新疆和田地区1株小鹅瘟病毒...离鉴定及VP基因的克隆分析_刘建华.pdf

2023(15):84-89兽医科学收稿日期:2022-06-02;修回日期:2023-04-23基金项目:新疆维吾尔自治区重点研发计划项目(2020B01004-2)作者简介:刘建华(1972),男,副教授,博士,硕士生导师,研究方向为动物传染病的诊断与防治,.DOI:10.13881/ki.hljxmsy.2022.06.0016 新疆和田地区 1 株小鹅瘟病毒分离鉴定及VP 基因的克隆分析 刘建华1,孙文程1,胡 月1,吴桂灵1,马彩红1,撒瑞雪1,阿力米古丽乌米尔哈孜2(1.新疆农业大学 动物医学学院,乌鲁木齐 830052;2.新疆塔城地区动物疾病控制与诊断中心,新疆 塔城 834700)中图分类号:S852.65+9.2 文献标识码:A 文章编号:1004-7034(2023)15-0084-06摘 要:为了找到新疆和田地区某鹅场雏鹅大量死亡的原因,试验采用 PCR 方法及琼脂扩散试验检测了病死鹅组织,将阳性病料经无菌处理后接种无免番鸭胚,盲传 3 代,进行病毒分离;设计 GPV VP基因特异性引物对其尿囊液进行扩增,构建重组质粒和测序,分析 VP 基因核苷酸序列同源性、亲缘关系,以及 VP 蛋白的抗原表位。结果表明:PCR 检测及琼脂扩散试验结果均为阳性,其他常见病毒PCR 检测结果为阴性;接种病料组织研磨悬液后无免番鸭胚出现典型症状,最终分离到一株 GPV 分离株,将其命名为 GPV/GOOSE/XJHT/2020。该毒株 VP 基因核苷酸序列与 GenBank 中不同国家地区毒株的相似性均在 95.0%以上;与强毒株 DY16、RC16 核苷酸序列的相似性均为 99.3%,亲缘性高且处在同一分支;与疫苗株 SYG61v、弱毒株 GPV-98E 的相似性均为 95.0%,亲缘性较低且处在不同分支。VP 蛋白具多个潜在的抗原表位。说明该鹅场存在 GPV 感染,且与国内毒株亲缘关系较近。关键词:小鹅瘟病毒;分离;鉴定;VP 基因;进化分析;抗原表位预测 小鹅瘟(goose plague)是由鹅细小病毒(goose Parvovirus,GPV)引起的雏鹅的一种急性或亚急性败血症,以渗出性肠炎为主要病理变化,对 420 日龄雏鹅造成的损害较大1,传播速度快,死亡率高,可经卵垂直传播。亚急性病鹅出现典型的“香肠”样肠道栓塞,小肠出现典型的纤维素性坏死性肠炎,脱落的肠黏膜与凝固的纤维素性渗出物形成“肠芯”2-3。小鹅瘟广泛分布于我国福建、江苏、黑龙江、吉林、广东、四川和山东等省份,对我国水禽业发展造成了极大的影响4。GPV 是由我国学者方定一等5于 1956 年首次发现的,于 1961 年用鹅胚分离到 GPV。GPV 属于细小 病 毒 科(Parvoviridae)依 赖 细 小 病 毒 属(Dependoparvovirus),为单链线性 DNA 病毒,呈二十面体对称,无囊膜,直径在 2025 nm 之间6。GPV基因组全长为 5.0 5.1 kb,包含两个开放阅读框(open reading frame,ORF),分别编码非结构蛋白(NS)和结构蛋白(VP)3。NS 基因长度为 1 884 bp,编码 627 个氨基酸,分子量约为 83 ku。NS 基因包括NS1 和 NS2 基因,其中 NS1 基因编码蛋白主要参与病毒复制过程中的调节,具有 SF3 解旋酶超家族的DNA 病毒的解旋酶功能域,参与基因组复制、DNA 解旋酶或缺口酶的表达调节、基因组复制过程调节和细胞病变诱导。最新研究结果表明,NS1 基因编码蛋白会引发细胞凋亡。VP 基因包括 VP1、VP2 和 VP3 基因,全长 2 199 bp,编码 733 个氨基酸。VP1、VP2 和VP3 基因为依次包含的重叠关系,起始位点不同,但又有共同的终止位点,共用一个终止子 TAA。VP3蛋白为主要衣壳蛋白,由 534 个氨基酸组成,具有高度保守性,分子量约为 57 ku,约占总蛋白的 80%,此外 VP3 蛋白位于病毒表面,具有抗原表位,能诱发机体产生明显的抗体反应7-8。Yan Y.Q.等9研究发现,VP3 蛋白有良好的抗原表位,为亚单位疫苗及多联疫苗的构建提供了思路。GPV 导致的雏鹅死亡对和田地区鹅产业发展构成巨大威胁。2020 年新疆和田地区某鹅场雏鹅大量死亡,部分雏鹅出现典型的肠道“栓子”,疑似 GPV感染。本试验从新疆和田地区某鹅场采集病死鹅的内脏组织,参照小鹅瘟诊断技术(NY/T 5602018)10进行 PCR 扩增及琼脂扩散试验,用阳性病482023(15):84-89兽医科学料接种无免番鸭胚进行传代,最终分离到 1 株 GPV毒株,克隆其 VP 基因并进行遗传进化分析及抗原表位预测,以期为新疆和田地区鹅场小鹅瘟的诊断提供参考,也为新疆和田地区鹅场 GPV 流行规律提供基础数据。1 材料1.1 样本病死鹅肝脏、肾脏、肠道等组织,均采自新疆和田地区某鹅场 1 号、5 号、6 号鹅舍。1.2 试验动物7 日龄无免番鸭胚,每 15 d 购买 1 次,每次购买15 枚,均购自乌鲁木齐市新营养鸭场。