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通过Forskolin将小...纤维细胞重编程为神经元试验_汤文魁.pdf
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1、书书书2023(03):1 6DOI:1019848/j cnki ISSN 1005 27392023 020016收稿日期:2023 02 26作者简介:汤文魁(1998),男,硕士研究生,372763488 qq com通信作者:黄奔(1979),男,教授,博士,研究方向为细胞命运调控,benhuang gxu edu cn通过 Forskolin 将小鼠成纤维细胞重编程为神经元试验汤文魁1,王国栋1,魏梦珍1,张丹丹2,吕丹薇1,刘权辉1,黄奔1,2*(1 广西大学 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁 530004;2 广西壮族自治区人民医院,南宁 530004)摘要:为
2、了给临床神经退行性疾病治疗提供有应用价值的方法、突破试验不能转化为临床这一瓶颈,试验通过使用单一小分子化合物 Forskolin 调控小鼠成纤维细胞命运的方法,使其重编程为神经元,并进行了 T-qPC、免疫荧光检测。结果表明:经诱导后的神经元表现出典型的神经元形态;T-qPC 结果显示神经元相关基因表达上调,成纤维相关基因表达下调;免疫荧光结果显示,诱导神经元的神经元相关蛋白 TUJ1、MAP2 的表达呈阳性。说明使用 Forskolin 替代转录因子在体外可以实现将小鼠成纤维细胞直接重编程为神经元,应用此成果可在临床治疗上避免外来遗传物介入导致的致瘤致病风险。关键词:小分子化合物;重编程;神
3、经元;成纤维细胞;神经退行性疾病中图分类号:Q954 6文献标识码:A神经退行性疾病是一类中枢神经系统神经元结构和功能被改变的疾病,例如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和肌萎缩侧索硬化(ALS)1 5。目前,神经退行性疾病的治疗方法主要采用药物治疗,但这些治疗方法效果并不理想。自诱导多能干细胞的方法建立以来,干细胞重编程成为了治疗神经退行性疾病的一种有前途的方法,为再生医学带来了希望。因此,细胞替代疗法成为近年来的研究热点。以往研究通过引入外源转录因子将终末分化的体细胞重编程为各种类型的细胞,这些研究结果表明细胞的命运是可逆的6 8。研究人员将成纤维细胞诱导为神经干细胞,诸如此类的研究在
4、治疗神经退行性疾病或损伤方面具有一定的前景。外源性转录因子在成纤维细胞中过表达,并直接识别基因组中的特定位点、招募和协调其他转录调控因子来重塑宿主细胞的表观基因组,最终成功诱导为神经干细胞9。然而,异位基因的插入通常需要病毒载体,而将逆转录病毒载体整合到重编程的基因组中会带来插入突变、残余表达及转基因活化的风险,这可能会导致宿主癌变10 11。此外,其使用复杂、需要大量时间、诱导效率低等缺点也削弱了其应用价值12。与遗传学诱导方法相比,小分子化合物诱导具有多个重要优势13,小分子化合物相对容易应用、优化和制造,更容易开发成药物,更安全12,14。这些优势使小分子化合物调节细胞命运在临床应用上更
5、为可行15 17。成纤维细胞是最早成功重编程为多能干细胞(iPSCs)的一类体细胞18,iPSCs 能在体内分化为包括神经元在内的几乎任何类型的细胞。与成纤维细胞重编程为 iPSCs 再分化为神经元的方法相比,直接将体细胞重编程为神经元可以使起始细胞不经历脱分化的步骤,避免起始沉默 基 因 自 发 地 重 新 激 活 并 介 导 多 能 性 的 恢复19 20,从而降低了细胞移植术后形成肿瘤的风险21。本试验利用含有单一小分子化合物的诱导培养基(N2B27、150 mol/L Forsklin)处理小鼠成纤维细胞 12 h 后,更换成熟培养基培养 2 h,将其诱导为神经元,此研究有望为治疗神经
