（压滴法和悬滴法）的方法与结果观察。
4．熟悉细菌的特殊染色法。
【试剂与器材】
1．菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌。
2．试剂：革兰染色液、细胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理盐水等。
3．其他：载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、香柏油、蜡笔、擦镜纸、脱油剂等。
【实验内容】
一、细菌染色的一般程序
细菌染色法分单染法和复染法。单染法是用一种染料去染，所有细菌都染成一种颜色；复染法是用多种染料对细菌进行染色，不同细菌可染成不同的颜色。
大部分细菌染色的基本程序相同，即：涂片→干燥→固定→染色，根据实验目的选择不同的染色方法，在实际工作中，应用最广泛的是革兰染色法。
二、革兰染色
1．染色原理
（1）等电点学说：革兰阳性菌的等电点（pI2～3）比革兰阴性菌（pI4～5）低，在同一pH条件下革兰阳性菌带负电荷比革兰阴性菌要多，与带正电荷的碱性染料（结晶紫）结合性牢固，不易脱色。
（2）化学学说：革兰阳性菌含有大量的核糖核酸镁盐，与进入胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95%酒精脱色；而革兰阴性菌含此种物质少，故易被乙醇脱色。
（3）通透性学说：革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层较厚，含脂质少，脱色时，乙醇不易进入，而且95％乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小，通透性降低，阻碍结晶紫和碘复合物渗出。 而革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层较薄，含脂质多，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫与碘复合物易被溶出而脱色。
2．方法
（1）涂片：取清洁无油迹的载玻片1张，用蜡笔划线将其分成左右两格。用接种环先挑取生理盐水1~2环于载玻片每格中央，再分别挑取大肠杆菌和葡萄球菌少许菌落与生理盐水研匀，涂成直径约1.5cm的菌膜。
（2）干燥：让涂片自然干燥，也可在酒精灯火焰较远处微微加热烘干，但切勿靠近火焰。
（3）固定：干燥后的标本片在酒精灯火焰上来回通过3次（以钟摆的速度），冷却后染色。固定的目的在于杀死细菌，并使菌膜与玻片牢固粘附，避免染色过程中被水冲洗掉，通过固定还可凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性，使细菌易与染料结合而着色。
（4）染色：分以下四步：
1min，水洗 1min，水洗 约0.5min，水洗 0.5min，水洗
结晶紫 卢戈碘液 95％乙醇 稀释石炭酸复红 待干、镜检
（初染） （媒染） （脱色） （复染）
3．结果：革兰阳性菌染成紫色；革兰阴性菌染成红色。
4．注意事项：
（1）涂片厚薄要适宜，以菌膜刚好能透过字迹为宜（半透明）。如果涂片太厚有可能将革兰阴性菌染成紫色，涂片太薄则可能将革兰阳性菌染成红色。
（2）脱色时间长短要适宜，如果涂片较厚应相应的延长脱色时间，如涂片较薄则相应的缩短脱色时间，脱色时应不断旋转玻片摇匀，使其充分脱色，通常脱到乙醇中没有紫色流下即可。
（3）水洗时，水流不能过大，防止水流直接对准菌膜冲洗。
