微生物学实验指导书.docx

微生物学实验指导书
生物技术教学部 初立业 编

重庆邮电学院生物信息学院
2003年12月30日

前言

一、本课程的性质和任务

微生物学实验是生物学重要的基础课之一，特别是随着分子生物学的发展与拓宽，微生物学方法与技术显得尤为重要。此外，医学、农学、林学等学科，甚至地质学、太空学等也需微生物的方法与技术。因此，熟悉掌握微生物学方法与技术，对其它很多学科的发展有直接的影响。无菌操作技能和无菌概念的建立是微生物学实验中最重要的内容，微生物学实验课主要任务是使学生掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。   与微生物学基础理论课紧密结合，使学生将理性知识与感性认识有机地结合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力与创新意识。提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。

二、教学要求与教学方法

1. 教学要求
1)  注重微生物学基础实验技能的掌握与提高，克服盲目追求新颖而忽视基础的倾向；
2)    实验课前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤；
3) 在实验中要有严紧的科学态度，尊重事实与实验结果，要善于发现新现象；
4) 树立密切合作的风气，包括学生与老师、班与班、组与组、组长与组员之间的密配合。

2. 教学方法
1)    以学生自己动手为主，老师在适当时间予以提示；
2)    对实验中所出现的一些现象多向学生提出问题，使它们学会分析结果，并与理论知识有机结合；
3）根据实验的进行程度，引导学生更深入思考，逐步树立他们的创新意思；
4）严格要求使操作技能规范化，老师作示范，强调其要点学生自己练。

三. 教学学时分配与安排

本课程按每周3学时安排， 共6个实验，总学时18。

目录
实验一 细菌的革兰氏染色………………………………………3
实验二 根霉、酵母菌形态结构的观察…………………………4
实验三 培养基制备………………………………………………6
实验四 灭菌与消毒………………………………………………9
实验五 微生物的分离和纯化……………………………………12
实验六 微生物的生理生化反应…………………………………14
实验七 水中细菌总数的测定……………………………………19
实验八  放线菌形态的观察………………………………………21
实验九 细菌的芽胞染色…………………………………………22
实验十 微生物菌种保藏…………………………………………24

实验一 细菌的革兰氏染色法

实验目的：

1． 学习并初步掌握革兰氏染色法。
2． 了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

实验原理：

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，象简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

实验器材：

1．菌种 大肠杆菌 (Escherichia coli) 约24h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)约24h营养琼脂斜面培养物，蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）12～20h营养琼脂斜面培养物。
2．染色剂 革兰氏染色液。
3. 仪器或其它用具 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水。

实验内容：

1．制片
取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
*要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。
2．初染
滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。
3．媒染
用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
4．脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。
*革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约20-30s。
5．复染
用番红染液复染约2min，水洗。
6．镜检
干燥后，用油镜观察。
菌体被染成蓝紫色是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。
7．混合涂片染色
按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄菌作为混合涂片、染色、镜检进行比较。

实验报告：

1． 列表简述3株细菌的染色观察结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。
2．你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？最关键的环节是什么？
3．现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样
运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。
4．你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。
5．进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？
6．革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性
菌应分别是什么颜色？
7．你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？

实验二 根霉、酵母菌形态结构的观察

实验目的：

1．观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。
2．学习并掌握观察霉菌的基本方法，了解四类常见霉菌的基本形态特征。

实验原理：

酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水侵片来观察酵母菌的形态和发芽生殖方式。
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。
霉菌可产生分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，可用低倍显微镜观察。
观察霉菌的形态主要有三种方法，
直接制片观察法：是将培养物放置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检，其制片的特点是：细胞不变形；具有防腐作用，不易干燥，能保存较长时间；能防止孢子飞散；染液的蓝色能增强反差。必要时，还可用树脂封固，制成永久标本长期保存。
载玻片培养观察法：用无菌操作将培养物琼脂薄层放置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置显微镜下观察。这中方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育时期的培养物。
    玻璃纸培养观察法：霉菌的玻璃纸培养观察方法与放线菌玻璃纸培养观察方法相似。这种方法用于观察不同生长阶段霉菌的形态，也可获得良好的效果。