6、退行性疾病提供一种有前途的细胞替代方法。11材料与方法1.1材料1.1.1试验动物昆明小鼠(KM 小鼠),购自北京维通利华实验动物技术有限公司。1.1.2主要试剂和仪器设备DMEM、南美胎牛血清(FBS)、F12、N2 添加剂、B27 添加剂,购自 Gibco 公司;磷酸缓冲盐溶液(PBS),购自碧云天生物技术有限公司;Forsklin,购自赛默飞公司。DMEM/F12:神 经 基 础 培 养 基(Neurobasal)(1 1),0.5%N2 添加剂,1%B27 添加剂、100 mol/L环磷酸腺苷(cAMP),20 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子(bFGE),20 ng/mL 脑 源
7、性 神 经 营 养 因 子(BDNF),20 ng/mL 胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),20 ng/mL 神经营养因子 3(NT3)、青链霉素溶液(penicillin/streptomycin)和小分子化合物 即1 mmol/L 丙戊酸(VPA)、3 mol/L CHI99021、10 mol/L Forsklin、10 mol/L Y-27632 和 1 mol/Lepsox。TIzol,购自武汉赛维尔生物科技有限公司;琼脂糖,购自 BIOWEST 公司;cDNA 合成试剂盒、荧光定量 PC 试剂盒,购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。超净工作台,苏州佳德净化科技公司产品;离心机,
8、Eppendorf 公司产品;电泳仪,Bio-ad公司产品;PC 仪,Analytikjena 公司产品;荧光定量PC 仪,罗氏(oche)公司产品;安捷伦 2100 NANano 6 000 Assay Kit,美国 Agilent 公司产品;K5500分光光度计,北京凯奥科技发展有限公司产品。以上仪器、设备均由广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室提供。1.2方法1.2.1小鼠胚胎成纤维细胞的原代分离孕鼠麻醉断颈处死后,用 75%乙醇浸泡一下迅速拿出,取出带有胚胎的子宫。用 PBS 缓冲液洗涤后,解剖完整的所有胚胎,用剪刀剪开胚胎,剪掉头部、四肢和内脏,其他部分用剪刀剪碎,将细
9、小组织碎片贴于100 mm 的培养皿放入37、5%CO2培养箱中,等其贴壁后加入 DMEM(含血清)放入37、5%CO2培养箱中培养。1.2.2神经元的生成在 37、5%CO2的条件下培养小鼠成纤维细胞(MEFs),第 3 代后的细胞用于后续试验。当细胞密度达到 90%时,将 MEFs 接种到 96 孔板中,加入DMEM(含血清)培养基培养过夜后,用 PBS 缓冲液清洗 3 遍,对照组加入 N2B27 培养液,试验组加入含有单一小分子的诱导培养基(N2B27、150 mol/LForsklin),处理 12 h 后,两组细胞均更换成熟培养基培养 2 h,拍照对比。1.2.3诱导神经元的 T-q
10、PC 验证以 N2B27 培养液处理的小鼠成纤维细胞为对照组,诱导培养基(N2B27、150 mol/L Forsklin)处理的小鼠成纤维细胞为试验组。使用 TIzol 法从样品中提取总 NA,使用 Vazyme HiScript T SuperMixfor qPC(货号 323-01)逆转录酶将 NA 反转录为cDNA。选取神经元相关基因以及成纤维相关基因表 1引物序列Tab 1Primer sequences基因名称引物序列序列号产物大小/bpGAPDHF 5 TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG 3NC_000072111 5 AGGTGGAAGAATGGGTG 3TUJIF 5