（4）所有染液应防止因蒸发而改变浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后失去媒染作用；涂片上积水过多会降低染液浓度，影响染色效果。
（5）因细菌的菌龄不同染色结果也有差异，一般以18~24h培养物染色结果最好。
5．医学意义：通过革兰染色有助于细菌的初步鉴别，并可作为选择药物的参考，了解细菌的致病性。
三、特殊染色法
细菌的细胞壁、核质、胞浆颗粒和细菌的特殊结构如芽胞、荚膜、鞭毛等，必须用相应的特殊染色法才能染上颜色。
1．细胞壁染色法
（1）涂片、干燥：同革兰染色法。
（2）固定：滴加100g/L鞣酸固定标本15min，水洗。
（3）滴加5g/L龙胆紫染色3~5min，水洗，待干、镜检。
结果：有细胞壁的细菌仅菌体周边染成紫色，菌体内部无色；无细胞壁的细菌（如L型细菌）整个菌体都染成紫色。
2．鞭毛染色法（改良Ryu法）
鞭毛染色可从平板上直接挑取菌落，也可从斜面培养基上刮取菌苔涂片，必须注意动作尽量轻，以免鞭毛脱落。培养基应为营养较好的琼脂平板（如血平板、营养琼脂），不可用含抑制剂的选择培养基（如SS、中国蓝、MAC等）。
（1）玻片的处理：要求用新的载玻片，用前在95%乙醇中浸泡24h以上，用时从酒精中取出，用干净的纱布擦干使用。若水滴向周围流散而不形成水珠表示玻片处理良好。
（2）在玻片上加蒸馏水1滴，用接种针蘸取菌落少许，将细菌点在蒸馏水滴的顶部（一般只需点一下，仅允许极少量细菌进入水滴），使其自然流散成薄膜，不可搅动，以免鞭毛脱落。
（3）室温自然干燥，不可在火焰上烘干。
（4）滴加染液（配方见附录二），染色约10~15min后，将玻片微倾斜，用蒸馏水缓慢滴加在玻片顶端无菌膜处洗去染液，注意洗净染液表面的金属光泽液膜。
（5）玻片自然干燥后镜检。观察时应从细菌较少的地方寻找鞭毛。
结果：鞭毛染成红色。
3．芽胞染色法
（1）涂片、干燥、固定：同革兰染色法。
（2）染色：分为以下三步。
1）初染：在菌膜上加石炭酸复红染液，用微火加热使染液冒蒸气5min，注意不能煮沸或烧干，加热过程中应随时添加染液，冷却后水洗。
2）脱色：用95%乙醇脱色1～2min，水洗。
3）复染：用碱性美蓝染1min，水洗，待干、镜检。
结果：菌体呈蓝色，芽胞染成红色。
4．荚膜染色法
（1）黑斯氏法
1）涂片，自然干燥，加热固定。
2）滴加结晶紫染液，在火焰上微微加热至染液冒蒸气为止。
3）用硫酸铜溶液将玻片上的染液洗去（注：切勿水洗），用吸水纸吸干后镜检。
结果：菌体及背景均染成紫色，荚膜染成淡紫色或无色。
（2）密尔氏法
1）涂片：提前数日于小鼠腹腔注射肺炎链球菌0.2ml，小鼠死亡后取腹腔液印片，自然干燥，加热固定。
2）滴加石炭酸复红染液，微火加热染色1min，水洗。
3）加媒染剂染0.5min，水洗。
4）加碱性美蓝染色1min，水洗，待干，镜检。
结果：菌体染成鲜红色，荚膜染成蓝色。
5．异染颗粒染色
细菌经涂片、干燥、固定，加甲液（见附录二）染色3~5min，水洗后加乙液染色1min，水洗，待干、镜检。
结果：菌体染成蓝绿色，异染颗粒染成蓝黑色。
四、不染色标本检查法
细菌未经过染色呈无色透明，在显微镜下为有折光性的小点，不能判断细菌的形态和结构特征。因此，不染色标本检查法主要用于观察细菌的动力，常用的方法有以下几种。
1．压滴法
用接种环分别取菌液2～3环，置于洁净载玻片中央。用小镊子挟一盖玻片，先使盖玻片一边接触菌液，然后缓缓放下，覆盖于菌液上，避免菌液中产生气泡。先用低倍镜找到观察部位，再换高倍镜观察细菌的运动。
2．悬滴法
取一洁净凹玻片，在凹窝四周涂少许凡士林。取一环菌液于盖玻片中央，将凹玻片凹窝对准盖玻片上的菌液，迅速翻转载玻片，用小镊子轻压盖玻片，使之与凹玻片粘紧封闭（见图2-1），置显微镜下观察。

