长爪沙鼠及其寄生虫感染模型组学研究进展.pdf
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1、动物医学进展,():P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e长爪沙鼠及其寄生虫感染模型组学研究进展收稿日期:基金项目:中国博士后科学基金(M)作者简介:叶瑞(),男(土家族),湖北利川人,硕士研究生,主要从事寄生虫感染与免疫相关研究.通讯作者叶瑞,王莉君,李先春,谢治梅,刘晖,杜恩岐,郑明辉,(遵义医科大学,贵州遵义 ;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 ;中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所,上海 )摘要:长爪沙鼠具有独特的生理学、解剖学和行为学特性,近年来已在医学和生物学等领域得到广泛研究和应用.作为一种多功能实验动物,
2、长爪沙鼠可用于建立多种良好的寄生虫感染模型.随着基因组序列的公布,长爪沙鼠及其寄生虫感染模型的组学研究已经取得了明显进步.基于长爪沙鼠及寄生虫感染模型组学的研究资料,从基因组、线粒体基因组、转录组、蛋白质组等角度对其功能基因、免疫响应及差异表达进行综述,以期为该物种在分子水平上的深入研究和寄生虫疾病的防控提供参考.关键词:长爪沙鼠;寄生虫感染;基因组;线粒体基因组;转录组;蛋白质组中图分类号:S 文献标识码:A文章编号:()长爪沙鼠(M e r i o n e su n g u i c u l a t u s)亦称蒙古沙鼠(M o n g o l i a ng e r b i l),属哺乳纲、
3、啮齿目(R o d e n t i a)、鼠科(M u r i d a e)、沙鼠亚科(G e r b i l l i n a e)、沙鼠属(M e r i o n e s).由于其具有独特的生理学、解剖学及行为学特性,在肿瘤、神经性和传染性疾病等方面的研究发挥了重要作用 ,是一种有着广阔应用前景的多功能啮齿类实验动物.随着长爪沙鼠作为动物模型研究的不断深入,发现其作为寄生虫感染的动物模型,具有其他啮齿类动物不具备的一些优势和特点,有助于进一步开展寄生虫病防治研究.从地理分布、生活史、分类学、分子遗传学、生态学等方面对长爪沙鼠进行了较为系统的评述,但组学方面的研究还很少 .近年来随着长爪沙鼠基
4、因组测序的完成及高通量测序技术的发展,长爪沙鼠的研究进入后基因组时代.通过基因组、线粒体基因组、转录组、蛋白质组等组学从多角度对长爪沙鼠及其寄生虫感染模型开展深入研究,为破解长爪沙鼠及其他近缘啮齿类动物遗传分析、系统进化和分子水平等方面的应用起到了重要作用,同时也为寄生虫疾病致病机理的研究和抗虫药物靶点的筛选提供了新方向.论文就近年来长爪沙鼠及其寄生虫感染模型的组学水平研究现状进行综述,对进一步推动长爪沙鼠的深入研究提供帮助.组学在长爪沙鼠中的应用基因组近年基因组学在长爪沙鼠中的研究已取得了初步进展,有研究测定了长爪沙鼠的整个基因组序列(G e n B a n k登录号:NHT I )并完成了
5、数据的初步注释,基于I l l u m i n a测序平台,对源于美国查尔斯河的长爪沙鼠腿部肌肉组织样本进行测序,平均测序深度为 x,数据拼接得到 条s c a f f o l d,N 长度为 k b,共获得大小为 M b的总基因组,含有 个蛋白编码基因.该学者将沙鼠和小鼠的基因组序列进行直接比较和分析,结果发现了个与控制神经信号传导高度相关的基因,并证明这些基因在小鼠和长爪沙鼠中具有高度同源性,为进一步了解哺乳动物的进化、行为和神经功能提供了参考.也有人基于I l l u m i n a平台完成了对同一地域长爪沙鼠的基因组测序,其基因组大小约为 M b,含有 个蛋白编码基因,由 条s c a
