生物化学实验-电泳市公开课获奖课件省名师优质课赛课一等奖课件.ppt
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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考,不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考,不能作为科学依据。本资料仅供参考,不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考!,生物化学试验,Biochemical,Experiment,1/96,人员组成,主讲教师:吕晓玲(教授),刘常金(副教授博士),曹东旭(副教授博士),王德培(副教授博士),白小佳(讲 师博士),李昌模(副教授博士),张 燕(副教授博士),方国臻(副教授博士),试验辅助:高 辉(试验师),姚秀玲(试验师),2/96,试验内容安排,共36课时,1、生物化学试验规则及惯用仪器使用入门(2课时),2、离子交换柱层析法分离氨基酸(5课时),3、3,5二硝基水杨酸法测定还原糖(5课时),4、多酚氧化酶制备、性质及其影响原因(6课时),5、碱性蛋白酶活力测定福林酚试剂法(4课时),6、SDSPAGE分离蛋白质(6课时),7、植物中核酸分离与判定(5课时),8、Bradford法测定蛋白质含量(3课时),3/96,1,试验目标,掌握蛋白质、酶、核酸、糖等主要物质分离、纯化和测定技术原理及方法;,掌握生物化学基本知识、基本理论及基本试验技能,;,培养分析和处理问题能力以及严谨细致科学作风、创新能力等综合素质。,绪论,4/96,2 经过生物化学试验应该做到,学习设计一个试验基本思绪,掌握各个试验基本原理,学会严密地组织自己试验,合理地安排试验步骤和时间。,训练试验动手能力,学会熟练地使用各种生物化学试验仪器。,学会准确翔实地统计试验现象和数据技能,提升试验汇报写作能力,能够整齐清洁地进行全部试验。,掌握生物化学各种基本试验方法和试验技术,尤其是各种电泳技术和层析枝术,为今后参加科研工作打下坚实基础。,5/96,3.1 试验统计,试验前写好试验预习汇报(钢笔和园珠笔)。,试验中应及时准确地统计(专用纸,事先在统计纸上设计好各种统计格式和表格)所观察到现象和测量数据。,试验统计要注意有效数字,如吸光度值应为“0.050”,而不能记成“0.05”。每个结果都要尽可能重复观察二次以上,即使观察数据相同或偏差很大,也都应如实统计,不得涂改。,试验中要详细统计试验条件,如使用仪器型号、编号、生产厂等;生物材料起源、试剂规格、试剂浓度等。,3 试验统计与试验汇报,6/96,3 试验统计与试验汇报,3.2 试验汇报,试验汇报格式应为:,试验目标;,试验原理;,仪器、材料和试剂;,试验步骤;,结果讨论(含数理据处);,注意事项;,(7)思索题,注意:试验结果讨论要充分,尽可能多查阅一些相关文件和教科书,充分利用己学过知识和生物化学原理,进行深入探讨,勇于提出自己独到分析和看法,并欢迎对试验提出改进意见。,7/96,4 试验成绩评分方法,试验预习情况(10%),试验操作情况(20%),试验汇报情况(30%),试验考试成绩(40%),8/96,生物化学试验技术理论,层析技术,9/96,19,俄国科学家M.C.Jber首创了一个从绿叶中分离各种不一样颜色色素成份方法,命名为色谱法(Chromatography),因为翻译和习惯原因又常称为层析法。,80多年来,层析法不停发展,形式各种多样。50年代开始,相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。,几乎每一个层析法都已发展成为一门独立生化高技术,在生化领域内得到了广泛应用。,一、层析技术,10/96,一、层析技术,1、层析技术原理,2、层析技术分类,3、惯用层析技术原理,11/96,1、层析技术原理,层析原理:是一个物理分离方法,利用混合物中各组分物理化学性质差异,使各组分以不一样程度分布在两相中,其中一相为,固定相,,另一相流过此相当作,流动相,,并使各组分以不一样速度移动,从而到达分离目标。,可分离物质:糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。