雪莲培养物对酒精性肝损伤及酒精代谢的影响研究_曹坦.pdf

酿酒科技2023年第3期（总第345期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.3(Tol.345)DOI：10.13746/j.njkj.2022142作者简介：曹坦，男，硕士，研究方向：食品生物技术，E-mail：caotanpractical-。通讯作者：李胜男，女，硕士，研究方向：中药与分子生药学，E-mail：。雪莲培养物对酒精性肝损伤及酒精代谢的影响研究曹坦，李胜男，龙则河（大连普瑞康生物技术有限公司，辽宁 大连 116001）摘要：为探究雪莲培养物对酒精性肝损伤及酒精代谢情况的作用，本研究建立了急性酒精肝损伤的小鼠模型，对小鼠进行不同条件干预，分析雪莲培养物对急性酒精肝损伤小鼠的肝功能影响；对小鼠进行雪莲酒和基酒灌胃，分析小鼠体内酒精代谢情况及相关指标变化。研究结果表明，与模型组小鼠相比，雪莲培养物组小鼠肝脏中丙二醛（MDA）及甘油三酯（TG）含量降低，还原型谷胱甘肽（GSH）含量提高，雪莲培养物组小鼠肝脏变性程度降低；小鼠经不同酒剂灌胃后，雪莲酒组小鼠血液中乙醇含量降低；雪莲酒和基酒分别灌胃两个月后，与空白对照组比较，基酒组MDA、TG含量明显升高；基酒组和雪莲酒组的GSH含量均不同程度降低，其中雪莲酒组GSH含量降低程度较小。研究结果表明，雪莲培养物对小鼠急性酒精肝损伤具有一定的保护作用；与基酒比较，雪莲酒促进了小鼠血液的酒精代谢速度，对肝脏损伤程度较小。关键词：雪莲培养物；雪莲酒；肝损伤；酒精代谢中图分类号：TS262.8；R446.1文献标识码：A文章编号：1001-9286（2023）03-0042-05Effect of Tissue Culture of Saussurea involucrata on Alcohol-InducedLiver Injury and Alcohol MetabolismCAO Tan,LI Shengnan and LONG Zehe(Dalian Practical Biotechnology Co.Ltd.,Dalian,Liaoning 116001,China)Abstract:The purpose of this study is to investigate the effect of tissue culture of Saussurea involucrata on alcohol-induced liver inju-ry and alcohol metabolism.A mouse model of acute alcohol-induced liver injury was established,and the mice were treated by differ-ent conditions to analyze the effect of tissue culture of Saussurea involucrata on the liver function of mice with acute alcohol-inducedliver injury.The mice were gavaged with Saussurea involucrata wine and base wine,and the alcohol metabolism in mice and thechanges of related indicators were analyzed.The results showed that compared with the mice of the model group,the content of malo-ndialdehyde(MDA)and triglyceride(TG)in the liver of the mice of the tissue culture group decreased,and the content of reducedglutathione(GSH)increased;the degree of liver degeneration in the mice of the tissue culture group