重组酶聚合酶扩增技术用于脑脊液中肺炎链球菌检测的价值.pdf

论著D O I:/j i s s n 重组酶聚合酶扩增技术用于脑脊液中肺炎链球菌检测的价值侯玉婷,俞梦楚,王妍柏,张庆宁夏医科大学总医院:神经内科脑脊液检测室;医学科学研究院;神经内科,宁夏银川 摘要:目的探讨重组酶聚合酶扩增(R P A)技术用于脑脊液(C S F)中肺炎链球菌检测的价值.方法利用R P A技术检测C S F中肺炎链球菌.根据肺炎链球菌L e p A基因设计R P A反应引物,收集临床确诊和疑似的 例细菌性脑膜炎患者为研究对象,采集C S F标本并提取D NA,采用R P A技术对临床C S F进行L e p A基因扩增检测.结果 例患者的C S F标本经微生物培养有 例()为阳性,阳性标本中有例检出肺炎链球菌,这例患者C S F标本的R P A检测结果均为阳性.微生物培养为阴性的 例()患者中有例患者C S F标本的R P A检测结果为阳性.共 例患者C S F标本的R P A检测结果为阳性,从中选取 例患者C S F标本的R P A扩增产物经纯化后,与肺炎链球菌L e p A基因目的片段进行核酸序列比对,其比对结果一致.结论R P A技术可用于肺炎链球菌性脑膜炎病原菌的快速检测.关键词:细菌性脑膜炎;肺炎链球菌;重组酶聚合酶扩增技术;脑脊液中图法分类号:R 文献标志码:A文章编号:()As t u d yo nd e t e c t i o no fS t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e i nc e r e b r o s p i n a l f l u i db yr e c o m b i n a s ep o l y m e r a s ea m p l i f i c a t i o na s s a yHO UY u t i n g,Y U M e n g c h u,WANGY a n b a i,ZHANGQ i n gD e p a r t m e n t o fC e r e b r o s p i n a lF l u i dL a b o r a t o r yo fN e u r o l o g y;I n s t i t u t eo fM e d i c a lS c i e n c e s;D e p a r t m e n t o fN e u r o l o g y,t h eG e n e r a lH o s p i t a l o fN i n g x i aM e d i c a lU n i v e r s i t y,Y i n c h u a n,N i n g x i a ,C h i n aA b s t r a c t:O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h ev a l u eo f r e c o m b i n a s ep o l y m e r a s e a m p l i f i c a t i o n(R P A)a s s a y i nd e t e c t i n go fS t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e i nc e r e b r o s p i n a l f l u i d(C S F)M e t h o d s R P Aw a su s e d t od e t e c tS t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e i nC S F A c c o r d i n gt ot h eL e p Ag e n eo fS t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e,R P Ar e a c t i o np r i m e r sw e r ed e s i g n e d,c a s e so fc l i n i c a l l yc o n f i r m e da n ds u s p e c t e db a c t e r i a lm e n i n g i t i sw e r ec o l l e c t e da sr e s e a r c ho b j e c t s,C S Fs a m p l e sw e r ec o l l e c t e da n dD NAw a se x t r a c t e d,a n dL e p Ag e n ea m p l i f i c a t i o no f c l i n i c a lC S Fw a sd e t e c t e db yR P At e c h n o l o g y R e s u l t s Am o n gt h e p a t i e n t s,()o f t h eC S Fs a m p l e sw e r ep o s i t i v eb ym i c r o b i a l c u l t u r e,a n do f t h ep o s i t i v es a m p l e sw e r ep o s i t i v e f o rS t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e T h eR P At e s tr e s u l t so f t h eC S Fs a m p l e so f t h e s ep a t i e n t sw e r ep o s i t i v e T h eC S Fs a m p l e so f p a t i e n t s()w e r en e g a t i v eb ym i c r o b i a lc u l t u r e,o fw h i c hp