实验器材：

1.菌种 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培养约2day 的麦芽汁斜面培养物，曲霉 (Aspergillus sp.) ，青霉 (Pencillium sp.)，根霉（Rhizopus sp.）和毛霉（Mucor sp.）培养2-5天的马铃薯琼脂平板培养物。
2.溶液或试剂 0.05%和0.1%吕氏碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液，乳酸石炭酸棉蓝染色液。
3.仪器或其它用具 显微镜， 载玻片 ，盖玻片，无菌吸管 ，平皿 ，载玻片， 盖玻片， U型玻璃棒 ，解剖针 ，镊子 ，50%乙醇 ，20%的甘油等。

实验内容：

（一）酵母观察
 1.美蓝浸片的观察
(1) 在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌放在染液中，混合均匀。
(2) 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢地将盖玻片放下使其盖在菌液上。   
(3) 将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。
(4) 染色约0.5h后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。
(5) 用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。
2.水—碘液浸片的观察
   在载玻片中央加一小滴革兰氏染色液用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水—碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。
（二）霉菌观察
1.直接制片观察法
    在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染色液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，放置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。
2.载玻片培养观察法
(1)培养小室的灭菌 在平皿皿底铺一张略少于皿底的圆滤纸片，再放一U型玻璃棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖。包扎后121°C灭菌30min，烘干备用。
(2)琼脂块的制作 取已经灭菌的马铃薯琼脂培养基6~7ml注入另一个灭菌平皿中，使之凝固成薄层。解剖刀切成0.5~1cm2的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上。
(3)接种 用尖细的接种针挑取很少量的孢子接种于琼脂块的边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖再琼脂块上。
(4)培养 先在平皿的滤纸上加3~5ml灭菌的20%甘油(用于保持平皿内的湿度)，盖上盖，28°C培养。
(5)镜检 根据需要可以在不同的培养时间内取出载玻片置低倍镜下观察，必要时换高倍镜。

实验报告：

1．绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征
2．说明观察到的吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？
分析其原因。
3．在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？
4．你主要根据哪些形态特征来区分所观察的四种霉菌？
5．在显微镜下，细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的主要区别是什么？

实验三 培养基制备

实验目的：了解培养基的制备原理并掌握其制备过程。

实验原理：

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。
由于各种微生物所需要的营养不同，所以培养基的种类很多。可以根据微生物种类和实验目的不同分成若干类型。培养基的类别如下：
1.按照培养基的成分来分
培养基按其所含成分，可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基三类。
(1)合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏培养基等。
(2)天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用。
(3)半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。
2.按照培养基的物理状态分
培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。
(1)固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。
(2)液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。
(3)半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。
3.按照培养基用途分
培养基按用途可分为基础培养基、加富培养基、选择培养基和鉴别培养基。
(1)基础培养基 含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质。最常用的基础培养基是天然培养基中的牛肉膏蛋白胨培养基。
(2)加富培养基 是在基础培养基中加入某些特殊营养物质，如血、血清、动植物组织提取液，用以培养要求比较苛刻的某些微生物。
(3)选择性培养基 是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。
⑷鉴别培养基 是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使微生物培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。

实验器材：

1．溶液或试剂 牛肉膏，蛋白胨，琼脂，可溶性淀粉，葡萄糖，孟加拉红，链霉素，1mol/L NaOH，lmol/L HCl，KNO3，NaCl，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O。
2．仪器或其他用具 试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，天平，牛角匙，pH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，线绳，纱布，漏斗，漏斗架，胶管，止水夹等。