6、 f f o l d组 成,N 长 度 为 k b.基因组注释显 示重复序列 长度为 M b,占整个基因组序列的,与小鼠和大鼠的基因组相同.随着长爪沙鼠基因组测序的完成,构建了基于C R I S P R/C a s 系统的长爪沙鼠基因组编辑平台,为沙鼠生物学特性研究提供了工具,有利于进行啮齿动物比较生物学研究.基于长爪沙鼠全基因组数据,根据微卫星序列特征的标准筛选出 个高度多态性的微卫星位点,其结果对长爪沙鼠群体遗传多样性研究提供了参考.线粒体基因组除了细胞质中的遗传物质,线粒体中也包含遗传物质.与核基因组相比,线粒体基因组具有结构简单、极少重组、母系遗传等特点,广泛应用于系统发育与进化、分类
7、等研究领域.已有两个地域的长爪沙鼠完成了线粒体基因组的测序 ,两者均起源自我国内蒙古及其邻近区域.对源自美国查尔斯河长爪沙鼠全线粒体基因组(G e n B a n k登录号:K C )进行了测序,其基因组全长为 b p,含 有 个基 因,包括 个蛋白质编 码 基 因(P C G s),个转运R NA(t R NA),个核糖体R NA(r R NA)基因,线粒体基因组总G C含量为 ,与其他啮齿动物相似.随后国内学者也完成了长爪沙鼠线粒体基因组(G e n B a n k登录号:K F 和N C )测序,其线粒体基因组结构和碱基组成与文献 的结果基本一致.线粒体编码基因在物种鉴定及系统进化研究中
8、有着广泛的应用,针对长爪沙鼠线粒体D NA控制区全序列进行测定及进化分析,碱基组成分析显示其AT含量大于GC含量,与啮齿类动物在碱基组成上较为接近,具有明显的种属特异性.进化分析表明其与家鼠()、黑家鼠()和仓鼠()具有较近的遗传距离.随后又对长爪沙鼠线粒体AT P a s e、AT P a s e、C O X 基因全序列进行测定及进化分析,结果与之前均一致.不同学者对长爪沙鼠的分类研究存在着不同的意见,基于传统分类学方法主要将其归类为仓鼠科(C r i c e t i d a e).长爪沙鼠完整线粒体基因组的测定使长爪沙鼠的分类学研究有了新的依据,通过对沙鼠线粒体蛋白质编码基因进行系统发育分
9、析,表明长爪沙鼠在内的沙鼠亚科应归入鼠科.转录组相比基因组的研究,长爪沙鼠转录组学研究起步较晚.目前转录组测序技术已经得到广泛的应用,在完成沙鼠基因组测序后用转录组测序技术(R NA s e q)对长爪沙鼠的 个组织样本进行测序,并完成了转录本的组装和注释(G e n B a n k登录号:GHNW ).转录组测序产生了 个序列,总长度为 M b,R NA s e q组装产生了 个蛋白质编码基因,蛋白质编码基因全长为 M b.长爪沙鼠基因组和转录组测序的完成为其分子操作在各个领域的应用奠定了基础,并有助于其疾病乃至寄生虫感染模型的研究.年,遵义医科大学寄生虫学教研室用实验室保留长爪沙鼠样本,其
10、源自于内蒙古,随后从中选取了 个 不 同 组 织 的 混 合 样 本,基 于I l l u m i n aH i S e q 高通量技术平台构建了长爪沙鼠转录组测序文库,经过质控评估该文库质量较高,过滤除去接头和低质量序列后获得 条C l e a nr e a d s,r e a d s平均读长约为 b p,将C l e a n r e a d s比对到参考基因上,结果获得 个基因.基于转录组数 据进行单核 苷 酸 多 态 性(s i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s,S N P)的 挖 掘 及 可 变 剪 切 鉴 定.S
