一对两次发生胎儿骨骼发育异常夫妇的遗传学分析_黎昱.pdf

基金项目:国家自然科学基金面上项目(82172993)作者简介:黎昱，女，1986 07 生，硕士，助理研究员，E-mail:liyu19872004163 com收稿日期:2022 11 05一对两次发生胎儿骨骼发育异常夫妇的遗传学分析黎昱，宋婷婷，郑娇，徐盈，李佳，杨红*(空军军医大学第一附属医院妇产科，西安710032;*通讯作者，E-mail:yanghongfck163 com)摘要:目的筛查一对夫妇发生两次胎儿骨骼发育畸形的致病性基因变异。方法在经过遗传咨询，取得知情同意后，利用夫妻外周血及第二次妊娠胎儿样本，提取基因组 DNA。应用全外显子测序技术对基因组中外显子及剪切区域进行深度测序分析，对疑似致病变异利用 Sanger 测序验证候选基因的突变位点。结果胎儿样本携带 ALPL c 1120G A(pVal374Met)和 c 648+1G A 的 2 个位点突变，为复合杂合突变。其中 ALPL c 1120G A(p Val374Met)遗传自母亲，c 648+1G A 遗传自父亲，2 个突变均为致病突变。结论ALPL 基因的复合杂合突变可能是胎儿发育异常的致病原因。对于 B超提示骨骼发育异常的胎儿，通过全外显子测序和 Sanger 测序可以明确致病原因，为夫妻的再生育提供依据。关键词:骨骼发育异常;全外显子测序;ALPL;Sanger 测序;突变中图分类号:7145文献标志码:A文章编号:1007 6611(2023)04 0550 04DOI:1013753/j issn1007 6611202304020Genetic analysis of one couple with a history of fetal skeletal dysplasias twiceLI Yu，SONG Tingting，ZHENG Jiao，XU Ying，LI Jia，YANG Hong*(Department of Obstetrics and Gynecology，First Affiliated Hos-pital of Air Force Medical University，Xi an 710032，China;*Corresponding author，E-mail:yanghongfck163 com)Abstract:ObjectiveTo screen the pathogenic gene mutation in a couple with fetal skeletal dysplasias twiceMethodsGenomicDNA was extracted from samples from the second pregnancy fetus and the peripheral blood from the couple after informed consent andgenetic counseling All exons and flanking regions were analyzed by whole exon sequencing Candidate pathogenic variants in susceptedsamples were verified by Sanger sequencingesultsThe fetal sample carried compound heterozygous variants c 1120G A(pVal374Met)and c648+1G A of the ALPL gene The missense variant，c1120G A(P val374Met)，was inherited from the mother，and the other splice site mutation，c648+1G A，was inherited from the father Both of the mutations were reported to be pathogenicConclusionThe compound heterozygous variants of the ALPL gene may be the cause of the malformation of the fetus Whole exonsequencing and Sanger sequencing can identify the cause of abnormal bone development and provide evidence for the couple toreproduceKey words:abnormal bone development;whole exon sequencing;ALPL;Sanger sequencing;mutation低磷酸酯酶症(hypophosphatasia，HPP)(OMIM146300、241500、241510)是一种由于编码组织非特异性碱性磷酸酶(tissue non-specific alkaline phos-phatase，TNSALP)的碱性磷酸酯酶基因 ALPL(alka-line phosphatase gene)变异导致 TNSALP 功能缺陷，进而引起以骨骼和(或)牙齿矿化不全、磷酸代谢紊乱、维生素 B6 依赖性癫痫发作以及肌无力等临床表现的一种罕见遗传性疾病1。该病以 TNSALP 活性低下或消失为特征，临床表现多样，轻型可仅表现为牙齿过早脱落、牙齿骨量减少、牙髓腔变大，而无骨骼异常表现，重型可出现严重骨骼异常、癫痫发作，多因继发严重感染、呼吸衰竭及高钙血症而引发死亡，发病率1 300 000 1 100 0002，3。遗传方式表现为常染色体显性或隐性。本研究通过对 1 例围生期致死型(新生儿型)HPP 患者及其家系进行产前诊断和遗传学分析，以期能更好地认识该病。1对象和方法1 1对象孕妇孕 2 次，第一胎因胎儿骨骼发育畸形终止妊娠，第二胎 B 超提示胎儿骨骼发育异常，B 超结果显示胎儿四肢长骨短小，均发育异常，呈“哑铃”状，提示胎儿骨骼先天发育异常。