decreased.After the mice weregavaged with different wines,the ethanol content in the blood of the mice of the Saussurea involucrata wine group decreased.Aftertwo-month gavage,the content of MDA and TG in the mice of the base wine group increased significantly;the GSH content in themice of the base wine group and the Saussurea involucrata wine group decreased to varying degrees,and the GSH content in themice of the Saussurea involucrata wine group decreased less.The results showed that the tissue culture of Saussurea involucrata hadcertain protective effect on acute alcohol-induced liver injury in mice.Compared with the base wine,Saussurea involucrata wine pro-moted the rate of alcohol metabolism in the blood of mice,and had less damage to the liver.Key words:tissue culture of Saussurea involucrata;Saussurea involucrata wine;liver injury;alcohol metabolism4242菊科植物天山雪莲Saussurea involucrata(Kar.et Kir.)Sch.-Bip.为药食同源植物，药用记载始于藏医药著作 月王药珍，具有温肾助阳，祛风去湿，痛经活血等功效，系维吾尔族习用药材1。在新疆等地区，雪莲泡酒食用十分常见。天山雪莲生长分布范围稀缺，生长环境特异，存在过度采挖、栽培困难等问题，野生资源濒临灭绝。1996年天山雪莲被列为国家二级濒危植物；2000年国务院13号文件明令禁止采挖野生雪莲。通过植物细胞培养技术获取天山雪莲细胞，解决了野生天山雪莲资源紧缺的问题。2010年，原卫生部批准雪莲培养物为新资源食品。雪莲培养物具有苯丙素类、黄酮类、木脂素类和甾体类等化学成分2，具有抗炎3、抗缺氧4、免疫调节5、降血脂6等药理作用。酒精性肝损伤(alcoholic live disease,ALD)是指长期或大量饮用含有乙醇的饮料而引起的肝脏疾病7。在我国，酒精性肝病的发病率逐年上升，其危害仅次于病毒性肝炎。已有研究表明，天山雪莲乙醇提取物对缺氧小鼠肝脏线粒体具有保护作用8；对力竭性游泳过程中造成的小鼠肝、肾损伤有一定的保护作用9。未见雪莲培养物对酒精性肝损伤保护等的相关研究报道。本研究探究雪莲培养物对急性酒精肝损伤小鼠模型的肝功能的作用，分析雪莲酒和基酒灌胃后，小鼠体内酒精代谢情况，分析基酒和雪莲酒灌胃后，小鼠肝的相关指标变化，探讨雪莲培养物对急性酒精肝损伤、雪莲酒对酒精代谢速度及肝功能的影响。1材料与方法1.1实验一：雪莲培养物对急性酒精肝损伤小鼠的影响1.1.1小鼠分组处理及样品制备昆明小鼠，雌雄各半（46 周）。将昆明小鼠随机分为空白对照 A 组、模型组、雪莲培养物高（28.57 mg/kg）、中（14.28 mg/kg）、低（7.14 mg/kg）剂量组及阳性药组（水飞蓟宾10 mg/kg）。每日经口灌胃给予受试样品，空白对照A组和模型组给予蒸馏水（10 mL/kg）。每周称重两次，按体重调整受试样品剂量，给药时长为 30 d。给予受试样品结束时将模型组及各样品组一次灌胃给予 50%乙醇12 mL/kg BW，空白对照组A给蒸馏水，禁食16 h，乙醚麻醉后，正中切口进腹，于下腔静脉穿刺，抽取血液标本，分离肝组织，用于各项指标的检测及病理组织学检查。