维生素D3对酒精性肝损伤小鼠的保护作用.pdf
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1、目的 探讨维生素D3对酒精性肝损伤小鼠的保护作 用。方法40只小鼠随机分为4组:正常对照组(Co n t r o l 组)、单纯维生素D3组(Vit Ds组)、酒精组(Et OH组)及酒 精+维生素 D3 组(Et OH+Vit D3 组)。采用 Lieber-DeCa r l i 酒 精液体饲料喂养小鼠制备酒精性肝损伤模型,检测血清中丙 氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平 以及肝指数,HE染色观察肝脏病理形态学改变,q RT-P CR 检测肿瘤坏死因子a(TNF-a)、转化生长因子B(TGF*)、白 细胞介素(IL)$和IL-l p的mRNA相对表达水平,West
2、er n bl o t检测肝脏NF-kB p65和NF-KBp50蛋白表达。结果 与 Co n t r o l组比较,Et OH组小鼠血清ALT.AST活力、肝指数及 肝组织TNF-a.TGF-p.IL-6和IL-l p mRNA水平显著升高,Et OH组肝细胞索排列紊乱,肝小叶界限不清,肝细胞出现明 显炎性细胞浸润和脂肪空泡,NF-kB p65和NF-kB p50蛋白 表达水平显著升高;与Et OH组比较,Et OH+Vit D3组小鼠血 清ALT、AST活力、肝指数及肝组织TNF-a.TGF-pJL-6和 IL-l p mRNA水平显著降低,且病理染色结果显示肝细胞炎 性细胞浸润和脂肪空泡
3、数量减少,肝脏恢复正常细胞结构,同时NF-kB p65和NF-kB p50蛋白表达水平显著降低。结 论 维生素D3对酒精性肝损伤小鼠具有一定的保护作用,其机制可能与抑制NF-kB信号通路,降低机体炎症反应有 关。关键词 维生素D3;酒精性肝损伤;NF-kB信号通路;炎症 中图分类号R151.2文献标志码A 文章编号1000-1492(2023)05-0707-05 d o i:10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.001酒精性肝病(a l c o h o l ic l iv er d isea se,ALD)是由 于长期大量饮酒所致的肝脏疾病初期
4、通常表 现为脂肪肝,进而可发展成酒精性肝炎、酒精性肝纤 维化和酒精性肝硬化;严重酗酒时可诱发广泛肝细 胞坏死,甚至肝功能衰竭。ALD是我国常见的肝脏2022-12-08 接收基金项目:国家自然科学基金(编号=81402676);安徽省高等学校科 学研究项目(编号:2022AH040094)作者单位:安徽医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系,合肥230032作者简介:王惠惠,女,硕士研究生;胡纯秋,女,博士,副教授,责任作者,E-ma il:h u c h q iu 163.c o m疾病之一,严重危害人类健康。因其发病机制复杂,至今尚未发现有效的治疗药物。维生素D经典的 生物学作用是调节钙磷
5、稳态,维持骨骼健康。研 究显示,维生素D3具有抗炎、抗氧化等生物学作 用。动物研究发现,维生素D3对异烟腓联合利 福平所致小鼠肝损伤具有明显的保护作用。该课题 组前期研究发现,维生素D缺乏可加重酒精性肝 损伤。该研究旨在观察并探讨维生素D3对酒精性 肝损伤小鼠的保护作用及其可能的分子机制。1材料与方法1.1实验动物40只6周龄C57BL/6J雄性健康 小鼠,普通级,体质量(23.5 0.6)g,购自北京维通 利华实验动物技术有限公司。动物房温度20 25 弋,湿度(50 5)%,光照周期12 h/12 h昼夜交替。实验过程中给予小鼠人文关怀,灌胃、眼球取血等操 作均由技术熟练人员操作。实验方案
6、经安徽医科大 学实验动物伦理审查委员会审核通过(动物伦理编 号:17-0014)o1.2动物饲料 所有饲料(Lieber-DeCa r l i液体饲 料)购自南通特洛菲饲料科技有限公司。液体对照 饲料喂养(编号:TP 4030C),饲料供能比:碳水化合 物47%,蛋白质18%,脂肪35%;酒精液体饲料喂 养(编号:TP 4030B),饲料供能比:碳水化合物 19%,蛋白质18%,脂肪35%,酒精供能比为28%。1.3药物与试剂 维生素D3购自美国Ca y ma n公 司,95%药用级酒精购自南京化学试剂股份有限公 司,25(OH)D放射免疫试剂盒购自意大利Dia so r in 公司,肿瘤坏死
