野生越南槐组织特异性内生真菌组及体外抗病原菌功能.pdf
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1、 .():/.:./.姚裕群 兰可 黄荣韶 等.野生越南槐组织特异性内生真菌组及体外抗病原菌功能.广西植物():.():.野生越南槐组织特异性内生真菌组及体外抗病原菌功能姚裕群 兰 可 黄荣韶 吴炫柯(.广西科技大学 医学部 广西 柳州 .柳州市农业气象试验站 广西 柳州 .广西中医药大学 南宁 )摘 要:有益微生物组能帮助宿主植物防御病害 越南槐的根、茎和种子在野外环境下健康发芽生长而栽培越南槐各组织极易感病 为了探明利用野生越南槐有益内生真菌组防治宿主病害的可能该文在分离健康野生越南槐根、茎和种子内生真菌的基础上并结合形态学和 序列特征鉴定内生真菌通过系统发育树、多样性指数和 多样性指数分
2、别分析各内生真菌组的系统进化、多样性和相似性通过琼脂块法和平板对峙法测试内生真菌组的体外抗病原菌功能 结果表明:()从越南槐根、茎和种子内生真菌组分别分离鉴定 株 个分类单元、株 个分类单元、株 个分类单元()特有属多且所有种均为特有种显示根、茎和种子内生真菌组在属种进化上具有组织特异性()根茎/根种子/茎种子间极低的 多样性显示根、茎和种子各内生真菌组间的物种相似性极低()高的 多样性显示越南槐根、茎和种子均有丰富多样的内生真菌组()各内生真菌组三分之一以上的分类单元在体外均能拮抗供试病原菌根茎内生真菌组显示了强广谱的体外抗病原细/真菌功能种子内生真菌组显示了强广谱的体外抗病原真菌功能 该研
3、究结果表明健康野生越南槐根、茎和种子内部均存在有益内生真菌组其具有生物多样性、组织特异性以及强广谱的体外抗病原菌功能在宿主各组织的抗病性方面可能发挥重要作用 这些结果将为进一步利用有益真菌组防治栽培越南槐各组织病害提供了材料和实验基础关键词:野生越南槐 有益内生真菌组 生物多样性 组织特异性 抗病功能中图分类号:文献标识码:文章编号:()(.)收稿日期:基金项目:国家自然科学基金()广西自然科学基金()年广西高校中青年教师科研基础能力提升项目()广西科技大学博士基金()第一作者:姚裕群()博士副研究员主要研究药用植物内生真菌宿主互作机制().通信作者:吴炫柯硕士高级工程师研究方向为应用气象()
4、.:.:().()()()()./.:越南槐()是广西著名道地药材山豆根的基源植物 山豆根药材清热解毒、消肿利咽常用于治疗湿热黄疸、心率失常、膀胱癌等症(国家药典委员会)含有生物碱、黄酮、皂苷等多种化学成分其中苦参碱和氧化苦参碱为其主要活性成分(.)具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、抑菌、保肝、调节免疫、降血压等药理学作用(彭成)随着健康大产业及乡村振兴的深入发展越南槐在广西百色、靖西、河池等地区推广种植 课题组在越南槐的野生驯化及其推广栽培中发现栽培越南槐容易感染各种病害其种子容易霉变影响发芽根茎时常腐烂发生炭疽溃疡引起条斑黑斑从而影响药材生长 而大量化学农药的使用容易导致药材农药、重金属等
5、超标严重影响药材安全(.)因此发展绿色环保的越南槐病害防治策略对山豆根药材的可持续利用和发展极其重要 植物有先天的免疫系统以响应病原微生物的分子机制及效应物(.)植物有益微生物组通过与植物先天免疫系统的互作(.)使 植 物 系 统 获 得 相 关 抗 病 性(.)对植物的健康有重要的作用(.)番茄根系微生物组研究发现抗病与感病植株根系微生物组的结构、抗菌性功能有很大差异抗病植株根系微生物组作为有益微生物组转接到感病植株能激活感病株的抗病性(.)植物微生物组包括真菌组和细菌组根系微生物组主要来源于高度多样性的土壤生物受土壤类型、植物基因型、植物年龄等影响茎和种子微生物主要来源于气溶胶、昆虫及根系