11、 N P分析共挖掘出 个S N P,其中转换 个,颠换 个,转换发生比列为 ,是最主要的突变类型.本研究共鉴定出 次可变剪切,其中以外显子跳跃的可变剪切方式数量最多,共有 个.通过B l a s t比对获得基因注释和功能分类信息,从中挖掘出与免疫响应通路相关的重要基因 个.目前本课题组正在对其构建的旋毛虫感染模型中几个重要病程阶段的差异转录组进行分析,期望挖掘与疾病相关的的免疫通路相关基因、分子标记和可变剪切位点,能为长爪沙鼠感染寄生虫后的免疫分析提供相关数据,对寄生虫病的防治具有重要意义.蛋白质组蛋白质组旨在研究生命体执行基因组所表达的全部蛋白质的生理功能.随着长爪沙鼠基因组测序的完成,蛋白
12、质组学在长爪沙鼠的研究中得到了初步应用,改变了以往只研究一种或几种蛋白质的局限,提高了蛋白质整体的研究水平.有人研究了几种类胡萝卜素对长爪沙鼠蛋白质组反应的影响,用双向荧光差异凝胶电泳技术和液相色谱串联质谱技术对长爪沙鼠的肝脏、脂肪组织以及血浆进行了蛋白质组学分析,结果显示,各种蛋白质的丰度变化均显著,特别是在结构、蛋白质代谢和免疫系统功能方面,而与抗氧化作用相关的蛋白质一般较少.通过生物信息学方法结合蛋白组学数据分析人和啮齿动物中约 个同源的蛋白质,在长爪沙鼠中鉴定出 个异常表达的蛋白质,发现超过一半的异常表达蛋白与G C偏向的核苷酸改变有关,并且许多蛋白 位于高G C区 域,其 中 以P
13、D X,I N S R,ME D AG和S P P 为代表的部分蛋白质可能与长爪沙鼠的饮食代谢和生理表型有关.蛋白质组学能够在基因组及转录组的水平上进一步通过蛋白质的翻译对长爪沙鼠功能基因进行大规模解析,阐明其功能水平上的差异蛋白及其机理,补充了组学测序数据与中心法则中的不匹配现象,为利用联合组学筛选重要的功能基因提供参考.但目前长爪沙鼠蛋白质组学相关研究还较少,未来若能有更多不同组织或者不同动物医学进展 年第 卷第期(总第 期)生理状态下差异蛋白,尤其涉及其免疫通路以及重要物质代谢通路等方面的深入研究,这些数据将有助于进一步阐释长爪沙鼠的特定生物学功能.组学在长爪沙鼠寄生虫感染模型中的应用由
14、于长爪沙鼠对多种寄生虫均易感,成为研究马来丝虫(B r u g i am a l a y i)、彭亨布鲁丝虫(B r u g i ap a h a n g i)、并殖吸虫(P a r a g o n i m u s)、利什曼原虫(L e i s h m a n i a)等寄生虫宿主互作研究的理想动物模型.长爪沙鼠还是部分寄生虫研究的最优啮齿类动物模型,如马来丝虫,该感染模型可表现出与人类更为相似的丝虫病病理学特征和临床症状,优于其他动物模型.因此,长爪沙鼠寄生虫感染模型的成功建立在寄生虫的病理学特性、发病机制、免疫学诊断及药物研发等诸多领域发挥作用.线粒体基因组通过研究寄生虫的线粒体基因组,可
15、以通过系统发育分析揭示其种属来源,亦鉴定出其线粒体分子标记,发掘潜在的药物靶点.在长爪沙鼠丝虫模型中提取彭亨布鲁丝虫基因组D NA,用于测序并构建基因组文库,随后将获得的彭亨布鲁丝虫序列同马来丝虫的序列进行基因同源聚类和系统发育分析,发现彭亨布鲁丝虫和马来丝虫的基因组虽然高度相似,但仍具有 个特有的基因,这些特有基因可能成为研究不同种寄生虫毒力、载体选择和寄主适应性差异的新焦点.从实验室中成功感染并殖吸虫的长爪沙鼠肺内采集成虫,从中提取基因组D NA,通过P C R方法扩增线粒体中个编码基因,内转录间隔二区(I T S)和细胞色素氧化酶亚基(C O X)基因并进行序列分析,结果表明采集的并殖吸