11、ACAAGTATGTGCCCAGAGCCA 3NC_000074226 5 CCCTGCAGGCAGTCACAATTC 3MAP2F 5 CAGGCTCCCAGTGCGTTTA 3NC_000067184 5 TGGTCCGTCGTGCTGAAGA 3NSEF 5 TGAGGAGCGTGGACTGTCTGTAG 3NC_000072208 5 AGCCTTGGGAACCTGACCTAGC 3FnF 5 TTGCAACCCACCGTGGAGTATGTG 3NC_000067187 5 CTCGGTAGCCAGTGAGCTTAACAC 3CTGFF 5 TGTGCACTGCCAAAGATGGT 3
12、NC_00007651 5 GGTACACGGACCCACCGA 32esearch CommunicationHeilongjiang Journal of Animal eproductionIssue 3表 2T-qPC 反应体系Tab 2qT-PC reaction system组分体积/L2 ChamQ Universal SYB qPC Master Mix10.010 mol/L 上游引物0.410 mol/L 下游引物0.4cDNA1.0ddH2O8.2进行 T-qPC 验 证,以 小 鼠 GAPDH 为 内 参,用Vazyme Q711-02/03 试剂盒的方法对获得的 cD
13、NA 进行荧光定量 PC,引物序列见表 1,反应体系见表 2。反应程序:95 预变性 3 min;95 变性 10 s,60 退火30 s,共40 个循环;95 反应15 s。绘制熔解曲线。每个样本设计 4 个技术重复孔,在 oche 定量PC 仪中进行反应,数据结果采用 2 CT法进行计算,用 SPSS 20.0 软件对数据进行分析。1.2.4诱导神经元的免疫荧光验证将小鼠成纤维细胞接种于 96 孔板中培养过夜。对照组换 N2B27 培养液,试验组换诱导培养基(N2B27、150 mol/L Forsklin),培养 12 h 更换成熟培养基培养 2 h。诱导后进行荧光染色操作,弃去诱导液,
14、用 PBS 洗 3 遍,孔板中加入 4%的 PFA 中固定20 30 min;用阻断液清洗 3 遍,每次 3 min;孔板中加入 1%的 TritonX-100,室温孵育 15 min;用阻断液清洗 3 遍,每次 5 min;加入 1%的 BSA,封闭 1.5 2.0 h;TBP 清洗 3 遍,每次 5 min;用 1%的 BSA 按照说明书稀释 TUJ1、MAP2 然后加入孔板中,4 孵育过夜;室温复温 20 min 后,用 TBP 清洗 3 遍,每次5 min;将二抗和 Hoechst 用 1%BSA 稀释,常温孵育二抗 1.5 h;TBP 清洗 3 遍,每次 5 min;加入 PBS 后
15、即可拍照。2结果与分析2.1重编程过程中细胞形态变化为了记录重编程前后细胞形态的变化,对诱导前后细胞进行拍照观察,对比发现诱导后的细胞变圆,并且有突触出现,证实诱导后的细胞在形态上与神经元细胞相似(见图 1)。图 1小鼠成纤维细胞诱导前后形态Fig.1Morphology of mouse fibroblasts before and after induction2.2诱导神经元定量 PC 验证收集诱导前后细胞样品,对神经元相关基因TUJ1、MAP2、NSE 及成纤维相关基因 Fn、CTGF 进行T-qPC 验证。结果显示,神经元相关基因表达水平极显著上调(P 0.01),成纤维相关基因极显
16、著下调(P 0.01),见图 2。2.3诱导神经元相关蛋白表达验证对诱导前后的小鼠成纤维细胞进行免疫荧光染色,发现神经元相关蛋白 TUJ1、MAP2 的表达呈阳性(见图 3)。图 2诱导神经元定量 PC 基因表达水平Fig.2Quantitative PC gene expression ininduced neurons33 期黑龙江动物繁殖研究与探讨图 3细胞免疫荧光染色检测神经元标志物 TUJ1、MAP2 表达量Fig.3The expression levels of TUJ1 and MAP2 detected by immunofluorescence staining3讨论中枢神