,12/96,2、层析技术分类,名称,操作方式,固定相,流动相,分离依据,分配层析,纸层析,薄层层析,液体,液体,溶解度,离子交换层析,离子交换柱层析,固体,液体,带电性,静电引力,吸附层析,吸附薄层层析,气体吸附层析,固体,固体,液体,气体,吸附力,亲合层析,酶与底物,抗原与抗体,固体,液体,配体专一性,凝胶层析,凝胶过滤,固体,液体,分子大小,13/96,3、惯用层析原理,(1)分配层析纸层析,原理:溶质在互不相溶两相中溶解度不一样,在终点时到达一个平衡,其比值为一个常数,即分配系数(,)。,固定相内溶质浓度,流动相内溶质浓度,固定相:滤纸上吸附水,流动相:有机溶剂(正丁醇),=,14/96,128,64,64,32,64,32,16,48,48,16,8,32,48,32,8,4,20,40,40,20,4,2,12,30,40,30,12,2,15/96,纸层析,纸层析是最简单液一液相分配层析。,滤纸是纸层析支持物。当支持物被水饱和时,大部分水分子被滤纸纤维素牢牢吸附,所以,纸及其饱和水为层析固定相,与固定相不相混溶有机溶剂为层析流动相。,对一些特定化合物,在特定展层系统,一定温度条件下,R,f,是个常数。,16/96,(2)离子交换层析,原理:将能与周围介质进行离子交换不稳定离子固定于惰性基质上,从而分离介质中组分。,惯用惰性基质:人工合成树脂(单体:苯乙烯、交联剂:二乙烯苯),阳离子交换剂:磺酸甲基、羧甲基、磷酸基,阴离子交换剂:二乙基胺乙基、三乙基胺乙基,可交换离子:阳离子:Na,+,、H,+,阴离子:Cl,-,、OH,-,17/96,示意图(交换树脂表面),18/96,示意图(离子交换过程),电离基团(磺酸根),可交换离子(钠离子),交换离子,不交换离子,19/96,示意图,水分子,B物质,A物质,20/96,(3)吸附层析,原理:当气体或液体中某组分分子在运动中碰到一个固体表面时,分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开,此为吸附现象。,吸附现象形成原因:,吸附作用可能由几个作用力形成,包含被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间静电引力(形成离子键)、氢键及范德华引力等。,在不一样条件 下,占主要地位作用力可能不一样,也可能几个力同时起作用,吸附剂:氧化铝、活性炭、硅胶;纤维素、淀粉、聚酰胺;滑石、陶土、粘土。,21/96,吸附层析示意图,吸附剂,易吸附分子,不易吸附分子,22/96,(4)亲和层析,原理:,利用分子间含有专一亲和力而设计层析技术。,专一亲和力分子对:,酶与底物、特异性抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体,载体:,使亲和物固相化水不溶性化合物。如:纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。,23/96,24/96,(,5,),凝胶过滤,原理:,被分离物质因分子大小不一样,在凝胶中向下移动速度不一样。,物质进入凝胶柱之后有两种运动方式:垂直向下移动和无定向扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内,只能分布于颗粒间隙中向下移动快,而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内,所以向下移动慢。,凝胶物质:,马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。,25/96,26/96,电 泳 技 术,一.电泳概念,二.电泳技术分类,三.电泳技术基本原理,四.几个常见电泳方法比较,五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理,27/96,一.电泳概念,带电质点在电场中移动现象,。,28/96,二.电泳技术分类,29/96,三.电泳技术基本原理,1.基本原理,不一样带电颗粒在同一电场中泳动速度,主要与其所带净电荷量,分子量及分子形状相关。,pH pI,分子带负电荷,在电场中向正极移动;,pH,蛋,Gly,m,cl,cl,m,蛋,蛋,m,Gly,Gly,凝胶中Cl,为快离子,Gly,为慢离子,蛋白质样品被夹在中间。