抑制脊髓NMDAR⁃cADPR⁃RyRs信号通路减弱瑞芬太尼诱发的大鼠术后痛觉过敏.pdf

年 月第 卷 第 期基础医学与临床 收稿日期：修回日期：基金项目：国家自然科学基金（，）；江苏省自然科学基金（）通信作者（）：文章编号：（）研究论文抑制脊髓 信号通路减弱瑞芬太尼诱发的大鼠术后痛觉过敏钱 玥，王 芳，张 兢，夏天娇，顾小萍 南京医科大学 附属鼓楼临床医学院 麻醉科，江苏 南京；南京大学 医学院，江苏 南京 摘要：目的 探讨 信号通路在瑞芬太尼诱发的大鼠痛觉过敏中的作用。方法 建立瑞芬太尼诱发（术后）痛觉过敏（）大鼠模型。将大鼠按随机数字表法分为 组（）：对照组、手术组、痛觉过敏（）组、氯化钠溶液组、氯胺酮组和环状二磷酸腺苷核糖（）拮抗剂组。在术前和术后第、天检测机械缩足阈值（）和热缩足潜伏期（）阈值。检测脊髓背角神经元中、和 和 的蛋白水平；酶循环法测量 浓度。结果 与手术组相比，组在输注瑞芬太尼后第 和第 天 和 显著降低，同时脊髓背角、和 水平显著上调（）。鞘内注射氯胺酮或 后，与 组相比 组和 组的机械痛觉和热痛觉过敏缓解，、和 的表达水平下降（）。结论 抑制 信号通路可缓解瑞芬太尼诱发的大鼠术后痛觉过敏。关键词：瑞芬太尼；痛觉过敏；氯胺酮；溴环二磷酸腺苷核糖；兰尼碱受体中图分类号：文献标志码：，；，：（）：，（）（），基础医学与临床 （），（），（）：；瑞芬太尼是一种常用于治疗手术切口疼痛和慢性疼痛的阿片类药物，但研究发现过度使用瑞芬太尼会提高伤害性刺激的敏感性，延长疼痛，造成瑞芬太尼诱发痛觉过敏（，）。兰尼碱受体（，）是位于内质网（，）和肌质网（，）膜上的细胞内释放通道。存在 种哺乳动物同工型，其中 亚型主要分布在心肌细胞，而 和 亚型广泛分布在中枢神经系统。环状二磷酸腺苷核糖（，）是 的内源性激活剂，参与了细胞内钙诱发的钙释放过程（，）。研究发现，疼痛能够激活突触后膜上的 甲基天冬 氨 酸 受 体（，），引起细胞内 浓度增加，继而发生一系列 依赖的级联反应，一方面可以诱导钙 钙调素依赖性蛋白激酶（，）受体发生自身磷酸化，使得 活动增强，进一步刺激 内流，形成正反馈，另一方面通过激活 使得 和 的外流，使伤害性感受信号传入增加。基于此，本实验利用大鼠切口疼痛模型，通过输注瑞芬太尼诱发术后痛觉过敏；同时鞘内给予 抑制剂或 拮抗剂进行干预处理，检测大鼠痛行为学和脊髓背角的相关蛋白表达水平，探究 信号通路在 中的作用。材料与方法 材料 动物：成年健康 级 雄性大鼠，体质量 鼓楼医院实验动物中心，（苏）。药物：瑞芬太尼（，恒瑞医药）、七氟醚和 受体抑制剂氯胺酮（，恒瑞医药）；抗磷酸化 抗体、抗磷酸化 抗体、和二抗（公司）；抗 抗体和抗 抗体（公司）；的拮抗剂溴环二磷酸腺苷核糖（，公司）。瑞芬太尼溶于 氯化钠溶液后，用输液泵以 的剂量持续皮下输注 （）。根据先前的研究和预实验，确定氯胺酮（）和（、和 ）的剂量。方法 大鼠的分组及处理：将大鼠分成 组，每组 只。对照组（）用七氟醚麻醉，皮下输注等体积 氯化钠溶液，未做足底切口；手术组（）根据文献构建术后切口痛模型，同时皮下输注 氯化钠溶液；瑞芬痛敏组（）构建切口痛模型，同时皮下输注瑞芬太尼；氯化钠溶液组（）造模前 鞘内注射 氯化钠溶液，构建瑞芬痛敏模型；氯胺酮组（）造模前 鞘内注射氯胺酮，构建瑞芬痛敏模型；组拮抗剂组（）造模前 鞘内注射，构建瑞芬痛敏模型。在术前和术后第、天检测大鼠痛行为学，术后第 天取大鼠脊髓背角检测相关蛋白表达。机械缩足阈值的测定：机械缩足阈值（，）由动态足底触觉仪（公司）测定。大鼠右足底垂直插钱玥 抑制脊髓 信号通路减弱瑞芬太尼诱发的大鼠术后痛觉过敏入一根金属丝，测量时金属丝向足底施加的压力匀速增加（内压力匀速升至 ），大鼠缩足的同时自动记录到数值。重复 次，每次至少间隔 。热缩足潜伏期的测定：使用自动足底测试仪 评估热刺激伤害，记录热缩足潜伏期（，）。一个可移动的红外线热源准确放置在足底下方，大鼠舔舐后爪或缩爪的同时自动切断电源并记录照射的时间。试验重复 次，每次间隔 。检测、和 的蛋白表达：造模后第 天取大鼠右侧 节段，洗涤后加入细胞裂解液。充分裂解后用 法检测蛋白浓度。经过电泳分离、转膜、封闭、一抗（）、漂洗、二抗孵育后，进行曝光和统计分析。