图2-1 悬滴法
3．暗视野显微镜观察
将上述经压滴法制成的标本片，置于暗视野显微镜下观察，有鞭毛的细菌运动活泼，在黑色的背景下闪闪发亮，有明显的位置移动。
观察要点：有鞭毛的细菌运动活泼，可向不同方向迅速运动，位置移动明显。无鞭毛细菌不能做真正的运动，但受水分子的撞击而呈分子运动（布朗运动），即在一定范围内作来回颤动，位置移动不大，注意与细菌的鞭毛运动相鉴别。
【结果记录和报告】

实验三 灭菌前的准备与基础培养基的制备
【目的和要求】
1．熟悉常用玻璃器皿的清洗、灭菌前的包装准备。
2．熟悉培养基的种类、主要成分及用途。
3．掌握基础培养基的制备程序、方法和注意事项。
【试剂与器材】
1．试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂粉、1mol/L NaOH、1mol/L HCl等。
2．器材：试管、吸管、平皿、锥形瓶、量筒、吸管、精密PH试纸、天平、滤纸等。
【实验内容】
一、常用玻璃器材的洗涤和准备
1．玻璃器材的洗涤
玻璃器材若不清洁，常可影响实验结果，如影响培养基的pH值，甚至由于某些化学物质的存在可抑制微生物的生长；试管不清洁也可影响血清学反应的结果，如在pH<3时可发生酸凝集。因此，微生物实验所用的各种玻璃器材必须清洗干净后才能使用。
（1）新的玻璃器材：
先用肥皂水煮沸半小时，再用自来水冲洗多次，晾干水后浸于2％HCl内数小时，将游离的杂质除去，最后用自来水反复冲洗除尽残余HCl后，晾干备用。
（2）用过的玻璃器材：
1）凡含有培养基或病原微生物的玻璃器材，均应先用煮沸或高压蒸汽灭菌法灭菌，然后趁热倒出培养基，用5％肥皂水刷洗，再用自来水冲净后倒置架上，晾干备用。
2）试管：作血清反应的试管若不含病原微生物，可先用5％热肥皂水刷洗，再用自来水冲洗；若不够清洁，可先用清洁液（配制法见附录二）浸泡数小时，然后用自来水冲洗7次以上，晾干备用。
3）吸管：吸过病原微生物的吸管，应插入盛有消毒液（3~5％来苏）的玻璃筒中（筒底应垫纱布或棉花，以免碰破吸管尖），使消毒液盖过吸管，浸泡24h后，用5％肥皂水洗涤，再用自来水冲洗（若无病原微生物污染，则可用自来水浸泡或直接用自来水冲洗），晾干水后，用清洁液浸泡数小时，最后用自来水冲洗7次以上，晾干备用。
4）载玻片及盖玻片：用后分别浸入3~5％的来苏液中，浸泡24h后，用5％肥皂水煮沸10min，再用自来水冲洗，晾干后于清洁液中浸泡数小时，最后用自来水洗净，晾干备用。
5）注射器：用后若无病原微生物污染，立即用自来水将注射器及针头等抽洗干净；若有病原微生物污染，则立即进行煮沸消毒（含有芽胞菌，则应用高压蒸汽灭菌）。在消毒或灭菌之前，均应先将清水抽入针头及注射器内反复抽洗几次，并连同洗出水一起消毒或灭菌，以免加热时有蛋白质凝固而阻塞针头或注射器。若用上述方法不能洗净，可再置清洁液中浸泡数小时（针头不能用清洁液泡），取出用自来水冲洗7次以上，干燥后备用。
2．常用无菌器材的准备
（1）包装
1）平皿：用纸包好，或盛入金属盒内。
2）试管和锥形瓶：空的或盛有培养基的均可用棉塞塞好，并用不透水的厚纸包于棉塞外。若是盛有液体培养基的试管，应直立并扎成捆，以免灭菌时倾倒。
3）吸管：于吸口端先垫入少许棉花(不可太松或太紧)，然后每支分别用纸包好，或以数支放入金属筒内。
4）注射器：最好将内芯取出，与外套一起用纸或纱布包好；针头最好装入小试管内（管底垫有少量棉花），管口塞上棉塞。
（2）灭菌
上述玻璃器材可用高压蒸汽灭菌法，也可用干烤法进行灭菌。如用干烤法应注意控制温度和时间在160~170℃2h，以免烧焦棉塞及外包的纸张等。
注意：任何已灭菌的器材。在使用前不能随意打开，一经打开则不再认为是无菌的。
二、基础培养基的制备程序和方法
培养基是用人工方法将细菌生长所需要的营养物质按一定比例配制而成的营养基质。按照物理性状分为：液体、半固体和固体培养基三类，其区别主要是凝固剂的有无和多少；按用途分为：基础、营养、选择、鉴别、增菌、特殊培养基等。
培养基的成分因种类不同而异，其中基础培养基含有一般细菌生长所需要的基本营养成分，如：蛋白胨、肉浸液（或牛肉膏）、氯化钠和水，这些营养物质能为细菌提供生命所需的碳源、氮源、无机盐、水分，并能调节菌体内外的渗透压，为细菌提供能量。其他培养基大多是在基础培养基中加入某些特殊成分（如：营养物质、抑菌剂、检测基质、指示剂等）配制而成。
1．培养基配制的基本程序
包括：调配、溶化、矫正pH、过滤澄清、分装、灭菌、鉴定等几个主要步骤。
（1）调配：先在锥形瓶或烧杯中加入少量蒸馏水（事先量好），按照培养基的配方准确称取各种成分加入瓶中混合，再将剩余的水冲洗瓶壁。
（2）溶化：将调配好的混合物置电炉上隔水加热，使其完全溶解，注意随时搅拌，防止溶液外溢，溶解完毕，应补足失去的水分。
（3）矫正PH：用PH比色计、比色法或精密PH试纸矫正溶液的PH，一般矫正至7.2~7.6左右。其中PH试纸矫正法操作简便，快速，但误差较大；用PH比色计和比色法测定PH较为准确，后者无需特殊仪器。
比色法：取3支与标准管口径相同的试管，按下表加样。