1.3 主要试剂及仪器OMEGA 小提质粒 DNA 试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒,均购自广州飞扬生物工程有限公司;大肠杆菌 Trans5 感受态细胞,购自北京全式金生物科技有限公司;2Taq PCR MasterMix,购自天根生化科技(北京)有限公司;pMD-19T 载体、PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time),均购自宝生物工程(大连)有限公司;小鹅瘟阳性血清,购自国家兽医微生物菌(毒)种保藏中心。组织匀浆器,购自浙江美壁仪器有限公司;孵化箱,购自山东梦科机械设备有限公司。2 方法2.1 病料的 PCR 检测参照小鹅瘟诊断技术(NY/T 5602018)10中待检样品 DNA 提取方法提取第 3 代鸭胚尿囊液中的 DNA;采用 TRIzol 法提取第 3 代鸭胚尿囊液中的总 RNA,应用 PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)将 RNA 反转录成 cDNA;以 DNA 和 cDNA为模板进行 PCR 扩增。参照参考文献10-11中的方法利用 Primer Premier 5.0 软件设计坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)、禽 呼 肠 孤 病 毒(Avian reovirus,ARV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、鹅星状病毒(goose Astrovirus,GAstV)引物,引物信息见表 1,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。表 1 引物信息Table 1 Primer information引物引物序列预扩增片段大小/bp退火温度/GPVF 5-GGAGTGGGTAATGCCTCG-3R 5-GGTCCTGGCAGCCAATTG-377650TMUVF 5-GCCACGGAATTAGCGGTTGT-3R 5-TAATCCTCCATCTCAGCGGTGTAG-340156ARVF 5-TGAGACGCCTGACTACGATT-3R 5-ATGCTTGGAGTGAGACGACT-338057NDVF 5-GCTCTTCTATCACAGAACCGACTT-3R 5-GCTGACCATCCAGGCACTTT-330259GAstVF 5-TCCACCGAACACGCCACTA-3R 5-AGCCGATTCCTGAGTTCCGTT-351255GPV VP1F 5-GAAAATGAACAATAAAGATGACTC-3R 5-GGCATTACCCACTCCATC-369353GPV VP3-1F 5-GTACAAGACGGAGGAGCC-3R 5-AGTCCTGTGAATGAGCGAAC-374558GPV VP3-2F 5-AAGTTCCTTTCCAYAG-3R 5-AATGTCTAAAACTCAATCTATAGAC-31 04148 PCR 扩增体系参照 2Taq PCR MasterMix 说明书中 25 L 体系。PCR 扩增程序:94 预变性5 min;94 变性 30 s,以表 1 中退火温度进行退火30 s,72 延伸 30 s,共 35 个循环;72 再延伸10 min。2.2 琼脂扩散试验参照小鹅瘟诊断技术(NY/T 5602018)10中的方法进行检测。2.3 病毒的分离传代使用组织匀浆器研磨病死鹅肝脏、肾脏、肠道等组织,反复冻融 3 次后加入含青霉素和链霉素的无菌生理盐水,37 孵育 30 min;8 000 r/min 离 心10 min;取上清液,用滤膜过滤后经尿囊腔接种 9 11 日龄鸭胚,0.2 mL/胚,置温度为 37.8、湿度为58%的孵化箱中孵化 5 d;无菌收集尿囊液,并观察鸭胚变化情况;用收集的尿囊液继续接种 911 日龄鸭582023(15):84-89兽医科学胚,盲传 3 代,同时观察鸭胚变化情况。以未接种病料的鸭胚作为正常对照。2.4 GPV VP 基因的 PCR 扩增、克隆与鉴定根据 GenBank 中 GPV AHAU41 毒株基因(登录号为 MT646163.1)序列设计 GPV VP 基因的克隆引物(见表 1),将 VP1 基因分成三段测序,其中引物VP1、VP3-1、VP3-2 经拼接后构成完整的 VP1 基因。参照小鹅瘟诊断技术(NY/T 560-2018)10中待检样品 DNA 提取方法提取第 3 代鸭胚尿囊液DNA,以其为模板进行 PCR 扩增,扩增体系和程序同2.1。将扩增产物与 pMD-19T 载体连接构建克隆载体,送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序拼接。2.5 GPV VP 基因的同源性分析及遗传进化树的构建应用 DNAStar 中的 MegAlign 软件将 VP 基因拼接后的序列与 GenBank 中的 15 株参考毒株序列(见表 2)进行同源性分析,并应用 MEGA 7.0 软件采用NJ 法构建遗传进化树。