,缓冲液,样品,浓缩胶,分离胶,39/96,缓冲液成份及pH不连续性造成蛋白质样品浓缩效应示意图,快离子,慢离子,蛋白质样品,40/96,E:,每厘米电压降,EI(电流强度)/,(电导率),E与电泳速度成正比,电泳开始后,因为快离子泳动率最大,在快离子后面形成一个离子浓度低低电导区,产生较高电位梯度,使蛋白质和慢离子加速移动,蛋白质样品被深入浓缩。,电位梯度不连续性,41/96,E:,每厘米电压降,EI(电流强度)/,(电导率),E与电泳速度成正比,电泳开始后,因为快离子泳动率最大,在快离子后面形成一个离子浓度低低电导区,产生较高电位梯度,使蛋白质和慢离子加速移动,蛋白质样品被深入浓缩。,电位梯度不连续性,42/96,A.,样品浓缩效应,四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含,:,缓冲液成份及pH不连续性,电位梯度不连续性,缓冲液,浓缩胶,样品,分离胶,43/96,A.,样品浓缩效应,四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含,:,凝胶层不连续性:,样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液,pH8.3),蛋白质从“”极向“”极移动,从浓缩胶进入分离胶,速度变慢,堆积浓缩。,缓冲液,样品,浓缩胶,分离胶,44/96,A.,样品浓缩效应,四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含,:,凝胶层不连续性:,样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液,pH8.3),蛋白质从“”极向“”极移动,从浓缩胶进入分离胶,速度变慢,堆积浓缩。,缓冲液,样品,浓缩胶,分离胶,45/96,A.,样品浓缩效应,四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含,:,凝胶层不连续性:,样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液,pH8.3),蛋白质从“”极向“”极移动,从浓缩胶进入分离胶,速度变慢,堆积浓缩。,缓冲液,浓缩胶,分离胶,46/96,A.,样品浓缩效应,四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含,:,凝胶层不连续性:,样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液,pH8.3),蛋白质从“”极向“”极移动,从浓缩胶进入分离胶,速度变慢,堆积浓缩。,缓冲液,浓缩胶,分离胶,47/96,B.电荷效应,蛋白质样品进入分离胶后,pH增大(pH 8.9),Gly,解离度增大,不存在快、慢离子之分,蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。,因为各种蛋白质pI不一样,所载有效电荷不一样,所以质点 有效迁移率不一样,形成不一样区带。,缓冲液,浓缩胶,分离胶,48/96,C.分子筛效应,分离胶孔径小,各分子因为大小和形状不一样,所受阻力不一样,表现出不一样 泳动速度,即分子筛作用。分子量小,形状为球形泳动速度最快。,缓冲液,浓缩胶,分离胶,49/96,试验一 离子交换层析法分离氨基酸,一、试验目标,学习用阳离子交换树脂分离氨基酸,操作方法和基本原理,二、原理,氨基酸PI不一样,在同一pH下所带电荷数量和性质不一样,与树脂亲和力就有差异,所以可依据亲和力从小到大次序依次被洗脱下来。,阳离子交换树脂:可供交换是阳离子;,阴离子交换树脂:可供交换是阴离子;,50/96,离子交换层析法分离氨基酸,三、操作步骤,1、装柱,装柱是,最关键,一步。,重力沉降法装柱,陆续不停地添加糊状物,使其形成胶粒床面上有胶粒连续,均匀地沉降,,直至装柱物完全沉降至适当柱床体积为止。,柱表面一直要保持着一层溶剂(普通l3cm柱高)柱任何一部分绝对,不能“流干”。,51/96,1、装柱,层析柱形状,普通直径,与高度比为l:15为宜。,柱形必须依据层析介质和,分离目标而定。待分离物,质性质相近,柱越,细长,,,则分离效果越好,但流速,较慢。在样品组分并不复,杂情况下,采取“,矮胖,柱”。,52/96,2、平衡,层析柱正式使用前,必须平衡至所需pH和离子强度,普通用起始缓冲液在恒定压力下走柱,其洗脱体积相当于,4-6倍,床体积,使交换剂充分平衡,柱床稳定。