试管号 培养基 蒸馏水 0.2g/L酚红

1（测试管） 5ml — 0.25ml
2（蒸馏水管） — 5ml —
3（培养基管） 5ml — —

第4管为标准PH比色管（配方见附录二）。
将4支试管按图3-1所示插入比色架中进行比色。

4 2

3 1
目测方向
图3-1 比色法
若测定管偏酸或偏碱，可分别加入0.1mol/L NaOH、0.1mol/L HCl矫正，直到测定管的颜色与标准管相同为止，注意：在加酸或加碱矫正时要缓慢，并准确记录加入的量，按下式计算培养基中需加入的量。
计算：设5ml培养基矫正PH至7.4需加入0.15mlNaOH，现配制1000ml培养基，需加入NaOH的量为：
5∶1000=0.15∶X，则X=（0.15×1000）/5=30ml
为防止培养基因矫正PH而加入过多的水，可将0.1mol/L NaOH换算成1mol/L NaOH，则需3ml。在培养基中加入NaOH后需再测一次PH，如仍未达到所需PH，再按上述方法进行矫正。
（4）过滤澄清 若培养基有混浊或沉淀，则需过滤。液体或半固体培养基用滤纸过滤，固体培养基在加热溶化后用绒布或双层纱布加脱脂棉过滤。
（5）分装　根据需要将培养基分装于不同的容器中，并进行包扎。
1）基础培养基：一般分装于锥形瓶，灭菌后备用，便于随时分装倾注平板或制备营养培养基。灭菌后的基础培养基在倾注平板前应冷却至50℃左右，以无菌操作分装于无菌平皿内（直径9cm的平皿分装量约13~15ml），待培养基冷却后将平皿翻转，即为琼脂平板。
2）琼脂斜面：分装于试管，分装量约为试管高度的1/4~1/3，灭菌后趁热放置成斜面，斜面长度占试管长度的2/3左右，斜面下方保持1cm高。
3）半固体培养基：分装于试管，量约为试管高度的1/4~1/3，灭菌后趁热将试管直立凝固。
4）琼脂高层培养基：分装于试管，量为试管高度的2/3，灭菌后趁热将试管直立凝固。
（6）灭菌 根据培养基的成分、性质采用不同的灭菌方法。
1）高压蒸汽灭菌法：用于基础培养基等耐高温培养基的灭菌。
2）间歇灭菌法：用于含糖、明胶、血清、牛乳、鸡蛋等不耐高温物质配制的培养基灭菌。
3）水浴低温灭菌法：将血清、腹水、组织液等配制的培养基在水浴中加热56~57℃维持1h，以保持液体状态，连续5~7天，此法较少用。
4）血清凝固器灭菌：用于富含蛋白质的培养基（如含血清、鸡蛋清的培养基）灭菌，方法是：将分装好的培养基（一般做成斜面）放在血清凝固器中，第一天75℃30min，第二天80℃30min，第三天85℃30min，在三次灭菌的间隙将培养基置35℃温箱孵育过夜。
5）过滤除菌：用于血清、细胞培养液的灭菌。
（7）鉴定 包括两项内容：
1）无菌试验：将灭菌后的培养基置35℃温箱孵育24h，无菌生长为合格。
2）效果检验：将已知菌种接种于培养基上，观察细菌的生长情况、生化反应等是否符合。
（8）保存 制备好的培养基需注明制备日期、名称，置4℃冰箱或冷暗处保存，但不宜放置过久。
2．常用培养基的配制和用途（见附录一）
3．培养基配制的注意事项
（1）在进行调配时应在瓶中先加入少量水，再加入各种固体成分，以免固体成分粘附在瓶壁上。装培养基的容器不能用铁、铜等材质的容器，若铁进入培养基中，含量超过0.14mg/L时可抑制细菌毒素的产生；含铜量超过0.3mg/L时可抑制细菌的生长。某些特殊成分（如染料、胆盐、指示剂等）应在矫正PH后加入。
（2）如需要制备十分澄清的培养基，可用卵蛋白加热澄清法：取一个鸡蛋的卵蛋白加水20ml，搅拌至出现泡沫，倒入1000ml液体或溶化的固体培养基，混匀，流通蒸汽加热30~60min，使培养基中的不溶性物质附着于凝固蛋白，取出后用纱布加脱脂棉（固体培养基）或滤纸（液体或半固体培养基）过滤。
（3）灭菌后的培养基在进行分装时应注意无菌操作，倾注平板时培养基的温度不能过高，否则冷凝水多，影响细菌的分离并易造成污染；也不能温度过低，否则琼脂过早凝固，使平板表面高低不平。
（4）在加热溶化时注意溶液不能溢出瓶外，否则会影响培养基的营养成分，若水分蒸发，应补足失去的水分。
【结果记录和报告】