表 2 参考毒株信息Table 2 Information of the reference strains毒株GenBank 登录号分离地分离年份宿主特性SYG61vKC996729.1中国江苏省2015鹅疫苗株GPV-98EKT598506.1中国黑龙江省1998鹅弱毒株FJKY511292.1中国福建省2018鹅分离株SHJF333590.1中国上海市2009天鹅 分离株HB2019MT010852.1中国河北省2019鹅分离株SQ0412MF942876.1中国山东省2017鹅分离株DY16MH209633.1中国江苏省2016鹅分离株RC16KY475562.1中国重庆市2016鹅分离株RC70MH717785.1中国重庆市2017鹅分离株GDFshEU088103.1中国广东省2007鹅分离株AHAU41MT646163.1中国安徽省2019鸭分离株GDQY1802MN549533.1中国广东省2018/2019 鹧鸪 分离株GERKU684472.1波兰圣十字省2015鸭分离株DB3EU088102.1中国东北地区2017鹅分离株EKC184133.1中国安徽省2012鹅分离株2.6 VP 蛋白的抗原表位分析应用 DNAStar 中 Protean 软件进行 VP 蛋白的抗原表位分析。3 结果与分析3.1 病料的 PCR 检测无菌收取第 3 代尿囊液,以 2.1 中提取的总DNA 及 cDNA 为模板,进行 GPV、TUMV、ARV、NDV和 GAstV 的 PCR 鉴定,结果 GPV 为阳性;而 TUMV、NDV、ARV 和 GAstV 均为阴性(见图 1)。将检测到的 GPV 毒株命名为 GPV/GOOSE/XJHT/2020。M.DL-2 000 Marker;1.NDV;2.GPV;3.TMUV;4.GAstV;5.ARV;6.空白对照。图 1 待检样品的 PCR 检测结果Fig.1 PCR determination results of the samples to be tested3.2 琼脂扩散试验结果见图 2。1.阳性对照;2.阴性对照;3.待检样品。图 2 琼脂扩散试验结果Fig.2 Results of agar diffusion test由图 2 可知,待检样品与小鹅瘟阳性血清间出现清晰沉淀线。3.3 病毒的分离传代接种病料的鸭胚均表现为绒尿膜增厚,全身皮肤充血,鸭胚发育停滞,胚体小,全身有散在出血点;正常对照组鸭胚无异常,发育正常。见图 3。图 3 接种病料后鸭胚变化情况Fig.3 Changes of duck embryos after inoculation of diseased material3.4 GPV VP 基因的 PCR 扩增、克隆与鉴定以第 3 代鸭胚尿囊液提取的 DNA 为模板,应用GPV VP1、GPV VP3-1 与 GPV VP3-2 的上下游引物进行 PCR 扩增,将胶回收产物与 pMD-19T 载体连接,转化扩增后提取重组质粒进行 PCR 验证,结果(见图 4)得到 1 041,745,693 bp 三个片段,与预期结682023(15):84-89兽医科学果相符。将重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序拼接。图 4 重组质粒的 PCR 验证结果Fig.4 PCR validation results of the recombinant plasmid3.5 GPV VP 基因的同源性分析及遗传进化树的构建测序拼接结果表明,扩增的 VP1 基因大小约为2 199 bp,编码 732 个氨基酸,未发现碱基缺失和插入。同源性分析结果(见图 5)表明:分离株 GPV/GOOSE/XJHT/2020 与 GenBank 中已发布的 15 株参考毒株的相似性为 95.0%99.3%。其中与疫苗株SYG61v、鸭胚致弱毒株 GPV-98E 的相似性均较低,为95.0%;与 RC16 和 DY16 的相似性均最高,为 99.3%,且与多株高致病性毒株的相似性在 98.0%以上。.本试验分离毒株。图 5 GPV/Goose/XJHT/2020 毒株相似性分析结果Fig.5 Similarity analysis results of GPV/Goose/XJHT/2020 strain 遗传进化树分析结果(见图 6)表明:GPV VP 基因可分为两个亚群,第一个亚群均为高致病性分离株,本试验分离株 GPV/GOOSE/XJHT/2020 在这一亚群中;第二亚群多为弱毒株与疫苗株。本试验分离株 GPV/GOOSE/XJHT/2020 与重庆分离株 RC16 及RC70 的亲缘关系较近,与弱毒株 GPV-98E 及疫苗株 SYG61v 亲缘关系较远。3.6 VP 蛋白的抗原表位分析分离株 GPV/GOOSE/XJHT/2020 的 VP 蛋白分子量为 87 ku,理论等电点为 5.98。