1.1.2肝损伤相关指标测定取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，置匀浆器中，加入 0.2 M 磷酸盐缓冲液，以20000 r/min匀浆10 s，间歇30 s，反复进行3次，制成 5%组织匀浆(W/V)，3000 r/min 离心 510 min，取上清液进行丙二醛(MDA)测定。取肝脏0.5 g加生理盐水5 mL充分研磨成细浆(10%肝匀浆)，混匀后取浆液 0.5 mL 加 4%磺基水杨酸0.5 mL混匀，室温下3000 r/min离心10 min，取上清液即为样品，进行还原型谷胱甘肽(GSH)测定。取肝脏0.1 g加无水乙醇0.9 mL冰水浴条件下机械匀浆(2500 r/min)，离心10 min，取上清液待测。参考试剂盒说明进行甘油三酯(TG)测定。1.1.3肝脏病理组织学变化及诊断标准从肝左叶中部做横切面取材，冰冻切片，油红O染色。从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化，用40倍物镜连续观察整个组织切片。主要观察脂滴在肝脏的分布、范围和面积。肝细胞内脂滴散在，稀少，记0分；含脂滴的肝细胞不超过1/4，记1分；含脂滴的肝细胞不超过1/2，记2分；含脂滴的肝细胞不超过3/4，记3分；肝组织几乎被脂滴代替，记4分。1.2实验二：小鼠体内酒精代谢检测1.2.1小鼠分组处理及样品制备昆明小鼠，雄性，体重3035 g。小鼠禁食不禁水12 h后，按下述剂量灌胃，饲养期间禁食不禁水。将小鼠随机分为空白对照B组（蒸馏水10 mL/kg）、雪莲酒高（12 mL/kg）、中（8 mL/kg）、低（4 mL/kg）剂量A组及基酒A组（用量同上）。小鼠称重并记录。取健康小鼠，分别在灌胃30 min、1 h、6 h、12 h后，小鼠眼球取血，室温放置30 min，常温置离心机中 3000 r/min 离心 10 min。精密吸取上层血清100 L加入等量的二甲基亚砜，置SK-1快速混匀曹坦，李胜男，龙则河 雪莲培养物对酒精性肝损伤及酒精代谢的影响研究4343酿酒科技2023年第3期（总第345期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.3(Tol.345)器中混匀后，以15000 r/min离心10 min。取上清液0.22 m有机系微孔滤膜滤过后测定，以保留时间定性，以峰面积定量。1.2.2标准曲线制备称取无水乙醇 2800 mg 于 100 mL 量瓶，用50%二甲基亚砜水溶液稀释至刻度，作为乙醇母液，用经校正的微量移液器分别取 5 mL、2.5 mL、1 mL、0.5 mL、0.2 mL、0.1 mL乙醇母液置于20 mL量瓶，用50%二甲基亚砜水溶液稀释配制成不同浓度的乙醇标准溶液(7 mg/mL、3.5 mg/mL、1.4 mg/mL、0.7 mg/mL、0.28 mg/mL、0.14 mg/mL)。以乙醇浓度为横坐标，乙醇峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。1.2.3色谱条件色谱柱：Agilent HP-5 5%phenyl methyl silox-ane 30 m320 m0.25 m，进样口温度为240；FID检测器温度为270；色谱升温程序：70(保留 1 min)，5/min 升至 90(保留 1 min)，40/min升至270 直到分析完成；载气：氮气流速为1mL/min，氢气流速为 30 mL/min，空气流速为 300mL/min，分流比为20 1。1.3长期饮酒后小鼠肝功能相关指标测定昆明小鼠，雄性，体重3035 g。将小鼠随机分为空白对照C组（蒸馏水10 mL/kg）、雪莲酒B组（中剂量8 mL/kg）、基酒组B（用量同上）。按上述剂量连续灌胃两个月，每天灌胃一次。相关指标含量测定按照“1.1 雪莲培养物对急性酒精肝损伤小鼠的影响”方法测定。2结果与分析2.1雪莲培养物对急性酒精肝损伤小鼠的影响与空白对照A组比较，模型组小鼠在制备急性酒精肝损伤模型后，肝脏中的MDA及TG含量显著升高，肝脏中的GSH含量显著降低，表示肝损伤建模成功，差异具有统计学意义(P0.05)；与模型组小鼠相比，雪莲培养物低、中剂量组小鼠肝脏中MDA显著降低，具有统计学差异(P0.05)；与模型组小鼠比较，雪莲培养物低、中、高剂量组小鼠肝脏GSH显著提高，差异具有统计学意义(P0.05)；与模型组小鼠相比，雪莲培养物低、中剂量组小鼠肝脏中TG显著降低，具有统计学差异(P0.05)。