7、因子 a(t u mo r n ec r o sis f a c t o r-a,TNF-a)、转化生长因子 3(t r a n sf o r min g g r o w t h f a c t o r-p,TGF-0)、白细胞介素(in t er l eu k in,IL)-6 和 IL-10 引 物由美国In v it r o g en公司合成,q RT-P CR试剂盒购 自北京全式金生物技术有限公司,La min A/C NF-kB p65、NF-iB p50 抗购自英国 Abea m 公司,HRP 标记山羊抗兔Ig G二抗购自北京中杉金桥生物技术 有限公司。1.4方法708安徽医科大学
8、学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)1.4.1动物模型的建立与给药40只小鼠随机分 为4组:正常对照组(Co n t r o l组)、单纯维生素D3组(Vit Ds组)、酒精组(Et OH组)及酒精+维生素D3 组(Et OH+Vit D3 组),每组 10 只。Co n t r o l 组和 Vit D3组小鼠均采用液体对照饲料喂养,Et OH组和 Et OH+Vit D3组均使用酒精液体饲料喂养。为提高 酒精肝损伤造模效果,Et OH组和Et OH+Vit D3组采 用2周过渡喂养法(对照液体饲料与酒精液体饲料 混合
9、比例2:1、1:1、1:2各喂养4d),然后以酒精 液体饲料喂养,整个造模过程共计6周。喂养过程 中Vit D3组和Et OH+Vit D3组每天灌胃给予80 IU/只的维生素D3(用大豆油溶解)对小鼠进行灌胃,Co n t r o l组和Et OH组给予等量大豆油进行灌胃。末 次给药后小鼠禁食不禁水12 h,眼球取血分离血清,剖杀后取肝脏组织,-80弋保存备用。1.4.2血清25(OH)D含量检测 收集小鼠血清,采用放射免疫分析法检测小鼠血清25(OH)D水 平,具体步骤按照试剂盒要求操作。1.4.3 血清丙氨酸氨基转移酶(a l a n in e a min o t r a n sf er
10、 a se,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(a spa r t a t e a min o t r a n sf er a se,AST)水平测定 小鼠眼球取血后,室 温静置2 h,3 500 r/min离心15 min,收集上清液,使用全自动生化分析仪测定ALT.AST水平。1.4.4 肝脏组织病理形态观察 肝脏组织经4%多聚甲醛固定、脱水、包埋后,切成5 mm厚切片,HE 染色后,中性树脂封片,光学显微镜观察肝组织病理 改变并拍照。1.4.5 q RT-P CR实验 取30 mg小鼠肝脏组织,用 TRIzo l法提取RNA,测定RNA纯度并稀释至500 n g/皿,按照RT&q P
11、 CR Kit试剂盒说明书配置逆转 录反应体系后在逆转录P CR仪中进行反应,条件 为:42 C 15 min,85 C 5 s,4 龙冷却,生成 c DNA 后 配成相应体系上机扩增,条件为:94 C预变性30 s,94咒变性5 s,56咒退火30 s,72兀延伸30 s,45个 循环,37七降温30 s,4咒冷却保存。以18 S作为 内参,2Ac t 法计算 TNF-a,TGF-p,IL-6 和 IL-l p mRNA mRNA相对表达水平,基因引物序列见表1。1.4.6 West er n bl o t实验 取30 mg肝脏组织,加 入500 pu l蛋白提取液A匀浆后,4弋、2 000
12、 r/min 离心5 min,弃上清液,向沉淀中加入200|11蛋白提 取液B,涡旋震荡至无明显沉淀,4七、12 000 r/min 离心10 min,上清液即为核蛋白,并进行BCA蛋白 定量分析。将蛋白进行SDS-P AGE电泳,随后将蛋 白转至P VDF膜上,将膜用5%脱脂牛奶室温封闭表1各基因的引物序列基因名称引物序列(5-3)片段长度(bp)18 SF:GTAACCCGTTGAACCCCATTR:CCATCCAATCGGTAGTAGCG151TNF-aF:CCCTCCTGGCCAACGGCATGR:TCGGGGCAGCCTTGTCCCTr109TGF-pF:CGGGAAGCAGTGCC