a t i e n t sw e r ep o s i t i v ef o rR P A T h er e s u l t so fR P Aa m p l i f i c a t i o nf r o mC S Fs a m p l e so f p a t i e n t sw e r ep o s i t i v e A f t e rp u r i f i c a t i o no fR P Aa m p l i f i c a t i o np r o d u c t sf r o m C S Fs a m p l e so f p a t i e n t s,n u c l e i c a c i ds e q u e n c e sw e r e c o m p a r e dw i t ht h e t a r g e t f r a g m e n t o fL e p Ag e n eo fS t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e,a n dt h er e s u l t sw e r e c o n s i s t e n t C o n c l u s i o n R P Aa s s a yc a nb eu s e d f o r t h e r a p i dd e t e c t i o no fp n e u m o c o c c a lm e n i n g i t i s K e yw o r d s:b a c t e r i a lm e n i n g i t i s;S t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e;r e c o m b i n a s ep o l y m e r a s ea m p l i f i c a t i o na s s a y;c e r e b r o s p i n a l f l u i d细菌性脑膜炎是由细菌直接侵入中枢神经系统(C N S)引起的严重感染性疾病,其发病率和病死率居高不下 .脑脊液(C S F)微生物培养是临床诊断细菌性脑膜炎的常规方法之一,同时也是诊断的金标准,但由于细菌培养时间长,不能满足临床的早期诊断和指导临床合理用药需求.因此,快速、准确地检测C S F中的致病菌是神经科医生关注的重点,也是医学检验需要面临的问题.重组酶聚合酶扩增(R P A)是一种等温基因核酸扩增技术,因其快速、特异、可靠等特点成为新的病原微生物分子诊断方法 .R P A可在恒温条件下,m i n内进行D NA检测,反应效率高.前期的研究发现,本院收治的肺炎链球菌性脑膜炎患者较多,因此本研究以肺炎链球菌为目的菌株.L e p A蛋白是核糖体延伸因子,在原核生物中具检验医学与临床 年月第 卷第 期L a bM e dC l i n,A u g u s t ,V o l ,N o 基金项目:宁夏自然科学基金项目(AA C );宁夏医科大学优势学科群建设项目(X Y ).作者简介:侯玉婷,女,主管技师,主要从事脑脊液细胞形态学和分子检测研究.通信作者,E m a i l:n x z h a n g q i n g a l i y u n c o m.网络首发h t t p:/k n s c n k i n e t/k c m s/d e t a i l/R h t m l()有高度的序列保守性.本研究以L e p A基因作为鉴定肺炎链球菌的分子诊断靶点,利用R P A技术检测C S F中肺炎链球菌,以C S F微生物培养的结果作为标准,探讨R P A技术的应用价值.资料与方法 一般资料收集 年月至 年月本院收治的确诊及疑似细菌性脑膜炎患者 例为研究对象,其中男 例,女 例;年龄 岁.仪器与试剂P C R仪(A n a l y t i k j e n a德国)、B i o R a d电泳仪(B i o R a d美国)、凝胶电泳仪(A z u r e美国)、C y t o s p i n 型细胞玻片离心仪(T h e r m oS c i e n t i f i c美国).瑞氏姬姆萨染色液(珠海贝索生物技术有限公司)、T o p R e d核酸染料(北京博奥拓达科技有限公司)、D N A提取试剂盒(Q I A a m pD N A m i n iK i t德国)、D N A纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司)、R P A反应试剂盒(T w i s t Am pTMB a s i cK i t英国).方法 引物设计与合成根据G e n B a n k肺炎链球菌L e p A基因(G e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e rN C_ )的核酸序列及参考文献 设计R P A引物,正向引物:A C A G C T C C G T C T G T T A T T T A C A A A G T T A A T T T G AC;反 向 引 物:A G T C C C C A C G C T T A C G C T G A G C TA G C T C C A T T A C T.扩增片段长度均为 b p,引物由上海生工生物工程有限公司合成.C S F微生物培养 例患 者均进行 常规C S F微生物培养,按照临床检验操作规程对C S F标本进行微生物分离鉴定.C S F细胞学检查和D NA提取进行腰椎穿刺取C S F,采用血细胞计数板进行C S F中白细胞计数.吸取 m LC S F置于标本室内,放置在细胞玻片离心仪内以 g离心m i n制成C S F涂片.待涂片自然干燥后,滴加瑞氏姬姆萨染色液,然后加入缓冲液并吹均匀,静置m i n后流水冲洗.干燥后采用C S F细胞图像诊断分析系统进行分类,计数 个细胞,计算单个核细胞(淋巴细胞、单核细胞)和多个核细胞(中性粒细胞)百分比.