氨基酸序列长度为 733 aa,其中带电荷的氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸)占比为 27.5%,碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸)占比为 9.15%,酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)占比为 10.79%,疏水性氨基酸(丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸)占比为 29.51%,亲水性氨基酸(天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)占比为 31.15%。VP 蛋白亲水性较高的区段在第 7533 位氨基酸之间;抗原指数分析结果表明,在第 22229,448492 位氨基酸之间具有明显的抗原性;表面可及性区域位于782023(15):84-89兽医科学 注:为本试验分离毒株。图 6 分离株 GPV/GOOSE/XJHT/2020 的遗传进化分析结果Fig.6 Results of genetic evolutionary analysis of GPV/GOOSE/XJHT/2020 strain图 7 分离株 GPV/GOOSE/XJHT/2020 VP 蛋白抗原表位分析结果Fig.7 Results of antigenic epitope analysis of VP protein of GPV/GOOSE/XJHT/2020 strain第 2951,683693 位氨基酸之间;B 淋巴细胞表位分析结果表明,第 22229,448492 位氨基酸之间易形成潜在的抗原表位。抗原表位分析结果见图 7。4 讨论与结论GPV/GOOSE/XJHT/2020 毒株是本试验以无免番鸭胚传代方式从新疆和田地区鹅场病死雏鹅组织中分离得到的 1 株 GPV 分离株,通过克隆分离株GPV/GOOSE/XJHT/2020 的 VP 基因及序列分析可知,该分离株 VP 基因核苷酸序列与 GenBank 中毒株之间的相似性达到 95.0%及以上,该基因的高度保守性也证实 GPV 只有一个血清型,这可能也是目前世界各国流行的 GPV 毒株的抗原性基本一致的原因之一4,8。VP 蛋白是 GPV 的主要免疫保护性抗原。卞国志等12对鹅、天鹅、番鸭和鹧鸪等不同品种水禽来源的 GPV VP 基因核苷酸序列进行比对分析发现,新疆和田地区 GPV VP 基因核苷酸序列均与鹅源GPV 同源性较高、亲缘关系更近,而与鸭源 GPV 相似性也达到 98.9%,因此应警惕病毒变异导致鸭感染 GPV。本试验获得的分离株 GPV/GOOSE/XJHT/2020 与国内流行株的同源性高于国外流行株,且与国内疫苗株 SYG61v 的亲缘关系较远,处于不同分支中,同源性相对较低,与国内分离的高致病性毒株RC16 和 RC70 的亲缘关系较近,这也解释了为何该地区虽然按照免疫程序接种了小鹅瘟疫苗,但仍出现GPV 感染的情况。2020 年,新疆和田地区从国内其他地区大量引进种蛋,但因当地技术相对落后,缺乏完善的检疫措施,在 2020 年 9 月份某鹅场的 3 个鹅舍出现大规模雏鹅死亡情况,对采集的病死雏鹅进行剖检,可见心脏、肝脏出现明显的出血点,小肠膨大、内容物形成“肠芯”,初步判定为 GPV 感染。用病死雏鹅组织的研磨悬液接种无免番鸭胚进行病毒分离,无菌收集第 3 代尿囊液进行 PCR 鉴定,对 PCR 产物进行测序分析确诊为GPV 感染。GPV 感染是造成该鹅场雏鹅发生死亡的重要原因,且未发现与其他病毒混合感染的情况,本试验结果为该鹅场发病雏鹅的治疗提供了实验室诊断依882023(15):84-89兽医科学据,也为新疆地区采用 PCR 方法检测 GPV 提供了参考。同时本试验完成了对 GPV/GOOSE/XJHT/2020株 VP 基因的测序,为后续 VP 蛋白结构预测、免疫原性、抗原表位预测及亚单位疫苗的构建提供了依据。参考文献:1 黄冠雄.20152016 年广东省小鹅瘟病毒分子流行病学调查D.广州:仲恺农业工程学院,2017.2 陈溥言.兽医传染病学M.北京:中国农业出版社,2006.3 陈雪明,张树梅,林委卫,等.基于昆虫细胞表达的鹅细小病毒VP3 蛋白的 VP3-ELISA 诊断方法的建立J.中国兽医科学,2019,49(9):1112-1118.4 NIU Y,ZHAO L,LIU B,et al.Comparative genetic analysis and pathological characteristics of goose Parvovirus isolated in Heilongjiang,ChinaJ.Virol J,2018,15(1):247-248.5 方定一,徐 为燕.兽医 病毒学 M.北 京:中 国农 业出版社,1984.6 李桂霞,刘胜旺,孔宪刚,等.鹅细小病毒 HG5/82 株的分离鉴定及生物学特性的研究 J.中国预防兽医学报,2005(3):196-201.7 鹿钟文.小鹅瘟病毒 VP3 基因的克隆表达及抗小鹅瘟病毒单克隆抗体的研制D.扬州:扬州大学,2012.8 王辉,王秀云,焦绪娜,等.新型鹅细小病毒研究进展J.