13、CGAACCR:GGGGGTCAGCAGCCGGTTAC147IL-6F:AGACAAAGCCAGAGTCCTTCAGAGAR:GCCACTCCTTCTGTGACTCCAGC146IL-ipF:GCCTCGTGCTGTCGGACCCATATR:TCCITTGAGGCCCAAGGCCACA1431 h后,将膜分别放入一抗La min A/C(1:2 000)、NF-kB P65(1:1 000)、NF-kB p50(1:1 000)4 弋孵育过夜。用TBST洗膜3次,每次10 mino加 入HRP标记的山羊抗兔Ig G二抗(1:60 000)孵 育60 mino TBST洗膜3次,使用化学发光系
14、统曝光 条带。使用Ima g e J测量条带的灰度值。1.5统计学处理 采用SP SS 23.0统计软件进行 数据分析,所有实验数据采用力土 s表示,实验平行 重复3次,对符合正态分布的计量资料采用单因素 方差分析,两两组间比较采用SNK法,P 0.05示 差异有统计学意义。2 结果2.1 小鼠血清25(OH)D水平 与Co n t r o l组比 较,Vit Ds 组小鼠 25(OH)D 水平(73.57 2.22)n g/ml较高,差异有统计学意义(P 0.01);与 Et OH组比较,Et OH+Vit D3组小鼠25(OH)D水平 较高(79.12 3.12)n g/ml vs(51.
15、68 3.53)n g/ml,差异有统计学意义(F=21.30,P 0.01)。2.2维生素Ds对酒精性肝损伤小鼠肝指数的影 响 与Co n t r o l组比较,Et OH组小鼠肝指数升高(P 0.01);与Et OH组比较,Et OH+Vit D3组小鼠肝指 数降低(F=60.74,P 0.05)o 见表2。2.3维生素D3对酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST水平的影响 与Co n t r o l组比较,Et OH组小鼠 ALT、AST 水平升高(P 0.01,P 0.05);与 Et OH 组比较,Et OH+Vit D3组小鼠血清中ALT和AST水 平降低(Falt=20.50,Fas
16、t=5.96,均 P 0.05)。见表2。2.4维生素D3对酒精性肝损伤小鼠病理组织学 的影响Co n t r o l组和Vit D3组肝细胞索以中央静脉 为中心呈放射状排列,肝小叶结构清晰,肝细胞结构 正常,无炎性细胞浸润和脂肪变性;Et OH组肝细胞 索排列紊乱,肝小叶界限不清,肝细胞出现明显炎性安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)709表2维生素D3对小鼠肝指数及血清ALT、AST的影响(n=10,%$)组别肝指数()ALT(U/L)AST(U/L)Co n t r o l4.32 0.0531.221
17、.71140.9 10.38Et OH5.48 0.08*69.60 4.75*205.3 19.33*Vit D34.03 0.0630.75 1.92141.5 6.39Et OH+Vit D34.57 0.08#58.70 6.05*162.1 6.84#与 Co n t r o l 组比较:*P 0.05,*P 0.01;与 Et OH 组比较:#P0.05细胞浸润和脂肪空泡;Et OH+Vit D3组肝细胞炎性 细胞浸润和脂肪空泡数量减少,肝脏恢复正常细胞 结构。见图l o图1小鼠肝脏病理组织学HE染色X200A:Co n t r o l 组;B:Et OH 组;C:Vit D3 组
18、;D:Et OH+Vit D3 组1.1-if 曲芒 m.1扛f.%|m I.b*f|F:存严,J常 点肿酥轉;应?护加:A,-.JK:*J g U t Bi!6 mRNA的表 达升高(P 0.01,P0.01,P 0.05);维生素 D3 可 降低酒精性肝损伤小鼠肝组织中TNF-a.TGF-p和 IL-6 mRNA 水平(FTNF.a=25.71,FTGF.p=15.03,閱=9.524;P 0.01,P 0.05,P 0.05)。Et OH 组小 鼠肝组织中IL-l p mRNA水平有所升高,维生素D3 补充对其表达有一定程度降低,但差异无统计学意 义。见图2。2.6维生素D3对酒精性肝损