小鼠肝脏病理组织学观察，空白对照A组的小鼠肝组织结构完好，脂滴少；模型组小鼠可见明显的脂肪变性，出现大量脂肪空泡，提示酒精肝损伤建模成功。与模型组相比，雪莲培养物各剂量组出现不同程度的脂滴减少，肝组织结构趋向正常，见图1。小鼠肝组织脂肪变性程度积分，与空白对照A组比较，模型组小鼠在制备急性酒精肝损伤模型后，肝脏变性程度显著升高，具有统计学差异(P0.05)；与模型组小鼠相比，雪莲培养物低、中、高剂量组小鼠肝脏变性程度显著降低，差异具有统计学意义(P0.05)。2.2小鼠体内酒精代谢情况实验结果表明，基酒A组与雪莲酒A组小鼠血清中乙醇浓度均与灌胃剂量成正比。经不同时间采血测定血液乙醇含量，与基酒A组比较，相应剂量的雪莲酒A组小鼠血液中乙醇含量均降低，尤其在 30 min、60 min，雪莲酒 A 组小鼠血液酒精含量明显低于基酒 A 组，差异具有统计学意义(P0.05)。基酒A组与雪莲酒A组小鼠血清中乙醇浓度均与灌胃剂量成正比。与基酒A组小鼠比较，各个时间点相应剂量的雪莲酒A组小鼠血液中乙醇含量均降低。以上结果说明，与基酒比较，雪莲酒表1雪莲培养物对急性酒精肝损伤小鼠肝脏中MDA、GSH、TG的影响(xs)分组空白对照A组模型组雪莲培养物低剂量组雪莲培养物中剂量组雪莲培养物高剂量组阳性药组MDA(nmol/g prot)0.440.140.900.23#0.670.19*0.580.18*0.880.250.810.23GSH(mg/g prot)6.130.125.020.15#6.110.12*6.230.25*5.770.25*6.880.50*TG(nmol/g肝组织)25.673.5433.781.06#30.540.68*26.132.40*33.431.9023.033.28*注：#表示与空白对照A组比较；*表示与模型组比较，P0.05。4444一定程度上促进了小鼠血液的酒精代谢速度。2.3长期饮酒对小鼠肝功能的影响与空白对照C组比较，经雪莲酒和基酒分别灌胃一个月后，小鼠肝脏MDA、TG含量均有一定上升趋势，但无统计学意义；基酒降低了GSH含量，雪莲酒无作用；雪莲酒和基酒分别灌胃两个月后，与空白对照C组比较，基酒B组MDA、TG含量明显升高，雪莲酒无统计学差异；基酒和雪莲酒不同程度降低了GSH含量，雪莲酒对GSH降低程度更小。实验结果说明与基酒相比，雪莲酒对肝脏损伤程度较小。3结论对小鼠进行不同干预后，与模型组比较，雪莲低、中剂量组急性酒精肝损伤小鼠肝脏MDA含量显著降低；经GSH活性检测，与模型组比较，雪莲低、中、高剂量组的小鼠肝脏GSH含量显著提高；以甘油三酯测定试剂盒测定急性酒精肝损伤小鼠肝匀浆中的TG活性，与模型组比较，雪莲低、中剂量组的小鼠肝脏TG含量显著降低。经油红染色观察肝脏病理组织学变化，与模型组比较，雪莲组低、图1小鼠肝脏切片的病理组织学观察（油红O染色）表2雪莲培养物对急性酒精肝损伤小鼠肝脏病理组织变化的影响组别空白对照A组模型对照组雪莲培养物低剂量组雪莲培养物中剂量组雪莲培养物高剂量组阳性药组评分03000001100212200223130120014030000总评分1159677变性程度积分(xs)0.250.253.750.25#2.500.29*1.500.29*1.750.25*1.750.48*注：#表示与空白对照A组比较；*表示与模型组比较，P0.05。表3雪莲酒与基酒灌胃小鼠血清中乙醇含量的变化()(g/L)分组基酒A组(30 min)基酒A组(60 min)基酒A组(6 h)基酒A组(12 h)雪莲酒A组(30 min)雪莲酒A组(60 min)雪莲酒A组(6 h)雪莲酒A组(12 h)乙醇浓度4 mL/kg1.640.131.200.060.080.0030.080.0161.240.16*0.700.17*0.070.001*0.070.004*8 mL/kg2.970.083.400.150.480.070.0980.0062.430.27*2.980.19*0.430.0050.0880.005*12 mL/kg5.480.395.680.102.840.360.130.0294.730.17*5.190.19*2.360.520.110.006注：*表示与同一时间点的基酒A组比较，P0.05。