知母拮抗内生细菌的筛选及发酵条件优化_孟千琪.pdf

知母拮抗内生细菌的筛选及发酵条件优化孟千琪1，王志清1，刘桂英2，马静1，吕静1，田义新1*（1.吉林农业大学中药材学院，长春 130118；2.白山市江源区农业农村局，吉林 白山 134700）摘要：从分离出的知母内生细菌中筛选对人参 6 种常见病原菌和细辛 3 种常见病原菌有拮抗作用的菌株，为生物防治中药材病害提供基础。釆用组织切片法和组织研磨法及菌丝生长速率法分离、筛选拮抗内生细菌。根据 16S rDNA 序列和系统发育树分析，对抑菌活性达到显著水平（P0.05）的菌株进行菌种鉴定，并利用菌丝生长速率法检测活性菌株发酵液的抑菌率。通过正交试验优化该菌株的发酵条件。知母中分离出 359 株内生细菌，筛选出 3 株内生细菌 BR10、BR11、BR26对这9种病原菌均有拮抗作用且抑菌活性较强，最高抑菌率达92.41%。16S rDNA序列系统发育分析结果显示BR11与多株水拉恩氏菌的亲缘关系最近，且处于系统发育树的同一分支，故将 BR11菌株鉴定为水拉恩氏菌 Rahnella aquatilis。确定了 BR11菌株最佳培养基配方与培养条件：牛肉膏 1.5%、葡萄糖 1.5%、酵母膏 0.5%、MgSO40.15%，初始 pH值 7.5，温度29，发酵时间72 h。知母内生细菌BR11是防治人参、细辛病害的优良候选菌株。关键词：知母；内生细菌；病原菌；拮抗菌；发酵条件优化中图分类号：S567.23+9文献标识码：A文章编号：2096-5877（2023）01-0045-05Screening of Antagonistic Endophytic Bacteria from Anemarrhena asphodeloidesand Optimization of Fermentation ConditionsMENG Qianqi1,WANG Zhiqing1,LIU Guiying2,MA Jing1,LYU Jing1,TIAN Yixin1*(1.College of Traditional Chinese Medicine,Jilin Agricultural University,Changchun 130118;2.Agricultural andRural Bureau of Jiangyuan District,Baishan 134700,China)Abstract：To screen antagonistic endophytic bacteria isolated from the plant of Anemarrhena asphodeloides,ofwhich could inhibit six common diseases of Panax ginseng and three ones of Asarum sclerotium,to provide a basefor biological control of some Chinese medicinal materials.The antagonistic endophytic bacteria were isolated andscreened by tissue slicing,tissue grinding and hyphal growth rate.The strains with significant bacteriostatic activity(P0.05)were identified according to 16S rDNA sequence and phylogenetic tree analysis,and the bacteriostatic rateof fermentation broth of active strains was detected by hyphal growth rate method.The fermentation conditions of thestrain were optimized by orthogonal test.From the 359 endophytic bacteria isolated from the plant of A.asphodeloides three endophytic bacteria were screened,they are strains of BR10,BR11and BR26,and all of them have had antagonistic effect and strong bacteriostatic activities to the nine