酶循环法检测 表达水平：碾碎组织成粉末后，环境下用高氯酸萃取。上层液体与三正辛胺和，三氯三氟乙烷（）在冰上混合。水相与有机相分离后，收集水相检测 表达水平。统计学分析应用 软件进行分析，计量资料以均值标准差（）表示，。组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用重复测量数据的方差分析，两者均采用 法校正 值。结果 瑞芬太尼引起大鼠痛行为学变化与对照组相比，手术组的 和 在术后第、天表现出明显的下降（）；而瑞芬痛敏组的 和 在术后第、天均呈现显著下降（）。与手术组相比，瑞芬痛敏组在造模后第 天（）和（）的下降更明显，且这种下降趋势持续到术后 （图）。鞘内注射氯胺酮或 改善大鼠痛行为学与瑞芬痛敏组相比，氯胺酮组在术后第 天显著降低瑞芬太尼引起的机械痛觉过敏（）和热痛觉过敏（），且这种改善持续至术后第 天，这与之前的研究结果相似。鞘内注射 拮抗剂 后，组大鼠（）和（）较 组显著提高，且这种改变持续至术后第 天。组和 组的机械痛觉过敏（）和热痛觉过敏（）也表现出相似的结果，表明鞘内注射可以显著改善大鼠的痛觉过敏（图）。氯胺酮和 影响大鼠脊髓背角、和 表达水平手术组大鼠同侧脊髓角、和 的表达水平在造模后第 天显著升高（）。与对照组和手术组相比，瑞芬痛敏 组 大 鼠、和 表达水平显著提高（）。与 组相比，鞘内注射氯胺酮或 后，显著降低了；图 瑞芬太尼诱发痛觉过敏 （，）基础医学与临床 （）；图 氯胺酮或 术前预处理对瑞芬太尼诱发痛觉过敏的影响 （，）因注 射 瑞 芬 太 尼 而 导 致 的 脊 髓 背 角、和 的蛋白过表达水平（）（图），与行为学结果呈现出一致性。讨论瑞芬太尼是一种临床常用的超短效阿片类药物，具有起效快、代谢迅速的优点，已被广泛用于外科手术和重症监护病房治疗。然而，过度使用瑞芬太尼会提高伤害性刺激的敏感性，从而延长疼痛。瑞芬太尼诱发痛觉过敏（）的发生率已被证实远高于其他的阿片类镇痛药物。因此，探索 发生的分子机制成为了目前的关注重点。本研究基于大鼠切口痛手术构建了瑞芬太尼痛觉过敏模型，观察到术中长时间输注瑞芬太尼使得大鼠 和 出现明显下降，产生痛觉过敏，且持续到术后第 天，与之前研究结果一致。目前的研究认为中枢敏化在 的发生发展中发挥重要作用，和 的磷酸化是中枢敏化的关键靶点。是谷氨酸门控阳离子通道蛋白，应激状态下可以被大量内流 通过，从而激活了细胞内的钙依赖性蛋白激酶，使其发生自身磷酸化；激活的 进一步与 的细胞质结构域结合，磷酸化 亚型，产生正反馈调节。这种正反馈最终导致 受体的持续兴奋和细胞质 增加。本研究结果也发现瑞芬太尼输注后大鼠脊髓 和的表达水平升高。疼痛刺激不仅引起细胞外，还引起细胞内的释放。是一类在中枢神经系统神经元细胞内广泛表达的细胞内钙通道，它可以通过被环腺苷二磷酸核糖（，）调节来引发肌浆网 释放。电生理学研究表明，有助于脊髓背角 纤维诱发场电位和背角神经元敏化，。在本研究中，手术组大鼠和痛觉过敏组大钱玥 抑制脊髓 信号通路减弱瑞芬太尼诱发的大鼠术后痛觉过敏；：；图 术后第 天大鼠脊髓内、和 的表达水平 ，（，）鼠术后脊髓背角的、和 的蛋白表达水平显著增高，与痛行为学的改变呈现出一致性，可见 受体参与了疼痛敏化的发生。进一步通过鞘内注射 非竞争性拮抗剂氯胺酮和是 特异性拮抗剂 发现，切口痛大鼠的痛觉过敏得到缓解，脊髓背角内增高的、和 蛋白表达均明显下降，表明 信号通路参与了 这一病理过程。此外，本实验发现抑制 不仅可以逆转 和 的表达水平上调，还可以造成的表达下调。其原因可能在于，一方面抑制 可以通过阻断 通路减少细胞器的 外流，浓度的降低使得 激活减少，无法与 结构阈结合，从而减少了 的磷酸化；另一方面，是瞬时受体电位 型（，）的直接激动剂，通道被 的抑制剂阻断，进基础医学与临床 （）一步减少了胞外 信号内流，导致 和 的磷酸化降低。未来将通过检测和追踪细胞内外的 浓度梯度变化对此现象展开进一步的研究。综上所述，本实验发现 信号通路在瑞芬太尼诱发痛觉过敏中的重要作用，术前鞘内注射氯胺酮或抑制 可以改善瑞芬太尼诱导的大鼠术后痛觉过敏。参考文献：，：，：，：，：，：，：，：，：，（），：，：，：，：，：，：，：