剩余的C S F在室温下 r/m i n离心 m i n,弃去上清液;按照试剂盒中说明书的操作方法提取C S F的D NA,检测核酸浓度及纯度后置于 保存备用.C S FR P A检测将C S F标本的D NA按照T w i s t Am pTMB a s i cK i t试剂盒的说明书进行R P A检测.反应体系如下:m o l/L的上、下游引物各 L,重组缓冲液 L,D NA模板L,d d HO L,涡旋混匀后简短离心.将上述 L的混合液移入预装有冻干粉的反应管中并充分混匀,再加入 mm o l/L的醋酸镁溶液 L,混匀后置于 恒温仪中反应m i n.将反应管从恒温仪中取出,上下翻转混匀 次,简短离心后再次置于 恒温仪中反应 m i n.R P A产物的结果判断按照D NA纯化回收试剂盒的说明书将R P A反应产物进行纯化,测定核酸浓度及纯度后,通过 琼脂糖凝胶电泳进行检测.R P A产物的验证根据琼脂糖凝胶电泳检测的结果,选取部分阳性扩增产物送往上海生工生物工程有限公司进行测序,通过生物软件V e c t o r NT I分析临床标本R P A产物的核酸序列与目标核酸序列的一致程度,验证扩增产物是否为目的条带.统计学处理采用E x c e l 软件进行数据分析.结果 C S F微生物培养结果C S F经微生物培养有 例()为阳性.其中肺炎链球菌为例;鲍曼不动杆菌例;肺炎克雷伯菌例;脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增生李斯特菌、缓症链球菌和黏质沙雷菌分别为例.C S F微生物培养阴性者为 例().C S FR P A检测的结果 例研究对象中,R P A阳性为 例(),阴性为 例().C S F标本的R P A产物电泳图见图,阳性标本能扩增出清晰的R P A条带,且条带大小符合预期长度(b p).注:M为D NA分子质量标准;为C S F标本(患者编号为、和号).图C S F标本R P A阳性扩增产物电泳图 R P A与微生物培养结果比较微生物培养为阳性的 例()患者中,有例检出肺炎链球菌,这例的R P A检测结果均为阳性.微生物培养为阴性的 例()患者中,也有例的R P A检测结果为阳性.这例患者药物治疗史和C S F细胞学检查结果见表.有 例患者C S F标本的培养结果为非肺炎链球菌,其R P A反应均为阴性.R P A产物的测序结 果C S F微生物培养 和R P A检测结果均为肺炎链球菌的例患者,随机选取例(标本编号、)R P A产物进行测序.C S F微生物培养为阴性,R P A反应为阳性的例患者的产物全部进行测序.共 份R P A的核酸产物与L e p A基因的 b p目标序列进行序列比对,结果见图.图中黄色代表相同的序列;蓝色代表相似的序列.测序时由于荧光染料的干扰,测序结果在引物 端后面的 个碱基不一定能准确判读.在第 个碱基位置(箭头所示)以后R P A产物的核酸序列与目标序列一致,R P A扩增成功并获得目的基因片段.检验医学与临床 年月第 卷第 期L a bM e dC l i n,A u g u s t ,V o l ,N o 表培养为阴性、R P A检测为阳性患者的药物治疗史和细胞学检查结果编号性别年龄(岁)腰椎穿刺前是否接受药物治疗药物名称细胞学检查结果白细胞计数(/L)淋巴细胞百分比()单核细胞百分比()中性粒细胞百分比()男 是 女是头孢哌酮/他唑巴坦 男 是青霉素、头孢曲松、更昔洛韦 男 男 男 女 是 注:为不清楚.注:图中黄色代表相同的序列;蓝色代表相似的序列;箭头为第 个碱基位置.图P R A产物与目的序列的核酸比对结果讨论细菌性脑膜炎的病情进展快,严重威胁人们的生命健康,需要早期诊断并及时给予有效的治疗.因此快速、准确的病原菌检测是临床确诊细菌性脑膜炎的关键.在微生物分子检测方法中,P C R技术为病原菌的诊断提供了依据,已应用于C N S感染性疾病的诊断中 .基因芯片技术在细菌性脑膜炎的诊断中也可见报道,.但这两种方法都需要特定的仪器、设备和专业的人员,检测成本较高,在快速检测方面有不足之处.近年来,R P A技术以其快速、灵敏度高、特异性强的特点受到人们的关注,已应用于细菌、病毒和寄生虫等检测研究中 .R P A技术在恒温条件下(),m i n即可实现核酸指数扩增,这种常温扩增的优点使得该技术不需要精密的仪器,为床旁诊断提供了可能,满足了临床快速诊断的需求.L e p A蛋白也被称为E F,是与蛋白质翻译密切相关的延伸因子,也是一个高度保守的蛋白,其编码基因L e p A在原核生物中具有高度的序列保守性.有报道采用L e p A基因对血液中肺炎链球菌进行了核酸扩增检测,研究发现肺炎链球菌的株参考菌株检验医学与临床 年月第 卷第 期L a bM e dC l i n,A u g u s t ,V o l ,N o 和 株临床分离株的检测结果均为阳性,其余 株非肺炎链球菌菌株的检测结果均为阴性,该研究表明L e p A基因作为肺炎链球菌的检测靶点具有较好的特异度和灵敏度.基于上述研究结果,本研究以L e p A基因为分子诊断靶点,利用R P A技术检测临床C S F标本中的肺炎链球菌,以C S F微生物培养的结果作为标准,探讨R P A技术的应用价值.研究表 明R P A技术 检测时间短,恒定 、m i n即可完成核酸的扩增,加上C S FD NA的提取和核酸产物凝胶电泳的时间,可以在d内得到检测结果.在本研究中,R P A检出肺炎链球菌的阳性率为 (/),微生物培养技术检出肺炎链球菌的阳性率为 (/).微生物培养结果为肺炎链球菌的份C S F标本,其R P A检测结果为阳性,两种检测方法结果一致.另外有份C S F标本,其微生物培养结果为阴性,但是R P A检测结果为阳性.这例患者在本院就诊前,均有当地医院就诊史,根据患者的资料信息,笔者认为这例患者是因为使用抗菌药物而降低了微生物培养的敏感性,患者C S F的中性粒细胞百分比为 以上且中性粒细胞吞噬细菌的能力强,所以微生物培养结果为阴性,但是C S F中存在肺炎链球菌的核酸物质,因此R P A结果为阳性.