pathogens,there was a highest bacteriostatic rate92.41%of them.The results of phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence showed that the BR11 had the closestrelationship with many strains of Rahnella aquatilis,and was in the same branch of the phylogenetic tree,so theBR11 strain was identified as R.aquatilis.The optimum medium formula and culture conditions of BR11 strainswere determined:beef paste 1.5%,glucose 1.5%,yeast extract 0.5%,MgSO40.15%,initial pH value 7.5,temperature 29,fermentation time 72 h.The endophytic bacteria BR11 from A.asphodeloides is an excellent candidatefor the control of ginseng and Asarum diseases.Key words：Anemarrhena asphodeloides Bunge;Endophytic bacteria;Pathogenic bacteria;Antagonistic bacteria;Optimization of fermentation conditions收稿日期：2020-02-29基金项目：吉林省科技厅技术攻关项目（20190304017YY）;吉林省科技厅医药健康专项（20191102038YY）作者简介：孟千琪（1994-），女，在读硕士，从事药用植物规范化栽培及育种研究。通讯作者：田义新，男，博士，教授，E-mail:孟千琪等：知母拮抗内生细菌的筛选及发酵条件优化东北农业科学2023，48（1）：45-49，66Journal of Northeast Agricultural SciencesDOI:10.16423/ki.1003-8701.2023.01.01046东 北 农 业 科 学48卷知母（Anemarrhenaas phodloides Bunge）为百合科知母属植物，以干燥根茎入药。常用于治疗外感热病、高热烦渴、肺热燥咳等症。知母的有效成分主要为芒果苷、知母皂苷 B等皂苷类成分1，具有抗肿瘤、抗凝血等多种药理活性2。知母主要分布于我国北方地区，生于山地、干燥丘陵或草原地带；栽培范围较广，主产于河北、河南、山东、山西等省，是常见的大宗药材3。目前中药材种植中，化学农药防治仍是普遍采用的防治手段。为降低药材农残，提高药材质量安全、实现药材绿色生产，利用拮抗微生物对药用植物病害进行防治是最有效的手段之一4。由于生物防治具有靶标性强、环保且无毒无残留等优点，越来越受到重视，也逐渐成为化学农药重要的替代品5。知母适种范围广，已经发现其提取物对马铃薯疫病有拮抗作用6。目前，对于知母内生菌的研究尚未见报道。因此，筛选具有拮抗作用的知母内生菌优势菌株并优化其培养条件，用于防治东北道地药材常见病害，对发展绿色中药种植具有重要意义和广阔的应用前景7。1材料和方法1.1供试材料及培养基知母样品的来源见表1。表 1植物样品来源采集日期2018年6月2018年6月2019年6月2019年6月2019年6月2019年6月地点吉林长春吉林昌邑辽宁抚顺甘肃兰州安徽合肥河北保定经度东经：1251718.42东经：1263427.70东经：1235625.90东经：103437.61东经：1154644.90东经：1152731.50纬度北纬：434959.77北纬：435254.73北纬：415320.29北纬：360614.26北纬：335235.08北纬：385239.25人参 6 种常见病害致病菌：根腐病（Fusariumsolani）、灰霉病（Botryis cinerea）、锈腐病（Cylindrocarpon destructans）、黑斑病（Alternaria panax）、疫病（Phytophthora cactorum）、立 枯 病（Rhizoctonia solani），3 种细辛常见病害致病菌：菌核病（Sclerotinia asari）、锈病（puccinia asarina）、叶枯病（Mycocentrospora acerina），分别由吉林农业大学植物保护学院和中药材学院提供。