17、经系统(CNS)中的神经元是终末分化的细胞,由于转录组和染色质景观的变化,它们在成熟过程中逐渐失去支持再生的能力22。为解决神经元在受伤后无法再生这一问题,以往的研究人员通过将成纤维细胞重编程为 iPSCs,iPSCs 在体内分化为神经元18。近年来研究发现成纤维细胞可以通过重新编程为胚胎外内胚层样状态,绕过 iPSC 阶段,直接转化为功能性神经元23。这一方法减少了自发突变发生的机会;也避免了 iPSC 的生成,减少了畸胎瘤出现的风险24。研究人员将成纤维细胞重编程为神经元主要通过两类方法,分别是以外源性转录因子传递方法和非整合基因传递方法,细胞膜可渗透蛋白质和小分子化合物。研究人员找出了一
18、些与神经发育过程有关的基因,转入小鼠成纤维细胞,成功得到诱导性神经元。但该试验得到的神经元不具备特异性。而后研究人员联合应用 11 种因子并在此基础上添加NEUOD1,就可将人成纤维细胞转化成运动性神经元25。在动物方面,猪成纤维细胞能够被 microNA(mi-9/9*和 mi124)和 Ascl1 直接重编程为神经元26。但是外源性转录因子、异位基因等方法效率较低并存在一些安全问题。为解决上述问题,研究人员开始选择加入小分子的方法来提高诱导效率。研究人员筛选出与神经元生物发生过程相关的小分子,并联合转录因子 NGN2 将人胚肺成纤维细胞重编程成神经元27 28。随后该团队在此基础上将慢病毒
19、载体感染皮肤成纤维细胞,并添加小分子诱导得到神经元,但是该神经元生物活性较差。在低氧条件下29,通过小分子化合物组合诱导大鼠成纤维细胞重编程神经前体细胞,该细胞具有体内与体外诱导分化为神经胶质细胞和神经元的潜能。在大鼠上,可以通过小分子化合物组合(SMs)将大鼠胚胎成纤维细胞在体内和体外有效重编程为诱导神经元30。邓宏魁团队利用小分子组合将小鼠成纤维细胞直接重编程成为功能性神经元31。Forskolin 具备影响神经元产生和活动等作用,据报道通过一种转录因子 Ascl1 和化合物 Forsklin 联合作用将小鼠成纤维细胞转化为细小白蛋白神经元32,同时 Forskolin 可以通过提高 cA
20、MP 水平作用轴突 CB1 受体来影响神经元的活动33。本课题组4esearch CommunicationHeilongjiang Journal of Animal eproductionIssue 3的研究通过改变多种小分子组合的诱导方式,利用单一小分子化合物 Forskolin 诱导小鼠成纤维细胞直接重编程为神经元,并在基因和蛋白层面表达神经元相关的标志物。本研究无需低氧条件,利用单一小分子化合物组合将小鼠成纤维细胞重编程成神经元,诱导条件十分简便。与成纤维细胞重编程为 iPSCs、iPSCs 再分化为神经元方法相比,不经过 iPSC 阶段直接转化为神经元安全性更高,这主要由于 iPS
21、Cs 细胞除具有全能性之外,同时还拥有其起始细胞的分子痕迹24。在再生医学研究领域,无法排除肿瘤或其他畸变细胞的风险,并最终无法安全应用于细胞类型的临床医疗当中。与小分子化合物介导重编程相比,传统重编程方法主要是依赖于病毒介导的转导引入外源性遗传物质,被用于促进细胞命运的变化,它们具有将外来 DNA 片段整合到基因组中的潜在风险,这会导致不可预测的副作用,例如肿瘤形成。此外将目的基因瞬时引入细胞这一传统重编程方法相对更安全,也被用于诱导细胞命运的变化,但其具有效率低、试验设置复杂和成本高等缺点34。小分子化合物安全性和效率更高,成本更低,使用条件易于优化,不需要改变细胞的遗传物质,使用小分子可
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