实验四 细菌的接种培养法与生长现象的观察
【目的和要求】
1．掌握无菌技术，建立无菌观念；明确无菌操作时注意要点。
2．掌握细菌的接种、分离培养方法和接种环的制作方法。
3．熟悉细菌生长现象的观察方法。
【试剂与器材】
1．菌种：葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌等。
2．培养基：固体、半固体、液体培养基。
3．其他：温箱、酒精灯、接种环、接种针、L形玻棒、打火机、记号笔等。
【实验内容】
一、细菌的接种工具
1．接种环和接种针：其结构包括环（针）、金属柄、绝缘柄三部分（见图4-1）。其中环（针）部分最佳材料为白金丝，因其受热和散热速度快，硬度适宜，不易生锈且经久耐用，但因为价格昂贵而限制了其应用。目前实验室常用的是经济实用的300~500W电热镍鉻丝。一般要求接种环长5~8cm，直径为2~4mm，定量接种环的容量为0.001ml。

图4-1 接种环和接种针
接种环（针）在使用之前需检查镍鉻丝是否呈直线，若有弯曲，需用吸管或接种环的另一端将其压直；若环不圆，可将镍鉻丝前端放在吸管尖部缠绕一圈，再将镍鉻丝突出的部分朝内压紧。
接种环用于固体、液体培养基的接种，接种针用于半固体培养基的接种。
2．L形玻棒：由直径2~3mm的玻璃棒弯曲成L形制成。在使用之前用厚纸包扎后置高压蒸汽灭菌，或沾取无水乙醇后在火焰上烧灼灭菌。主要用于液体标本涂布接种。
二、细菌的接种方法
1．液体培养基的接种
该法主要用于细菌的增菌培养或进行细菌的生化反应。
方法：（图4-2）
（1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许细菌。
（2）左手拿试管，右手持接种环，用右手其余手指将试管塞打开，试管口通过火焰烧灼灭菌。
（3）将接种环在贴近液面的管壁上上下碾磨数次，使细菌均匀分布于培养基中。
（4）将试管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处。
（5）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。

图4-2 液体培养基接种法
2．半固体培养基的接种
该法可用于保存菌种、观察细菌的动力或进行细菌的生化反应。
方法：（图4-3）
（1）先将接种针在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。
（2）左手拿试管，右手持接种针，将试管塞打开后，试管口通过火焰灭菌，将接种针从培养基的中心向下垂直穿刺接种至试管底上方约5mm处（勿穿至管底），然后由原穿刺线退出，
（3）将试管口灭菌后加塞，接种针烧灼灭菌后放回原处。
（4）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。

图4-3 半固体培养基接种法
3．平板划线接种法
该法可将标本中的多种细菌分散成单个菌落，有利于细菌的分纯和进一步鉴定。
方法：
（1）连续划线法（图4-4）
1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。
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