夫妻双方均身体健康，无遗传病家族史，非近亲结婚，否认孕期有不良暴露史。夫妻双方外周血核型分析未见异常，患者经过遗传咨询后均选择引产，并对胎儿样本进行全外显子测序(whole exon sequencing，WES)分析，明确胎儿发育异常原因。本研究通过空军军医大学第一055J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 4附属医院医学伦理委员会审批(KY20203041 1)。1 2方法12 1基因组 DNA 的提取在签署知情同意书之后，夫妻双方抽取外周血5 ml，并选取胎儿引产组织按照 Qiagen 试剂盒(QIAamp DNA Blood MiniKit)操作说明书进行基因组 DNA 提取、纯化。1 2 2全外显子组测序基因组 DNA 经过 Covaris破碎仪随机打断成长度为 180 280 bp 片段后，经过末端修复和磷酸化，两端连上接头后制备 DNA 文库，与 Agilent SureSelect Human ALL Exon V6 探针进行液相杂交，再使用带磁珠将外显子进行捕获下来后进行 PC 线性扩增。通过实时荧光定量方法对文库的有效浓度进行评估，文库质量合格后运用NovaSeq6000 平台进行测序，平均测序深度为100。12 3数据分析测序原始数据用 BWA(v0715)软件与人类基因组 hg19 进行比对，使用 GATK(v4)检测单核苷酸变异(SNV)和小的插入缺失变异(InDel)。所有涉及的遗传变异都分别通过 SNP 数据库 dbSNP，大规模人群全外显子数据库 ESP6500和 ExAC 以及千人基因组计划变异频率数据库1000G 过滤常见变异。所有罕见变异(MAF 0 01)都通过 PolyPhen2，SIFT，MutationTaster 等多个蛋白损伤预测工具。1 2 4Sanger 测序针对 ALPL 基因(OMIM171760)的 2 个变异碱基分别位于 10 号外显子和 6号外显子的下游剪接识别区，我们分别设计了 2 对引物进行扩增，并对 PC 产物进行测序分析，与之前的序列进行比对，排除掉二代测序中假阳性的位点。2结果2 1高通量测序及 Sanger 测序结果胎儿的 WES 检出的可能与骨骼发育异常相关的候选基因有:ALPL、HBD、ACAN、CISH、FCG2B、TTN、SAMD9、SMC1A、STEAP3。其中，胎儿包含有ALPL基 因 存 在 第 10 外 显 子 c 1120G A(pVal374Met)和第 6 号内含子 c 648+1G A 的两个位点的突变，为复合杂合突变，根据该基因变异的性质和对应疾病的遗传方式，我们选择了 ALPL 基因进行进一步分析。经过 Sanger 测序验证胎儿母亲携带 ALPL 基因 c 1120G A(p Val374Met)的杂合错义突变，胎儿父亲携带 c 648+1G A 的杂合突变(见图 1)。胎儿为 ALPL c 1120G A/c 648+1G A 复合杂合突变，父亲携带 ALPL c 648+1G A 突变，母亲携带 ALPL c 1120G A 突变图 1胎儿及父母双方的 Sanger 测序结果Figure 1Sanger sequencing results of the fetus and the parents155山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期2 2变异位点的致病性分析经检索 ALPL 基因变异数据库(http:/wwwsesep uvsq fr/03_hypo_mutations php)，这 2 个突变位点均为已有文献报道的变异位点。ALPL 基因第10 外显子 c 1120G A(p Val374Met)是一个错义突变，导致 ALPL 蛋白的 374 位氨基酸由缬氨酸变为甲硫氨酸，该突变遗传自母亲，为文献已报道过的致病突变4。ALPL 基因 6 号内含子 c 648+1G A的突变是一个剪接识别区的碱基变异，该位点的突变导致 ALPL 蛋白无法正常转录，引起碱性磷酸酶功能丧失，为文献已报道的致病突变5，该突变遗传自父亲。因此推测父母双方的 2 个变异位点遗传给两个胎儿，引起低磷酸酯酶症，可能是胎儿长骨发育畸形的原因。2 3遗传咨询经过遗传咨询后，孕妇选择引产。引产后对尸体进行检查，显示骨骼发育异常，四肢长骨均短小(见图 2)，提示预后不良，与产前超声诊断结果相符。图 2引产胎儿骨骼发育异常Figure 2The aborted fetus with skeletal dysplasias3讨论ALPL 是 HPP 的致病基因，位于常染色体1p361，包含 12 个外显子，编码 524 个氨基酸，跨度约为50 kb，mNA 长队为 2 580 bp，开放阅读框架 OF长度约为 1 575 bp。HPP 是一种罕见的遗传代谢性骨病，由于变异类型和变异位点的多样性导致磷酸酯酶活性有较大差异，导致不同患者的临床表现复杂多样，TNSALP 酶活性的高低与低磷酸脂酶血症症状的严重程度相关，严重程度具有高度异质性6，且具有相同的突变类型的患者也表现出不同的临床症状，由此可以推测其他如遗传因素、表观遗传学、调节基因或者环境原因可能也参与了表型的调控7。据文献报道，携带 c 1120G A 突变的患者有牙齿发育不良、乳牙过早脱落、身材矮小的临床表现4。Mornet 等5 报道过 c 648+1G A 在正常人群中未见携带，患者的该位点突变遗传自母亲，母亲表现为磷酸酯酶浓度偏低。根据患者出现症状的年龄和严重程度，HPP 分为围生期致死型、围生期良性型、婴幼儿型、儿童型、成人型和牙型低磷酸酶血症，症状表现为从宫内或围生期的死亡到单纯的牙齿脱落。其中围生期致死型为其中最为严重的一种类型，患者在胎儿期即可表现出严重的骨骼矿化障碍，存在发育迟缓、骨骼成角等骨骼发育异常，通常导致死胎或新生儿死亡。围生期致死型和婴儿型这两种严重型低磷酸酶血症多为常染色体隐性遗传为主，围生期良性型、儿童型、成人型和牙型这几种症状相对较轻的低磷酸酶血症通常为常染色体显性或隐性遗传8。