实验内容：

（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：
牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL，PH7.4～7.6
1．称药品 　
按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2．加热溶解
在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。
3． 调pH
检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用lmol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4．过滤
液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。
5．分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。
分装量：固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
6．加棉塞
试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约2/3塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。
7．包扎
加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。
8．灭菌
将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
9．摆斜面
灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2。
10．无菌检查
将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。
（二）高氏Ⅰ号培养基的配制
高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：
可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂15～20g，水1000mL，pH7.4～7.6。
l．称量和溶解
先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加入少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL水中加入1g的FeSO4·7H2O，配成浓度为0.01g/mL的贮备液，再在1000mL培养基中加入以上贮备液1mL即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
2．pH调节、分装、包扎及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
（三）马丁氏培养基的配制
马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：
KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，琼脂15～20g，水1000mL，自然pH。
1．称量和溶解
先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需量的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
2．分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
3．链霉素的加入
链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20℃)，在100mL培养基中加1%链霉素0.3mL ，使每毫升培养基中含链霉素30μg。
注意事项：称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。调pH时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。

实验报告：

l．配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?
2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?
3． 细菌能在高氏Ⅰ号培养基上生长吗？为了分离放线菌，你认为应该采取什么措施？
4． 什么是选择性培养基？它在微生物学工作中有何重要性？
5． 如果在用马丁氏培养基分离真菌时，发现有细菌生长，你认为是什么原因？你将如何进一步分离纯化得到所需要的真菌？

实验四 灭菌与消毒

实验目的：

1．了解干热灭菌的原理和应用范围。学习干热灭菌的操作技术。
2．了解高压蒸气灭菌的基本原理及应用范围。学习高压蒸气灭菌的操作方法。
3．了解紫外线灭菌的原理和方法。

实验原理：

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表1），，二是湿热的穿透力比干热大（表2），，三是湿热的蒸气有潜热存在。1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。

表1 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系
卵白蛋白含水量/%
30分钟内凝固所需温度/℃
50
56
25
74～80
18
80～90
6
145
0
160～170

表2干热湿热穿透力及灭菌效果比较
温度/℃
时间/h
透过布层的温度/℃
灭菌
20层
10层
100层
干热130-140
4
86
72
70．5
不完全
湿热105.3
3
101
101
101
完全

在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见（表3）

表3 灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系
压力数
全部空气排出时的温度/℃
2/3空气排出时的温度/℃
1/2空气排出时的温度/℃
1/3空气排出时的温度/℃
空气全不排出时的温度/℃
Mpa
Kg/cm2
Ib/in2
0.03
0.35
5
108.8
100
94
90
72
0.07
0.70
10
115.6
109
105
100
90
0.10
1．05
15
121.3
115
112
109
100
0.14
1.40
20
126.2
121
118
115
109
0.17
1.75
25
130.0
126
124
121
115
0.21
2.10
30
134.6
130
128
126
121

现在法定压力单位己不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其换算关系为：1kg/cm2=98066.5Pa；1Ib/in2=6894.76Pa.
一般培养基用0.1Mpa（相当于15 Ib/in2或1.05kg/cm2），121.5℃，15～30min可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.06Mpa（8Ib/in2或0.59kg/cm2）112.6℃灭菌15min，但为了保证效果，可将其他成分先行121.3oC, 灭菌20min,然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以0.1Mpa，121.5℃灭菌20min即可，而盛于大瓶内的培养基最好以0.1Mpa，122℃灭菌30min。
实验中常用的非自控高压蒸气灭菌锅有卧式和手提式二种，其结构和工作原理相同，本实验以手提式高压蒸气灭菌锅为例，介绍其使用方法，有关自控高压蒸气灭菌锅（autoclave）的使用可参照厂家说明书。
紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200~300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2）。O3和H2O2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯以前；可在无菌室内(或接种箱内)喷洒3%～5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用2%～3%的来苏尔擦洗，然后再开紫外灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。

实验器材：

1．培养基 牛肉膏蛋白胨培养基。
2．溶液或试剂 3%-5%石炭酸或2%-3%来苏尔溶液。
3．仪器或其他用具 培养皿，试管，吸管，电烘箱，培养皿(6套一包)， 手提式高压蒸气灭菌锅，紫外线灯等。