装好柱必须,均匀,无纹路,不含气泡,,柱顶交换剂沉积表面十分平坦。,本试验平衡体积:,6080mL,调整流速:,0.5mL/min,或,8-12滴/min,53/96,3、加样,上样量:,0.3-0.5mL,0.5mL缓冲液冲洗加样处,2,次,注意:,加样同时开始搜集,加样时且勿搅动树脂床面,54/96,4、洗脱与搜集,尽可能维持衡定柱压,每2分钟搜集一管,共搜集25管,5、氨基酸判定,每个搜集管,1mL水合茚三酮,沸水浴15min,比色测定,绘制洗脱曲线,55/96,试验二 SDS-PAGE分离蛋白质,一、试验目标,掌握SDS-PAGE工作原理和操作方法,二、原理,不一样蛋白质含有不一样分子量,并在一定pH溶液中带有不一样电荷。但经过SDS处理后蛋白质,分子表面完全被负电荷所覆盖,所以在电泳时,电泳迁移率近取决于蛋白质分子量大小而与其所带电荷性质无关。,分子筛效应,浓缩效应,56/96,SDS-PAGE分离蛋白质,三、操作步骤,57/96,58/96,1.安装膜具,59/96,装封胶条,注意封胶条平面朝下,不能有裂口,60/96,盖上凹玻璃,61/96,将凹玻璃冲外装进槽里,62/96,将楔子插进,将底部插紧,63/96,2.配制凝胶溶液,胶配制(平行电泳两块胶板),胶母液:8,.,4,ml,配胶缓冲液:13ml,蒸馏水,:4ml,10%TEMD:0.2ml,,混匀,10%AP:0.2ml,,混匀,3.灌胶,加到顶部,往返倾斜去气泡,64/96,插入梳子,65/96,胶凝后用夹子将玻璃夹出,66/96,用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉,67/96,旋转180度,凹玻璃向里,68/96,将玻璃放进槽内,69/96,加缓冲液,70/96,4.样品制备:,将0.5ml 样品液,0.25ml 10%SDS和0.25ml 1%巯基乙醇于小试管中,置100水浴中煮沸3分钟后,取出冷却,然后,加入0.25ml 上样缓冲液(0.05%溴酚兰+40%蔗糖溶液),混合。取出混合样品40微升加入样品槽,每个样品重复两个。,71/96,5.加 样,72/96,6.电泳,73/96,电泳:,接通电源,电流恒定为80mA,待溴酚兰指示剂移至离下端0.5cm(约3小时),切断电源,拔去插头,倒出电极缓冲液于大烧杯中(如此缓冲液欲重用时,应把正负电极液分别贮存)。,74/96,7.剥 胶,75/96,8 染色:,考马斯亮蓝染色,详见教材,9 脱色,76/96,凝胶(脱色之后)结果分析,1,、计算迁移率(,R,m,值):计算公式见教材。,2、绘制标准曲线:以标准蛋白亚基R,m,值为横坐标,以对应分子量对数值为纵坐标,即可绘制出测定蛋白质分子量标准线图。,3、计算未知蛋白亚基样品分子量:依据未知样品样R,m,值,从上述标准曲线图中即可查出其分子量。,77/96,试验三 DNS法测定还原糖,一、试验目标,掌握还原糖定量测定原理和方法,二、原理,在碱性溶液中,还原糖变为烯二醇,烯二醇可被3,5二硝基水杨酸(DNS)氧化为糖酸,加热深入产生一个红棕色氨基化合物,在一定浓度范围内,棕红色物质颜色深浅程度与还原糖量成正比,以此测定糖量。,78/96,三、操作步骤,1、葡萄糖标准曲线绘制,详见教材,2、还原糖制备,样品:苹果,滤液测定前稀释4倍,其余操作见教材,3、样品酸水解和总糖提取,滤液测定前稀释2倍,其余操作见教材,4、苹果样品中总糖和还原糖测定,详见教材,79/96,试验四 多酚氧化酶制备、性质和影响原因,一、试验目标,学习从组织细胞中制备酶方法,掌握多酚氧化酶作用、化学性质及影响原因,二、原理,多酚氧化酶催化儿茶酚氧化成儿茶醌,深入聚合成褐色物质;,经过反应液颜色改变可大致判断反应程度,进而推测酶作用及活力大小;,酶是生物催化剂,易受到各种原因影响,如温度、pH、底物浓度、酶浓度等。,80/96,三、操作步骤,1、酶制备,150g土豆,(3组),150mL NaF溶液,匀浆,四层纱布,过滤,每组取,50mL,16g固体硫酸铵,4,30min,离心15min,4000r/min,沉淀溶于,15mL缓冲液中,粗酶液,81/96,2、多酚氧化酶作用,三、操作步骤,酶液,邻苯二酚,水,现象,管1,15d,15d,管2,15d,15d,管3,15d,15d,37水浴反应,每间隔5min振荡,观察颜色改变,共25min。