19、伤小鼠NF-kB炎症 信号通路的影响 与Co n t r o l组比较,Et OH组小鼠 肝脏NF-kB p65和NF-kB p50蛋白表达水平增加(P 0.05,P 0.01);与 Et OH 组比较,Et OH+Vit D3组下调了以上两种蛋白表达水平(戸屠加何=5.54,FNF.KBp50=&26,均 P 0.05)。见图 3。3讨论酗酒是一个全球性健康问题,尽管目前对ALD 的病理和发病机制研究取得重大进展,但ALD的许 多特征仍未确定,需要进一步研究。目前,应用最广 泛的酒精性肝损伤模型是连续喂养含酒精的 Lieber-DeCa r l i液体饲料4 6周。本研究采用 Lie
20、ber-DeCa r l i酒精液体饲料构建小鼠酒精性肝损 伤模型,结果显示,与Co n t r o l组比较,Et OH组小鼠 肝指数、血清ALT、AST及肝脏TNF-a、TGF-|3和 IL-6 mRNA水平显著升高,且病理学结果发现肝脏 出现明显的炎性细胞浸润和脂肪空泡。以上结果表 明,本研究成功构建了小鼠酒精性肝损伤模型。肝脏慢性炎症在ALD的形成中起重要作 用7。在动物模型和慢性饮酒的人肝活检标本中 检测发现,TLR4介导的NF-kB激活诱导的促炎细 胞因子TNF-a和IL-6的产生均增加。Li et a l 研究表明,酒精肝患者血清中IL-l p.TNF-a和IL-6 等炎性细胞因
21、子明显升高。Amba d e et a l9研究发 现ALD小鼠IL-l p和IL-6水平明显升高。课题组 前期研究问也发现酒精暴露导致小鼠肝脏IL-6、IL-8JL-1|3 mRNA升高。研究证明,维生素D 具有抗炎活性。本研究结果显示,Et OH组TNF-a,TGF-pJL-6 mRNA水平显著高于Co n t r o l组,维生素 D3明显逆转了酒精性肝损伤小鼠肝脏TNF-a,TGF-P.IL-6 mRNA水平的升高。另外,肝脏HE染色结 果也表明维生素Ds可显著改善酒精性肝损伤小鼠图2维生素D3对酒精性肝损伤小鼠肝脏炎性细胞因子基因表达的影响a:Co n t r o l;b:Et OH
22、 组;c:Vit D3 组;d:Et OH+Vit D3 组;与 Co n t r o l 组比较:*P 0.05,*P 0.01;与 Et OH 组比较:#P 0.050.01710安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)NF-kB p65a b c dNF-kB p50La min A/C图3维生素Ds对酒精性肝损伤小鼠肝脏NFkB p65和 NF-kB p50蛋白表达的影响a:Co n t r o l组;b:Et OH 组;c:Vit D3 组;d:Et OH+Vit D3 组;与 Co m t r o l
23、 组比较:*P 0.05,*P 0.01;与 Et OH 组比较:#P 0.05肝脏炎症反应。以上结果表明,维生素Ds改善酒精 性肝损伤与降低酒精诱发的炎症反应相关。众所周知,核因子NF-kB是炎症反应的重要调 节因子M。在大多数静息细胞中,NF-kB蛋白通过 与抑制蛋白IkB结合,在细胞质中保持不活跃。当机体受到促炎信号等的刺激,NF-kB会释放至细 胞核进行转录激活,NF-kB的激活可以进一步增加 TNF-a JL-l pJL-6等炎性细胞因产生和释放。为了探究维生素D3是否通过抑制NF-kB通路,从 而降低炎症反应减轻小鼠酒精性肝损伤,本研究测 定酒精性肝损伤小鼠肝脏NF-kB p65和
24、NF-kB p50 的蛋白表达。结果提示,维生素Ds逆转了酒精诱导 的NF-kB p65和NF-kB p50的蛋白表达的升高。综上所述,维生素D3对酒精性肝损伤小鼠具有 一定的保护效应,其机制可能与调控NF-kB信号通 路,降低机体炎症反应有关。本研究为ALD的预防 和治疗提供一定的研究思路。参考文献1 Seit z H K,Ba t a l l er R,Co r t ez-P iiit o H,et a l.Al c o h o l ic l iv er d isea se J.Na t Rev Dis P r imer s,2018,4(1):16.2 Sa ssi F,Ta mo n
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- 维生素 D_ 283 29 酒精性 损伤 小鼠 保护 作用
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