曹坦，李胜男，龙则河 雪莲培养物对酒精性肝损伤及酒精代谢的影响研究4545酿酒科技2023年第3期（总第345期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.3(Tol.345)中、高剂量组小鼠肝脏变性程度显著降低。综上说明，雪莲培养物对小鼠酒精肝损伤具有一定的保护作用。对小鼠进行不同酒剂灌胃，分别给予雪莲酒或基酒半小时后，小鼠相继出现不同程度的醉酒反应，如精神不振和饮水量减少、活动少、走路不稳、反抗力减弱、翻正反射消失、四肢皮温高、心跳加快、易激惹、普遍出现用前爪挠嘴等现象。在醉酒后57 h，行为逐渐恢复正常状态，雪莲酒各剂量组的小鼠相对于基酒各剂量组的小鼠，醉酒行为较快恢复到正常状态。实验结果表明，基酒A组与雪莲酒A组小鼠血清中乙醇浓度均与灌胃剂量成正比。与基酒A组小鼠比较，各个时间点相应剂量的雪莲酒A组小鼠血液中乙醇含量均降低。对小鼠进行雪莲酒和基酒灌胃后，与基酒B组比较，雪莲酒B组小鼠醉酒行为较快恢复正常状态。经连续灌胃两个月后，基酒B组MDA、TG含量明显升高，基酒和雪莲酒组 GSH 含量均降低，基酒 B 组的GSH降低程度更加明显。以上结果说明，与基酒比较，雪莲酒一定程度上促进了小鼠血液的酒精代谢速度，同时雪莲酒对肝脏损伤程度较小。本研究分析结果表明，雪莲培养物对小鼠急性酒精肝损伤具有一定的保护作用，雪莲酒促进了小鼠血液的酒精代谢速度，对肝脏损伤程度较小。研究对进一步酒精性肝损伤保护研究具有重要意义，为雪莲酒的开发利用提供了理论依据。参考文献：1国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部M.北京：中国医药科技出版社,2020：55-56.2范文霞,杨伟鹏,刘汉石.天山雪莲细胞培养技术、化学成分和药理作用研究进展J.中国中药杂志,2021,46(14)：3522-3528.3王彦礼,刘雅萍,高俊鹏,等.雪莲细胞培养物活血化瘀及抗炎作用研究J.中国中医基础医学杂志,2018,24(2)：184-186.4周湘洁,邸敏,张丽芬,等.雪莲培养细胞提取物的抗急性低压缺氧作用机制研究J.中华航空航天医学杂志,2015,26(1)：8-13.5贾景明,吴春福.天山雪莲培养物对小鼠免疫功能的影响J.中华中医药杂志,2007(4)：238-240.6张会会,王怡薇,王彦礼,等.雪莲细胞培养物调血脂及抗氧化作用研究J.中国中医基础医学杂志,2013,19(12)：1466-1468.7张浩然,李清安.中草药对酒精性肝损伤保护作用的研究进展J.时珍国医国药,2021,32(6)：1449-1451.8蒋炜,樊鹏程,何蕾,等.天山雪莲乙醇提取物对缺氧小鼠肝脏线粒体的保护作用研究J.中药材,2015,38(4)：790-793.9王沛,郭魁亮,张亚超,等.雪莲对力竭性游泳小鼠肝肾保护作用的研究J.白求恩军医学院学报,2004(4)：199-200.表4雪莲酒对小鼠肝脏中MDA、GSH、TG含量的影响(xs)分组空白C组基酒B组雪莲酒B组MDA(nmol/g prot)一个月0.440.150.500.110.480.23二个月0.460.090.720.13*0.550.12GSH(mg/g prot)一个月6.020.135.360.06*5.860.11二个月5.980.055.010.12*5.790.06*TG(nmol/g肝组织)一个月252.6292.3261.4二个月242.3321.2*282.5注：*表示与空白对照C组比较，P0.05。宿迁两家酒类技能大师工作室过审本刊讯：近日，江苏省宿迁市人民政府发布消息，拟认定2022年宿迁市技能大师工作室10个、宿迁市企业首席技师12人。其中，江苏洋河酒厂股份有限公司李薇技能大师工作室、江苏双沟酒业股份有限公司崔凤元技能大师工作室入选2022年宿迁市技能大师工作室；江苏洋河酒厂股份有限公司张龙云、江苏双沟酒业股份有限公司王磊入选2022年宿迁市企业首席技师。（筱鹂 荐）来源：酿酒研究院2023-02-134646