6、的迁移(.)在植物有益内生真菌组中各内生真菌通过与宿主进行复杂而精细的互作以激活植物先天免疫系统使宿主获得抗病性以拮抗病原和害虫的入侵甚至部分内生真菌自身就可以分泌毒性代谢物以拮抗病原菌的入侵(.)因此有益内生真菌组有利于宿主防御病害 野生越南槐生长于海拔 石灰岩山区的石头缝里周围植被类型多样局部小气候复杂多变在 期姚裕群等:野生越南槐组织特异性内生真菌组及体外抗病原菌功能这样的生境下野生越南槐依然能健康发芽生长并形成独特的药性此外项目组前期研究工作发现越南槐各组织内有内生真菌(姚裕群)因此我们推测独特复杂的野外生境容易使越南槐根、茎和种子形成独特而多样性的有益内生真菌组这些内生真菌组在拮抗病
7、虫害方面可能发挥重要作用 本研究以相同生长年限不同时期采集的野生越南槐根、茎和种子为研究对象依托广西科技大学重点实验室、柳州市农业气象试验站采用组织块法分离内生真菌 结合形态和 序列测序比对鉴定真菌最大似然法构建内生真菌组系统发育树 软件计算内生真菌组的 多样性指数、多样性指数分别采用琼脂块法和平板对峙法体外测定内生真菌组各分类单元对病原细菌、真菌的拮抗活性 通过分析野生越南槐根、茎和种子内生真菌组的属种系统发育、多样性、多样性及体外抗病原菌功能拟探讨以下问题:()野生越南槐根、茎和种子各有益内生真菌组在属种系统发育上是否有差异()野生越南槐根、茎和种子各有益内生真菌组的多样性和相似性如何()
8、野生越南槐根、茎和种子各有益内生真菌组体外是否具有抗病功能 本研究结果拟为探索利用野生越南槐各有益真菌组防治栽培越南槐各组织病害提供材料及实验基础材料与方法.材料.供 试 药 用 植 物 供 试 株 野 生 越 南 槐()年生株高约 根直径约 茎直径约.种子大小均匀饱满约(.根茎采集期分别为 年 月、月、月不同成熟度种子采集期分别为 年 月、月、月均采自靖西市诚良村山上(、)采集的越南槐根、茎和种子分别装袋、贴上标签并立即运往广西科技大学生物化学与分子生物学实验室并在 内处理样品.供试病原菌供试病原细菌为细菌性软腐病菌()、细菌性条斑病菌(.)、细菌性溃疡病菌(.)供试病原真菌为根腐病菌()、
9、炭 疽 病 菌()、黑斑病菌()以上菌株均保藏在广西科技大学基础医学部.培养基、试剂与测序马铃薯葡萄糖()培养基、玉米培养基、培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司所有培养基在 下湿热灭菌 备用次氯酸钠、甘油、酒精 均 购 自 成 都 金 山 化 学 试 剂 有 限 公 司购自天根生化科技有限公司引物/合成及 产物测序均由南京钟鼎生物技术有限公司完成.仪器与设备生物安全柜()、扩增仪()、凝 胶 成 像 系 统()、生化培养箱()、超低温冰箱()、离心机()、显微镜()、鼓风干燥箱()、全自动高压灭菌锅().方法.根、茎和种子内生真菌的分离纯化将越南槐的新鲜健康根段、茎段和种子用流水彻底冲洗表
10、面晾干后移到超净工作台分别进行表面消毒即 酒精 无菌水漂洗 次次氯酸钠(根段/茎段 种子 )后无菌水漂洗 次无菌吸水纸吸干表面根段/茎段分别去除两端和表皮后切成 .大小的组织块种子分为种皮和胚均转接至/玉米粉培养基(含氯霉素和氨苄青霉素)并于 培养箱黑暗培养 待各组织边缘长出菌丝后及时挑取单一菌丝至 培养基上长出的菌落如果外部形态不一致继续挑取单一菌丝直至长出外部形态一致的菌落.根、茎和种子内生真菌的分类鉴定根据菌落的组织来源、培养时间及外部形态分别将根段、茎段和种子分离到的菌株划分为不同的形态型采用 分子标记鉴定每个形态型的代表菌株 采用通用引物对/从代表菌株基因组 扩增 序列并测序(.)分