16、虫为巨睾狸殖吸虫(P a r a g o n i m u sm a c r o r c h i s),并且其与亚洲范围内的其他并殖吸虫物种形成一个独立的类群.通过采集我国不同地理来源的野生动物包括长爪沙鼠,鉴定后发现其感染了利什曼原虫,并进一步通过线粒体基因中的热休克蛋白(H S P )基因和细胞色素B(C y t b)基因对利什曼原虫分离株进行了序列测定和系统发育分析,序列分析成功鉴定了中国利什曼原虫所属的虫种,随后的系统发育分析揭示了杜氏利什曼原虫(L e i s h m a n i ad o n o v a n i,L D)复合体的亚种划分.长爪沙鼠感染模型对于寄生虫的鉴定和及其地理株系
17、的区分有着重要作用,在我国重要寄生虫病的流行病学调查及防控中提供了重要参考.转录组转录组学的广泛应用同样体现在长爪沙鼠寄生虫病模型中,如长爪沙鼠丝虫病模型,用R NA s e q技术分析不同生命阶段的马来丝虫转录组,揭示R NA表达从卵、幼虫到成虫阶段的主要转变,分析发现丝虫角质层胶原蛋白家族中和那些与蜕皮有关的蛋白表现出明显的动态时序性,基于该数据将对识别新的转录元件和剪接变异体,辅助基因组测序中染色体结构组装的研究提供了参考.对寄生于长爪沙鼠腹腔的马来丝虫进行R NA S e q测序,发现与染色质重塑相关基因的过度表达,其中包括个含溴结构域和额外终端域蛋白质家族成员,发现一种溴结构域和外源
18、蛋白抑制剂J Q()在体外对成虫 有 致 死 性,提 示 它 可 用 于 治 疗 淋 巴 丝 虫病.通过长爪沙鼠马来丝虫感染模型的R NA S e q测序研究成虫在体外不同时间点的基因表达变化,筛选出 个差异表达基因,其中编码角质层胶原的基因显著表达.目前丝虫病的治疗依赖传统抗虫药物乙胺嗪和依维菌素,为了解抗丝虫病药物在体内的作用,国外学者通过长爪沙鼠丝虫病模型,结合抗虫药物灌胃治疗.通过R NA S e q技术对药物治疗后第天和第天时长爪沙鼠感染的丝虫成虫及微丝蚴进行研究,共鉴定了约 个差异表达基因.这些结论将对淋巴系统寄生的丝虫病的机理的深入研究及针对丝虫的特异药物靶点的开发进一步提供参考
19、.蛋白质组蛋白质组学在长爪沙鼠寄生虫感染模型中的应用较少,主要是挖掘与疾病进程相关的差异表达蛋白以及信号转导途径.通过同位素标记相对和绝对定量技术检测了长爪沙鼠在弓形虫(T o x o p l a s m ag o n d i i)感染过程中沙鼠脑内差异调节蛋白和富集的特异性信号转导途径,结果表明,获得的 个蛋白质中,个蛋白质存在差异表达,免疫反应、新陈代谢和神经通路显著下调,该研究结果加深了弓形虫感染引起的中枢神经系统损伤机制的理解,为开发弓形虫脑炎的新疗法提供了新的思路.多种寄生虫感染会引起宿主体内代谢异常,经口饲喂长爪沙鼠旋毛虫(T r i c h i n e l l as p i r
20、a l i s)肌幼虫以建立感染模型,通过液相色谱串联质谱技术鉴定肌幼虫蛋白质,揭示了 种已鉴定的蛋白质的功能,这些蛋白质与催化、结合和结构活性有关,大多数蛋白质参与细胞和代谢过程,这些过程在旋毛虫对宿主组织的入侵和肌幼虫的蜕皮中发挥着重要作用,该结果为进一步阐释旋毛虫在宿主体内致病的过程中提供了重要分子基础.经长爪沙鼠皮下感染马来丝虫,用液相色谱串联质谱技术对取自沙鼠腹腔内的成虫及其寄生过程产生的排泄分泌物进叶瑞等:长爪沙鼠及其寄生虫感染模型组学研究进展行蛋白质组学分析,鉴定出 个蛋白质,其中包括具有免疫调节特性的蛋白质,如蛋白酶抑制剂、细胞因子同源物和碳水化合物结合蛋白,为宿主寄生虫相互作