需要注意的是,本研究中的R P A引物是检测肺炎链球菌的特异性引物,所以微生物培养结果为非肺炎链球菌的标本R P A检测结果为阴性.为进一步确认R P A产物序列的正确性,将 份R P A阳性产物纯化后与L e p A基因目标序列进行核酸序列比对.从图可知,号标本有个位点的碱基与目的片段的碱基不一致,考虑 号标本中的肺炎链球菌在这个位点发生了单个核苷酸的变异,其余份R P A阳性产物的核酸序列与目标序列一致.该结果表明R P A成功扩增出目的基因片段.R P A技术可快速、准确地检测出C S F中的肺炎链球菌,有助于临床对肺炎链球菌性脑膜炎的早期诊断和治疗,也为细菌性脑膜炎其他病原菌的快速检测提供借鉴.C S F病原菌的检测方法,如微生物培养技术、革兰涂片染色、免疫学及生化指标检测等方法都各有优势.R P A技术应该与这些检测方法相互结合,相互补充,使得病原菌的检测不断向着简单快速、准确度高、床旁适用的方向发展.参考文献VAND EB E E KD,B R OUWE R MC,KO E D E LU,e ta l C o mm u n i t y a c q u i r e db a c t e r i a lm e n i n g i t i sJ L a n c e t,():K I M KS I n v e s t i g a t i n gb a c t e r i a lp e n e t r a t i o no ft h eb l o o d b r a i nb a r r i e r f o r t h ep a t h o g e n e s i s,p r e v e n t i o n,a n dt h e r a p yo fb a c t e r i a lm e n i n g i t i sJ A C SI n f e c tD i s,():L IJ,MA C D ONA L DJ,VON S T E T T E N F R e v i e w:ac o m p r e h e n s i v es u mm a r yo fad e c a d ed e v e l o p m e n to ft h er e c o m b i n a s ep o l y m e r a s ea m p l i f i c a t i o nJ A n a l y s t,():廖川,韦贵将重组酶聚合酶扩增技术的研究进展与应用J检验医学与临床,():马巧妮,王萌,朱兴全重组酶介导扩增技术及其在病原微生物快速检测中的应用进展J中国生物工程杂志,():HOUY,Z HAN GX,HOUX,e t a l R a p i dp a t h o g e n i d e n t i f i c a t i o nu s i n gan o v e lm i c r o a r r a y b a s e da s s a yw i t hp u r u l e n tm e n i n g i t i s i nc e r e b r o s p i n a l f l u i dJ S c iR e p,():Q I N Y,P O L A C E K N,V E S P E R O,e ta l T h eh i g h l yc o n s e r v e dL e p Ai s a r i b o s o m a l e l o n g a t i o n f a c t o r t h a t b a c k t r a n s l o c a t e s t h e r i b o s o m eJ C e l l,():C L AN C YE,H I G G I N SO,F OR R E S T M S,e ta l D e v e l o p m e n to far a p i dr e c o m b i n a s ep o l y m e r a s ea m p l i f i c a t i o na s s a yf o rt h ed e t e c t i o no fS t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a ei nw h o l eb l o o dJ BMCI n f e c tD i s,:中华医学会神经病学分会感染性疾病与脑脊液细胞学学组脑脊液细胞学临床规范应用专家共识J中华神经科杂志,():袁丽娜引发中枢神经系统感染性疾病常见病原体多重荧光定量P C R检测方法的建立及应用D昆明:昆明理工大学,吴婷娜,王旻晋,钟方财,等疑似中枢神经系统感染患者脑脊液病原体多重P C R检测结果的研究J国际检验医学杂志,():Z HAOC,WANGX,Z HANGC,e ta l D e v e l o p m e n to faT a q M a nA r r a yc a r dt ot a r g e t p u r u l e n tm e n i n g i t i s r e l a t e dp a t h o g e n sJ BMCI n f e c tD i s,():B A N N I S T E RSA,K I D DSP,K I R B YE,e t a l D e v e l o p m e n ta n da s s e s s m e n t o f a d i a g n o s t i c d n a o l i g o n u c l e o t i d em i c r o a r r a yf o rd e t e c t i o na n dt y p i n go f m e n i n g i t i s a s s o c i a t e db a c t e r i a ls p e c i e sJ H i g hT h r o u g h p u 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