中国动物传染病学报,2020,28(2):115-118.9 YAN Y Q,JIN L B,WANG Y,et al.Goose Parvovirus and the protein NS1 induce apoptosis through the AIF-mitochondrial pathway in goose embryo fibroblastsJ.Res Vet Sci,2021,137:68-76.10 中华人民共和国农业农村部.小鹅瘟诊断技术:NY/T 5602018S.北京:中国农业标准出版社,2018.11 CHEN Z,LI C,LI G,et al.Rapid diagnosis of goose viral infections by multiplex PCR J.J Virol Methods,2013,191(2):101-105.12 卞国志,马海彬,罗梦萍,等.新型鹅细小病毒研究进展J.中国动物传染病学报,2019,27(4):102-107.Isolation and identification of a strain of goose Parvovirus and cloning analysis of VP gene in Hotan area,Xinjiang Uygur Autonomous RegionLIU Jianhua1,SUN Wencheng1,HU Yue1,WU Guiling1,MA Caihong1,SA Ruixue1,Alimgul Wumirhaz2(1.College of Veterinary Medicine,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China;2.Xinjiang Uygur Autonomous Region Tacheng City Animal Disease Control and Diagnosis Center,Tacheng 834700,China)Abstract:In order to find the cause of a large number of deaths of geese in a goose farm in Hotan area,Xinjiang Uygur Autonomous Region,the experiment used PCR detection method and agar diffusion test to detect the tissues of the diseased and dead geese in the goose farm.After aseptic treatment,the positive disease materials were inoculated into non-vaccination Muscovy duck embryos,which was blindly passed on for three generations,and the virus was isolated.Goose Parvovirus(GPV)VP gene-specific primers were designed for the amplification from its allantoic fluid,and the cloning vector was constructed and sequenced.The nucleotide sequence homology and genetic relationship of VP gene were analyzed,and the epitopes of VP protein were analyzed.The results showed that the PCR test and agar diffusion test were positive,and the PCR results of other common viruses were negative.After inoculation of diseased tissue grinding suspension,non-vaccination Muscovy duck embryos showed typical symptoms,and finally a GPV strain was isolated and named GPV/Goose/XJHT/2020.The VP gene sequence of this strain had more than 95.0%homology with different national and regional strains in GenBank.The nucleotide sequence homology between this strain and the virulent strains DY16 and RC16 were both 99.3%and the genetic relationship was high and they were in the same branch.Its homology with the vaccine strain SYG61v and