21、用的机理提供了有价值的参考.蛋白质组学技术在长爪沙鼠寄生虫感染模型中的应用虽然目前起步较晚,但目前开展的研究为后续机制研究中一些重要蛋白质功能的解析提供了重要的数据,对寄生虫病致病机理、重要寄生虫防治药物的筛选和研发产生重要意义.联合组学应用组学技术在长爪沙鼠的研究中已经取得了飞速发展,但单一的组学只能反映生物信息的某一层面,对于揭示其特定状态或者某一过程中基因、转录本和蛋白质的内在机理及更深层次的联系尚不明确.联合组学分析显得更为全面,但存在成本、技术难度等问题,目前在长爪沙鼠及其寄生虫感染模型中的应用还为起步阶段,主要通过基因组、转录组,蛋白质组的联合来进行研究.对长爪沙鼠进行基因组和转录
22、组联合分析,发现长爪沙鼠是一种能够替代大鼠与小鼠的啮齿动物模型,为特定的疾病状态建立了更好的模型,其所获得的数据可为长爪沙鼠的分子操作提供新的方向.通过转录组和蛋白质组的联合分析丝虫在没有沃尔巴克氏菌(W o l b a c h i a)共存条件下存活的分子机制,其中马来丝虫成虫取自于试验感染的长爪沙鼠体内,结果从转录组中鉴定出与 个与沃尔巴克氏菌基因相似的序列,蛋白质组学分析发现到个肽能比对到沃尔巴克氏菌的两个A B C转运相关蛋白,证明类沃尔巴克氏菌序列存在于丝虫基因组中,以组织特异性和阶段特异性在R NA和蛋白质水平上表达.多组学在长爪沙鼠及其寄生虫模型中有着广阔应用前景,但高昂的检测费
23、用和繁琐的检测步骤制约着组学技术的应用.展望长爪沙鼠基因组数据的公布极大地促进了其组学相关研究,除了提供长爪沙鼠的序列、基因表达信息外,为研究其寄生虫感染模型、基因编辑和遗传学等方面提供了支撑.近年已完成了长爪沙鼠及其感染模型中寄生虫的线粒体基因组测序,积累了大量组学数据信息,为长爪沙鼠的进化、系统发育和亲缘关系研究奠定了基础,促进了寄生虫线粒体分子标记的鉴定和抗虫药物靶点的发掘.在转录层面,基于长爪沙鼠寄生虫感染模型,对寄生虫在其不同组织器官、发育阶段的基因表达量进行比较和分析,有助于深入了解差异表达基因在致病机制中所起的作用.蛋白质组学进一步揭示了基因在表达和转录后的功能及调控作用,有助于
24、筛选出长爪沙鼠寄生虫模型中关键的差异表达蛋白质,为寄生虫病的防治奠定基础.通过基因组学、转录组学、蛋白组学等单个或多个组学技术探讨长爪沙鼠寄生虫病模型中期免疫功能变化的机制及其他生理过程如代谢、应激和繁殖等功能,阐明不同基因的内在联系和整体功能,揭示长爪沙鼠的遗传分析、系统进化和分子水平,为寄生虫感染模型的相关研究提供技术支撑.参考文献:田双杰,张学英,刘伟,等长爪沙鼠的贮食行为与其个性和代谢水平之间的关系J兽类学报,():XULD,Z HAN GF,C HE NC,e ta l R e v i s i t i n gt h eM o n g o l i a ng e r b i lm o d
25、 e l f o rh e p a t i t i sEv i r u sb y r e v e r s eg e n e t i c sJ M i c r o b i o lS p e c t r,():e KWONK M,L E EMJ,C HUN GHS,e t a l T h eo r g a n i z a t i o no fs o m a t o s t a t i n i mm u n o r e a c t i v ec e l l si nt h ev i s u a lc o r t e xo ft h eg e r b i lJB i o m e d i c i n e
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