实验内容：

一、干热灭菌
1．装入待灭菌物品
将包好的待灭菌物品（培养皿、试管，吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。
物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。
2．升温
接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温，此时如果还未达到所需的160—170℃温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需温度。
3．恒温
当温度升达到160～170℃时，恒温调节器会自动控制调节温度，保持此温度2h。
干热灭菌过程。严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。
4．降温
切断电源、自然降温。
5．开箱取物
待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。
电烘箱内温度末降到70℃，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
二 高压蒸气灭菌
1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
切勿忘记加水，同时水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。
2．放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121.5℃，20min灭菌。
灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。
5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。
6．将取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，然后放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。
三、紫外线灭菌
l．单用紫外线照射
（1）在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射30min，将开关关闭。
（2）将牛肉膏蛋白胨平板盖打开15min，然后盖上皿盖。置37℃培养24h。共做三套。
（3）检查每个平板上生长的菌落数。如果不超过4个，说明灭菌效果良好，否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。
2．化学消毒剂与紫外线照射结合使用
（1）在无菌室内，先喷洒3%～5%的石炭酸溶液，再用紫外线灯照射15imn。
（2）无菌室内的桌面，凳子用2%～3%来苏尔擦洗，再打开紫外线灯照射15min。
（3）检查灭菌效果。
因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光下工作。

实验报告：

l．在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么?
2．为什么干热火菌比湿热灭菌所需要的温度要高，时间要长?
3．高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？
4．在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素?
5．灭菌在微生物实验操作中有何重要意义?
6．黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的孢子对热的抗性哪个最强?为什么?

实验五 微生物的分离和纯化

实验目的：

掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。

实验原理：

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有简易单细胞挑取法；平板分离法。
本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，包括两个方面
1．选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；
2． 微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通
过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成的。单个菌落并不一定保证是纯培养，纯培养的确定除观察其菌落特征外还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。

实验器材：

1．菌种 米曲霉 (Aspergillus oryzae)。
2．培养基 高氏Ⅰ号培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。
3．溶液或试剂 10%酚 ，盛9ml无菌水的试管 ，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。
4．仪器或者其他用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板等。

实验内容：

1． 稀释涂布平板法
(1) 倒平板 将肉膏蛋白胨琼脂培养基， 高氏Ⅰ号琼脂培养基；马丁氏琼脂培养基加热溶化，待冷至55~60℃， 高氏Ⅰ号琼脂培养基加入10%酚数滴，马丁氏琼脂培养基加入链霉素溶液，混匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。
(2) 制备土壤稀释溶液 称取土样10g，放入盛有90ml无菌水并带入玻璃珠的三角烧瓶，振动约20min，使土样与水分混合，将细胞分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释度的土壤溶液。
(3) 涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4，10-5，10-6三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4，10-5，10-6三管土壤稀释液中各取0.1ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基；
 (4) 培养 将高氏Ⅰ号琼脂培养基平板和马丁氏琼脂培养基平板倒置于28℃温室中培养3~5day，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2~3day；
 (5) 挑菌落 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
2．平板划线分离法
(1)倒平板 按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称，土样编号和实验日期；
(2) 划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-1的土壤悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
 (3) 挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物纯化为止。

实验报告：

1． 如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。
2．为什么高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？
3．在三种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。
4．如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样品为宜?并说明理由。
5．为什么高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？

实验六 微生物的生理生化反应

实验目的：

1．证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。
2．了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
3．了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。

实验原理：

微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实：淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变为深红色，说明胞外存在着脂肪酶。
微生物可以利用各种蛋白质和氨基酸作为氮源外，当缺乏糖类物质时，亦可用它们作为碳源和能源。明胶是由胶原蛋白经水解产生的蛋白质，在25℃以下可维持凝胶状态，以固体形式存在。而在25℃以上明胶就会液化。有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4℃仍能保持液化状态。
还有些微生物能水解牛奶中的蛋白质酪素，酪素的水解可用石蕊牛奶来检测。石蕊培养基由脱脂牛奶和石蕊组成，是昏浊的蓝色。酪素水解成氨基酸和肽后，培养基就会变得透明。石蕊牛奶也常被用来检测乳糖发酵，因为在酸存在下，石蕊会转变为粉红色，而过量的酸可引起牛奶的固化(凝乳形成)。氨基酸的分解会引起碱性反应，使石蕊变为紫色。此外，某些细菌能还原石蕊，