attenuated strain GPV-98E was 95.0%,and the genetic relationship was low and they were in different branches.VP protein had multiple potential epitopes.The results indicated that GPV infection existed in the goose farm and was genetically related to the domestic strains.Keywords:goose Parvovirus;isolation;identification;VP gene;evolutionary analysis;antigenic epitope prediction(011)(上接第 83 页)Analysis of the research development trend of sheep mastitisPEI Wangsheng1,MA Youji2(1.Huining County Animal Husbandry and Veterinary Technical Service Center,Huining 730700,China;2.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)Abstract:In order to facilitate researchers to fully understand and analyze the research hotspots and development trends of sheep mastitis,in this study,based on 886 articles on sheep mastitis retrieved from 2000 to 2019 in the Web of Science database,VOSviewer software was used to visually analyze the number of publications,citations,country of publication,research institutions,journals,research authors,article titles and keywords,and draw relevant graphs.The results showed that from 2000 to 2019,the number of publications related to sheep mastitis accounted for a relatively small proportion of the total number of publications in the field of sheep research,accounting for 1.06%.And in 2004,2008,2012,2014,2016 and 2017,there was a downward trend compared with the previous year,but the proportion showed an overall upward trend with the increase of the year;the number of citations increased significantly with the increase of the year.The research of sheep mastitis was mainly concentrated in Italy,the United States,Spain and other western countries,with universities as the main research institutions.Currently,the research hotspots of sheep mastitis mainly focused on the detection of subclinical mastitis and its effects on lactation performance and immune function.The results suggested that the main directions of research in the field of sheep mastitis in the future might focus on the treatment of sheep mastitis,pathogenic microorganism research,immune mechanism and resistance genetic selection.Keywords:sheep;mastitis;VOSviewer software;graph;molecular biology(011)98