使用 NA（牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉）、NB（牛肉膏、蛋白胨）培养基。1.2内生菌的分离纯化供试样品的根、根茎和叶片用蒸馏水冲洗干净表面泥沙，用无菌滤纸吸干表面附水。切成 2cm 见方的小块（段、片），先用 75%乙醇进行表面消 毒 30 s，根 用 0.2%HgCl2消 毒 9 min；根 茎 用0.2%HgCl2消毒 7 min；叶用 2%NaClO 消毒 3 min。消毒后用无菌水冲洗 35 次后接入牛肉膏蛋白胨培养基，并将最后一次冲洗的无菌水涂布在平板上作为对照，15 d 后无菌体生长即为消毒成功。内生菌分离方法采用组织切片法和组织研磨法8，将处理好的组织碎块接入 NA 培养基培养，在(281)下培养，每隔 2 d 观察一次。获得的内生菌采用划线法纯化后4 保存备用。1.3拮抗菌株的筛选采用菌丝生长速率法9，以未加发酵菌液的平板为对照组，每组3次重复，测量菌落直径、计算抑菌率。SPSS 18.0软件分析。抑菌率计算公式如下。抑菌率=对照组菌落直径-测试组菌落直径对照组菌落直径 100%1.4拮抗菌分子鉴定根据分离出的内生菌形态学进行初步鉴定。后将样品内生细菌接入到 PDB 培养基中（261）160 r/min震荡培养。使用北京百泰克生物技术有限 公 司 生 产 的 Bio Tekecat#DP2001 细 菌 基 因 组DNA 提取试剂盒(离心柱型)提取样品 DNA。以提取的细菌 DNA 样品为模板，用表 2 中列出的通用引物进行16S PCR扩增10。表 2引物序列引物名称27f1492r引物序列（5-3）AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTTPCR 反应总体积 50 L，其中含 2PCR MIX25 L，ddH2O 15 L，引物各 2.5 L，基因组 DNA5 L。PCR 反应条件为 94，预变性 5 min，以 35个循环 94 变性 40 s，53 退火 60 s，72 延伸90 s，最后以 72 延伸 10 min。扩增产物在 1%琼脂糖凝胶上分离，80 W恒定功率下电泳11。1.5序列测定与比较将有明显条带的 PCR 产物进行测序（生工生物工程（上海）股份有限公司完成），序列测定结果比较分析采用 BLAST（https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.）进行，MEGA7.0（分子进化遗传分析软件）建立系统发育树。1.6拮抗菌株培养条件优化1.6.1正交试验正交试验设计参照宋芳旭等方法12，分析牛1期孟千琪等：知母拮抗内生细菌的筛选及发酵条件优化47肉膏（A）、葡萄糖（B）、酵母膏（C）、MgSO4（D）4 因素3水平的影响作用，结果见表3。表 3L9（34）正交试验因素水平水平123因素A0.51.01.5B0.51.01.5C0.51.01.5D0.050.150.101.6.2培养条件优化以优化后的发酵培养基为基础，检测目标拮抗菌株在不同培养条件下发酵液的抑菌效果。设置起始pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0共8个处理，其他条件一致，接种后于28、180 r/min培养 4d，检测抑菌效果，确定最适起始 pH 值。设置温度 20、23、26、29、32、35 共 6 个处理，培养 4 d，检测抑菌效果，确定最适培养温度。设置发酵时间 12、24、36、48、72、96、120 h 共 7 个处理，培养后检测抑菌效果，确定最适发酵时间。2结果与分析2.1知母内生菌分离结果从 6 个产地知母样品叶中得到 31 株内生菌，其中 28 株细菌、3 株真菌；根茎中得到 131 株内生菌，其中 97 株细菌、33 株真菌、1 株放线菌；根中得到 309 株内生菌，其中 219 株细菌、88 株真菌、2株放线菌。合计 507 株内生菌，其中 359 株细菌、145株真菌、3株放线菌；在这些内生菌中，长春产地样品分离得到 99 株细菌、21 株真菌、1 株放线菌；吉林昌邑产地分离得到 62株细菌、37株真菌；辽宁抚顺产地分离得到 47 株细菌、15 株真菌、1株放线菌；甘肃兰州产地分离得到 72 株细菌、11株真菌；安徽合肥产地分离得到 40株细菌、8株真菌、1 株放线菌；河北保定产地分离得到 39 株细菌、53株真菌。