国内外报道的患者中各型别所占比例有所差异，国内以儿童型和牙型为主，分别为 32 1%和 25 0%，其次为成人型、婴儿型和围生期型，临床医生对该病认识的不足可能是导致国内报道围生期型和婴儿型较少的原因9。通过对 HPP 相关文献回顾汇总和数据分析，中国 HPP 患者 ALPL 基因的突变主要集中在 5，10，12 号外显子，与国外热点突变集中在 9 号外显子的数据有所差异，可能为种族差异造成10。已报道的突变位点主要集中在编码区，其中错义突变为最常见的变异类型，其次为缺失突变，5 号外显子c 407G A 的突变为国人常见突变11。超声检查是产前诊断的重要手段，HPP 患儿的宫内超声图像显示存在类似成骨不全和骨骼发育不良表现，与本例患儿的产前 B 超结果相符。围生期 HPP 的超声特征是胎儿骨骼呈现弥漫性低矿化，伴有多处骨骼缺失，且无法看到骨骼的后部声影12。目前，临床上对于 HPP 的治疗尚无明显的特效药，辅助呼吸支持、高剂量维生素 B6 及利用饮食或药物控制血中的钙磷水平、镇痛及手术治疗等对症治疗可能有一定的缓解作用。酶替代治疗是至今为止有明确效果的最佳治疗方法，但国内尚未开展13。Whyte 等14 的研究表明，酶替代治疗对于婴幼儿致死型和围生期致死型 HPP 有较好的疗效，可以缓解佝偻病症状，改善呼吸功能，提高患者生存率。由于没有较好的治疗手段，产前咨询对于有255J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 4HPP 患者的家庭就显得尤为重要，通过全外显子测序的检测方法明确致病原因，对于疾病的发病原因、遗传方式、复发风险和产前评估很重要，可以为早期诊断和遗传咨询提供理论依据。本例家系中，患儿的遗传方式为复合杂合突变，是常染色体隐性遗传，变异位点分别来自于父母，这种遗传方式的患者临床表现较为严重，父母再生育患儿的概率为 25%。因此，患者家庭可以选择自然怀孕后适时采取产前诊断或者植入前胚胎诊断的方式获得健康胎儿。参考文献:1Whyte MP Hypophosphatasia:an overview for 2017J Bone，2017，102:15 25 2Fenn JS，Lorde N，Ward JM，et al HypophosphatasiaJ JClin Pathol，2021，74(10):635 640 3Mornet E HypophosphatasiaJ Metabolism，2018，82:142 155 4Liu H，Li J，Lei H，et al Genetic etiology and dental pulp celldeficiency of hypophosphatasiaJ J Dent es，2010，89(12):1373 1377 5Mornet E，Taillandier A，Peyramaure S，et al Identification offifteen novel mutations in the tissue-nonspecific alkaline phospha-tase(TNSALP)gene in European patients with severe hypophos-phatasiaJ Eur J Hum Genet，1998，6(4):308 314 6Del Angel G，eynders J，Negron C，et al Large-scale in vitrofunctional testing and novel variant scoring via protein modelingprovide insights into alkaline phosphatase activity in hypophos-phatasiaJ Hum Mutat，2020，41(7):1250 1262 7Mornet E，Simon-Bouy B Genetics of hypophosphatasiaJArch Pediatr，2004，11(5):444 448 8Fauvert D，Brun-Heath I，Lia-Baldini AS，et al Mild forms ofhypophosphatasia mostly result from dominant negative effect ofsevere alleles or from compound heterozygosity for severe andmoderate allelesJ BMC Med Genet，2009，10:51 9刘敏，赵耘，巩纯秀 低磷酸酶血症研究新进展J 中华儿科杂志，2019，57(11):899 903 10李丽丽，陈斌，闫福华 中国人低磷酸酶血症的基因突变特点及常见就诊原因 J 医学研究杂志，2016，45(8):74 79 11苏娜，朱岷，许珂，等5 例低磷酸酯酶症患儿临床及遗传学分析 J 临床儿科杂志，2020，38(4):289 293 12Milks KS，Hill LM，Hosseinzadeh K Evaluating skeletal dyspla-sias on prenatal ultrasound:an emphasis on predicting lethalityJ Pediatr adiol，2017，47(2):134 145 13赵耘，刘敏 低磷酸酶血症治疗新进展J 中华实用儿科临床杂志，2021，36(2):151 154 14Whyte MP，Simmons JH，Moseley S，et al Asfotase alfa forinfants and young children with hypophosphatasia:year outcomesof a single-arm，open-label，phase 2 extension trialJ LancetDiabetes Endocrinol，2019，7(2):93 105355山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期