11、别 使 用 软 件 .和.分析测序序列登录 数据库比对下载最相似(尽量选择正式发表)序列使用.软件的邻接法()构建系统发育树经 次循环检验系统树的可靠性 在系统发育树中比对测序序列与参考序列之间的相似性依据真菌鉴定的常用相关阈值鉴广 西 植 物 卷定真菌(.)即相似性为未鉴定相似性为鉴定到属水平相似性为鉴定到种水平在属内比较中明显高于其他种时则被鉴定为同种.根、茎和种子各内生真菌组的系统进化基于真菌分类单元的 序列通过 .软件采用最大似然法()构建系统发育树来分析野生越南槐根、茎和种子各内生真菌组的属种系统进化().根、茎和种子各内生真菌组的多样性和相似性 基于野生越南槐根、茎和种子各内生真菌
12、组的分类单元及其分离株系分别计算各真菌组的 多样性 指 数 香 农 维 纳 指 数()和辛普森多样性指数()及 多样性指数索伦森指数()和雅卡尔指数()通过 多样性指数来分析野生越南槐根、茎和种子各内生真菌组的多样性通过 多样性指数来分析野生越南槐根、茎和种子各内生真菌组间的物种相似性(.)使用生物统计软件.以及运用方差和多重比较以分析野生越南槐根、茎和种子各内生真菌组的多样性差异.根、茎和种子各内生真菌组的体外抗病原菌功能 挑选内生真菌组各分类单元的代表菌株用于体外抗病原菌功能筛选 采用琼脂块法(姚裕群等)筛选供试内生真菌对病原细菌的拮抗活性即将新鲜病原细菌调成.麦氏浊度的菌悬液并将其在 内
13、用无菌棉签均匀涂布于 培养基平板上将 直径的内生真菌菌块接入风干后的 培养基筛选平板每皿接 个菌块()培养 后观察并测量抑菌圈直径采用平板对峙法筛选(.)供试内生真菌对病原真菌的拮抗活性即将内生真菌和病原真菌均制成 直径菌块 块内生真菌接种于 培养基中央且周围等距接种 块病原真菌为处理以不接种内生真菌为对照 下培养待对照长至平板中央测量各病原菌块中心至平板中央之间病原菌的生长量并计算抑菌率抑菌率()对照生长量处理生长量对照生长量.统计分析基于野生越南槐根、茎和种子各内生真菌组的分类单元及其分离株系计算相对频率()多样性指数(香农维纳指数和辛普森多样性指数)及 多样性指数(索伦森指数和雅卡尔指数
14、)(.)使用生物统计软件 .以及运用方差和多重比较以分析野生与培越南槐内生真菌组多样性差异结果与分析.根、茎和种子内生真菌的分离和鉴定从野生越南槐根段共计 个组织块中分离获得 株内生真菌(图)从茎段 个组织块共分离获得 株内生真菌(图)从 粒种子共分离获得 株内生真菌(图)首先将分离自根、茎和种子的菌株分开然后将相同组织来源的菌株分别培养将相同培养时间内菌落孢子形态一致的菌株划分为同一形态型最后采用 序列分析鉴定每个形态型的代表菌株 结合形态学和 序列分析从根内生真菌组的 个形态型代表菌株中共鉴定 个分类单元从茎内生真菌组的 个形态型代表菌株中共鉴定 个分类单元从种子内生真菌组的 个形态型代表
15、菌株中共鉴定 个分类单元且均来自于种皮 每个分类单元为一个特定的真菌物种依据真菌物种鉴定的常用相关阈值(见方法部分)根内生真菌组的 个分类单元(物种)中 个分类单元鉴定到属水平 个分类单元鉴定到种水平 个分类单元未鉴定茎内生真菌组的 个分类单元(物种)中 个分类单元鉴定到属水平 个分类单元鉴定到种水平 个分类单元未鉴定种子内生真菌组的 个分类单元(物种)中 个分类单元鉴定到属水平 个分类单元鉴定到种水平 个分类单元未鉴定 相关数据已上传 数据库登录号为、及.根、茎和种子各内生真菌组的系统进化基于野生越南槐根内生真菌组 个分类单元茎内生真菌组 个分类单元以及种子内生真菌组 个分类单元的 序列采用
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