2.2拮抗菌株的筛选以 6 种人参常见病害和 3 种细辛常见病害作为指示菌，筛选获得 9 株均具有抑菌活性的内生拮抗细菌，其中 3株内生菌抑菌活性较强，分别为BR10、BR11、BR26（图1A）。2.2.1对人参6种病原菌拮抗能力的影响3 种拮抗内生细菌对 6 种人参病原菌的抑菌率情况见表4。知母内生菌对 6 种人参常见致病菌有较好效果（图 1B）。菌株 BR11 表现最好，对 Rhizoctoniasolani 的抑菌率可达 70.48%，显示显著拮抗作用（P0.05），对 Cylindrocarpon destructans 的 抑 菌 率表 4BR10、BR11、BR26对 6种人参病原菌的抑菌率病原菌名称Fusarium solaniBotryis cinereaCylindrocarpon destructansAlternaria panaxPhytophthora cactorumRhizoctonia solaniBR10抑菌率（%）(xs，n=3)22.170.0221.560.0214.250.0326.260.0435.860.0212.430.04BR11抑菌率（%）(xs，n=3)32.190.0143.260.0265.130.0443.380.0457.440.1370.480.05aBR26抑菌率（%）(xs，n=3)16.980.0133.080.0354.230.0523.870.0433.760.0745.910.11 BR10 BR11 BR26 A CK CK 图 1 拮抗能力较强的内生菌株及菌株 BR11 的拮抗效果 注：每条之后数字为 GenBank 序列号；节点处数字为 Bootstrap 值 图 2 BR11 菌株系统发育树 B C CK CK 图1拮抗能力较强的内生菌株（A）及菌株BR11的拮抗效果（B、C）48东 北 农 业 科 学48卷65.13%，对 Phytophthoracactorum 的 抑 菌 率57.44%，对 Alternaria panax 的 抑 菌 率 43.38%，对Botryis cinerea 的抑菌率 43.26%，对 Fusarium solani的抑菌率32.19%（表4）。2.2.2对细辛3种病原菌拮抗能力的影响3 种拮抗内生细菌对 3 种细辛病原菌的抑菌率情况见表5。表 5BR10、BR11、BR26对 3种细辛病原菌的抑菌率病原菌名称Sclerotinia asariPuccinia asarinaMycocentrospora acerinaBR10抑菌率（%）(xs，n=3)34.240.0324.540.0137.470.02BR11抑菌率（%）(xs，n=3)92.410.02a22.070.0534.980.01BR26抑菌率（%）(xs，n=3)39.460.0428.740.0336.470.01菌株 BR11 同样表现最好，对 Mycocentrosporaacerina 的抑菌率为 34.98%，对 Puccinia asarina 的抑菌率为 22.07%，对菌核病菌 Sclerotinia asari 的抑菌率高达 92.41%，且有显著拮抗作用（PBDC，从表 6可知最佳培养基配比为 A3B3C1D2，即牛肉膏1.5%、葡萄糖1.5%、酵母膏0.5%、MgSO40.15%。2.4.2培养条件的优化采用最优培养基，对菌株 BR11的发酵条件进行优化，结果表明，不同培养条件对该菌株发酵液的抑菌活性影响较大，如图 3 所示。初始 pH 值为 7.5 时抑菌活性最强（图 3A）；培养温度在 29 时，抑菌活性最强，抑菌率可达 97.31%（图 3B）；发酵时间与发酵液抑菌活性呈正相关，培养 72 h 时拮抗菌株 BR11 的抑菌活性最强，可达 98.09%，随后随着培养时间增长，抑菌活性逐渐下降(图 3C)。综上可知，拮抗菌株 BR11 发酵培养条件 pH 为 7.5是最适初始值，29 是最适培养温度，72 h 是最适培养时间。使用优化后的培养基配方和发酵条件培养 BR11 菌株进行验证。结果表明，优化后BR11菌株等量发酵液的抑菌率为98.79%，显著（P0.05）大于 PDB 培养基发酵液的抑菌率 92.41%，同时，对其余6种人参常见病害和2种细辛常见病害的抑菌率均有一定提高。表明优化后的发酵培养基组成与发酵条件有利于抑菌活性物质的生成。1期孟千琪等：知母拮抗内生细菌的筛选及发酵条件优化493讨论本研究从知母根、根茎、叶中经分离、纯化、筛选获得拮抗内生细菌水拉恩氏菌 BR11，菌株优化后发酵液对细辛菌核病抑制率高达 98.79%。同时，对人参 6 种常见病害和细辛另外 2 种常见病害均有较好的拮抗效果，并从 6 个产地分离得到该菌株。水拉恩氏菌 BR11 是 1 株容易获得且值得进一步研究及开发的优势生防菌株。