,82/96,3、多酚氧化酶化学性质,三、操作步骤,酶液,变性剂,邻苯二酚,反应,现象,管1,15d,15d,37水浴10min,管2,10d,10d三氯乙酸,2min,10d,37水浴10min,管3,15d,苯硫脲结晶,5min,15d,37水浴10min,37水浴反应,10min。,83/96,4、底物专一性,三、操作步骤,酶液,邻苯二酚,间苯二酚,对苯二酚,现象,管1,15d,15d,管2,15d,15d,管3,15d,15d,37水浴反应,每间隔5min振荡,观察颜色改变,共25min。,84/96,5、底物浓度影响,三、操作步骤,37水浴反应,1min。,酶液,邻苯二酚,水,反应,现象,管1,5d,1d,39d,37水浴1min,管2,5d,10d,30d,37水浴1min,管3,5d,40dd,37水浴1min,85/96,6、酶浓度影响,三、操作步骤,37水浴反应,2min。,酶液,邻苯二酚,水,反应,现象,管1,15d,15d,37水浴2min,管2,1d,15d,14d,37水浴2min,86/96,7、H,+,浓度影响,三、操作步骤,37水浴反应,5min。,0.8%HCl,0.3%乳酸,0.2%乳酸,0.01%Na,2,CO,3,0.5%Na,2,CO,3,酶液,邻苯二酚,现象,管1,40d,8d,7d,管2,40d,8d,7d,管3,40d,8d,7d,管4,40d,8d,7d,管5,40d,8d,7d,87/96,试验五 碱性蛋白酶活力测定(福林酚试剂法),一、试验目标,学习测定蛋白酶活力方法,掌握分光光度计原理和使用方法,二、原理,酪蛋白,蛋白酶,酪氨酸,比色测定,钼蓝,钨蓝,酪氨酸,福林酚,88/96,1、样品处理,三、操作步骤,详见教材,2、比色测定,4支试管,分别加入1mL酶液,40预热23min,空白管,平行管,1mL 2%酪蛋白,40,10min,1mL 2%酪蛋白,40,15min,2mL 三氯乙酸,40,15min,2mL 三氯乙酸,40,10min,过滤,分别取1mL滤液,(1),(2),(3),89/96,三、操作步骤,2、比色测定,过滤,分别取1mL滤液,(3),分别加入5mL Na,2,CO,3,溶液,1mL福林酚试剂,(4),40反应20min,(5),(6),比色测定A,680,,管做参比,90/96,三、操作步骤,3、绘制标准曲线,(1)按教材表322加各种试剂,,福林酚试剂最终加入;,(2)摇匀,40反应20min;,(3)比色测定A,680,,管1做参比;,(4)绘制标准曲线,求K值。,4、酶活力计算,91/96,试验六 菜花中核酸分离与判定,一、试验目标,学习和掌握从植物组织中分离核酸原理和方法,掌握定糖法测定核酸原理及操作方法,二、原理,核酸提取:三氯乙酸或高氯酸除酸溶小分子,有机溶剂去脂类,浓盐溶液(10NaCl)提DNA,0.5M高氯酸提RNA,RNA核糖测定:苔黑酚法,DNA脱氧核糖测定:二苯胺法,92/96,三、操作步骤,1、核酸分离,菜花花冠,20g,20mL95乙醇海砂,匀浆,抽滤,滤渣,抽滤,提取物一,搅拌均匀,抽滤,20mL丙酮,滤渣,20mL丙酮,搅拌5min,抽滤,滤渣,20mL高氯酸,冰盐浴,搅拌,抽滤,滤渣,20mL95乙醇,滤渣,20mL丙酮,搅拌5min,抽滤至干,滤渣,40mL10,氯化钠,沸水浴,15min,抽滤,滤渣,滤液,重复一次,20mL高氯酸,70水浴20min,抽滤,滤液,提取物二,93/96,三、操作步骤,2、RNA和DNA定性判定,(1)二苯胺反应,按教材表315加入各种试剂,反应后观察并统计结果。,(2)苔黑酚反应,按教材表316加入各种试剂,反应后观察并统计结果。,94/96,试验七 Bradford法测定蛋白质含量,一、试验目标,学习考马斯亮蓝G250染色法测定蛋白质含量原理和方法。,二、原理,考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后引发染料最大吸收光改变,从465nm变为595nm;,蛋白质染料复合物有较高消光系数,蛋白最低检出量为1微克,灵敏度高;,反应快速,2min,且结合物在1h内稳定;,干扰物质少。,95/96,三、操作步骤,1、牛血清白蛋白标准曲线制作,按教材表312加入试剂;,反应2min,以1号管为参比,测定A595;,绘制标准曲线。,2、未知样品中蛋白质浓度测定,详见教材,96/96,- 配套讲稿:
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