研究表明，水拉恩氏菌在生物防治上有出色的表现。水拉恩氏菌对防治葡萄根癌病和杨树溃疡病均有显著效果。水拉恩氏菌能产生嗜铁素、纤维素酶和磷酸酯酶等物质10-12。多数细菌和真菌都能产生嗜铁素、磷酸酯酶等物质。这些物质对破坏病原菌细胞膜透性、可溶性糖含量和 MDA 含量有很大影响12-13。还可以在植物生长过程中通过争夺铁营养影响宿主植物的病原微生物的正常生长繁殖。嗜铁素能由拮抗细菌产生，并能螯合铁元素供给植物铁营养，促进植物健康生长14。同时，磷酸化蛋白质、磷酸单酯类等物质可以由磷酸酯酶水解，这些物质可以参与磷代谢，在宿主植物生长发育和代谢调节中起到主要作用15-17。由此看来，水拉恩氏菌作为内生细菌与宿主植物共生的同时所产生的次生代谢产物，不仅干扰病原菌的正常生长、起到营养竞争作用，还可以参与代谢提高植物长势，最终起到拮抗作用。因此，可以推测菌株 BR11也可能具有这样的拮抗机制，有待进一步探究。综上，菌株 BR11是知母内生细菌中作为生防拮抗菌株易分离获得且有显著优势的菌株。知母种植范围广，适应性强，无常见病害17。取材便利，其内生菌 BR11 有广谱拮抗效果，可进一步深入探究该菌株抑制作用机理，并评估其田间防治效果，为生产成型的抑菌剂奠定坚实基础。参考文献：1 国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版（1部）S.北京：中国医药科技出版社，2015.2 刘艳平.知母皂苷成分的药理活性及作用机制研究进展J.药学实践杂志，2018，36（1）：24-29.3 吉星，冯毅凡.知母中皂苷类成分研究进展J.中草药，2010，41（4）：680-683.4 孔阳，马养民，王佳运，等.一株烟曲霉抗植物病原菌活性次生代谢产物的研究J.东北农业科学，2019，44（2）：34-38.5 傅巧真，路俊仙，王萌，等.中药材农药残留原因及防治措施的研究进展J.时珍国医国药，2014，25（4）：925-927.6 宋风平.知母提取物对马铃薯晚疫病防治作用机制及其抑菌活性成分研究D.保定：河北农业大学，2009.7 康传志，郭兰萍，周涛，等.中药材农残研究现状的探讨J.中国中药杂志，2016，41（2）：155-159.（下转第66页）表 6菌株 BR11L9(34)培养基正交设计及试验结果编号123456789X1X2X3K1K2K3RA111222333119.09170.51266.8839.7056.8488.9649.26B123123123141.59161.23253.5747.1953.7484.5237.33C123231312207.92155.54193.0269.3151.8564.3417.46D123312231154.57216.20185.7151.5272.0761.9120.55细辛菌核病菌抑菌率（%）22.2331.8964.9732.2940.9897.2487.0788.4591.36 0501001505.56.06.57.07.58.08.5抑菌率（%）pHA050100150202326293235抑菌率（%）温度（）B050100150122436487296120抑菌率（%）时间（h）C 0501001505.56.06.57.07.58.08.5抑菌率（%）pHA050100150202326293235抑菌率（%）温度（）B050100150122436487296120抑菌率（%）时间（h）C 0501001505.56.06.57.07.58.08.5抑菌率（%）pHA050100150202326293235抑菌率（%）温度（）B050100150122436487296120抑菌率（%）时间（h）C图3不同培养条件对菌株BR11发酵液抑菌率的影响66东 北 农 业 科 学48卷差，应与分子标记等方法结合进行遗传多样性研究。其中对荚型、光泽、质地、荚面切面等这些质量性状的遗传规律分析，将对菜豆种质资源进一步创新利用中选配亲本、预测杂交后代分离等具有战略意义，这与华劲松等21的研究一致。生物学特性调查是种质资源研究的最基础研究22。菜豆特别是油豆角以嫩荚作为菜用，含多种营养成分，受到人们的喜爱23。鉴于以上基础，下一步将开展菜豆营养成分及生物和非生物胁迫方面的研究，为建立和完善东北菜豆种质资源提供依据。参考文献：1 郑卓杰.中国食用豆类学M.北京：中国农业出版社，1997：222-249.2 郑卓杰.中国食用豆类品种资源目录（第一集）M.北京：中国农业科技出版社，1983：277-359.3 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