消化系统类器官研究进展_刘鸿渊.pdf
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1、类器官是一种近年来新发展的细胞三维培养系统。类器官与真实器官的三维结构相似,并具有自我更新和再现组织来源等特点,从而能够更好地模拟真实器官的功能。类器官为研究器官发生、再生、疾病发病机制以及药物筛选提供了一个崭新的研究和应用平台。消化系统在人体内发挥着重要功能,目前已成功建立多种消化器官的类器官模型。本文就近年来味蕾、食管、胃、肝和小肠类器官的研究进展及相关应用进行综述,并对这几种类器官的应用前景进行展望。关键词:类器官;消化系统;疾病模型;药物筛选;再生医学 Advances in organoids of the digestive system LIU Hongyuan1#,WANG R
2、uofan1#,LI Xulong1,WU Zhengyang1,SUN Jinli2,LU Weiyi2,WANG Xianli2*1 School of Medicine,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200025,China 2 School of Public Health,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200025,China Abstract:Organoid is a newly developed cellular there-dimensional culture system i
3、n recent years.Organoids have a three-dimensional structure,which is similar to that of the real organs.Together with the characteristics of self-renewal and reproduction of tissue origin,organoids can better simulate the function of real organs.Organoids provide a new platform for the study of orga
4、nogenesis,regeneration,disease pathogenesis,and drug screening.The digestive system 综 述 刘鸿渊 等/消化系统类器官研究进展 :010-64807509: 1333 is an essential part of the human body and performs important functions.To date,organoid models of various digestive organs have been successfully established.This review sum
5、marizes the latest research progress of organoids of taste buds,esophagi,stomachs,livers and intestines,and prospects future application of organoids.Keywords:organoid;digestive system;disease model;drug screening;regenerative medicine 类器官是一种由多能干细胞(pluripotent stem cell,PSC)或组织成体干细胞(adult stem cell,
6、ASC)发育而来,并与体内器官具有相似结构和功能的复杂的三维结构1。类器官在形成过程中能够模拟真实器官发育的两个关键事件:细胞分序(cell sorting out)与空间特异性的谱系分化(spatially restricted lineage commitment)2,因此类器官含有不同的细胞分化类型,从而能够更好地模拟真实器官的功能。消化系统在人体内参与营养物质吸收、代谢、排泄等重要生理功能。以小鼠为代表的动物模型曾被普遍认为是消化系统良好的研究模型,但这类模型与人类的消化系统在结构和功能上的显著差异,限制了这类模型的临床转化能力。自 Clevers 实验室成功建立首个小肠类器官3以来,
7、类器官技术获得了长足的发展,多名学者在小肠类器官培养方法的基础上,陆续建立了其他消化器官的类器官。相较于动物模型,消化器官的类器官能够更为准确地模拟人体器官的发生、发育以及疾病的发展过程3,因此具有广阔的研究和应用价值。目前,体外获得类器官的方法有 2 种,一种是直接使用 ASC 进行 3D 培养,另外一种是诱导 PSC 分化为对应的器官干/祖细胞再进行培养。ASC 来源广泛,可以从患病组织中获取并培 养 成 患 者 来 源 的 类 器 官(patient-derived organoid,PDO)。PDO 具有与患者组织相似的遗传特征,在消化系统药物筛选和精准个性化治疗等领域具有巨大的应用潜
8、力。此外,PDO 也为肠道囊性纤维化4等罕见疾病解决了有效研究模型缺乏的难题。PSC 可以分为胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)。PSC 来源的消化道类器官模拟了器官发育的原始过程,其结构分化更接近于胎儿阶段的组织。这一特性有助于研究新生儿消化道系统疾病,例如利用类器官的微生物感染模型研究该类疾病的发病机制及药物筛选。本文在 2016 年 Hans Clevers 对消化系统类器官进行系统总结5的基础上,就最近几年味蕾、食管、胃、肝和小肠的 ASC 或 PSC 来源的类器官的研究进
9、展进行了回顾,并讨论了这几种消化器官的类器官在疾病建模、药物筛选和再生医学等领域的应用前景和挑战。1 味蕾类器官 1.1 味蕾类器官的建立 味蕾是位于口腔上皮的感觉器官,包含 I 型神经胶质支持细胞、感受甜苦和鲜味的型细胞以及感受酸味的型细胞等味觉受体细胞6。2014 年,Ren 等7首先利用单个 Lgr5+味觉干细胞生成了味蕾类器官,该类器官含有感受味觉刺激的成熟的味觉细胞。目前味蕾类器官主要使用来自舌环状乳头组织的 Lgr5+味觉干细胞,通过Matrigel 基质胶包埋的方式体外培养获得8。最近,Adpaikar 等9提出了一种悬浮培养味蕾类器官的方法。该方法去除了传统的细胞外基质支架,悬
10、浮培养的类器官能够逆转味蕾类器官头端与基底端的极性,从而增强了味觉细胞从外部环 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1334 境获得味觉剂的能力。在味蕾类器官生长和分化的过程中,Notch、Wnt、音猬因子(sonic hedgehog,SHH)、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)等信号通路发挥了重要作用,Wnt 与 SHH信号能够相互作用并促进味觉细胞的分化,而Notch 与 BMP 信号则会抑制味觉细胞的分化。在味蕾类器官发育的过程中,Wnt 和 SHH 信号通路被激活,而
11、 BMPs 和 Notch 信号通路被抑制10,从而调控味觉细胞的分化。此外,R-spondin 在味蕾类器官产生分化的味觉细胞的过程中发挥了不可或缺的作用。Lin 等11研究发现 R-spondin在膝状神经节的神经细胞中高表达,缺乏R-spondin 的味蕾类器官不具有味觉感知的功能,而外源性 R-spondin 的补充能够在去神经的味蕾类器官中恢复味觉感知的功能。进一步研究发现,R-spondin-Lgr4/5/6-Rnf43/Znrf3 轴通过促进味觉干/祖细胞的分化诱导味觉细胞的产生。虽然味蕾类器官的建立方法在不断地改进,但是截至目前,味蕾类器官培养体系中缺少与其相互作用的味蕾微环境
12、,可能阻碍了味蕾类器官在功能上对真实味蕾器官更进一步地模拟6。未来味蕾类器官的发展方向可能是加入神经元和脉管系统与类器官共培养,从而能够更准确地模拟味蕾器官的功能。1.2 味蕾类器官的研究应用 目前,味蕾类器官的应用研究较少,但仍不影响其为味觉相关疾病提供全新的研究平台。头颈部放疗能够引起味蕾损伤,导致味觉障碍,而目前对于这类损伤并没有有效的治疗方法12。2019年,Feng等13发现脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)能够诱导味蕾类器官的炎症反应,导致肿瘤坏死因子和白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)等炎症因子的表达增加。2022 年,Wu 等14发现L
13、PS 能够诱导味蕾味觉神经元基因 iNOS 表达的增加。iNOS 是 NF-B 通路的下游基因,其表达增加可诱导产生大量的一氧化氮,而一氧化氮能够增加味蕾对于咸味、苦味和酸味的负向应答,从而产生味觉障碍。该研究结果提示 iNOS 和一氧化氮可能在味蕾炎症反应中发挥了重要作用,为后续味蕾炎症提供新的研究方向。除了疾病建模以外,味蕾类器官在再生医学领域也有相关报道。2022 年,Adpaikar 等9将悬浮培养的味蕾类器官移植入小鼠舌外侧上皮组织下方,检测味蕾类器官移植入味蕾上皮的可行性。该研究所移植的类器官仅含有上皮细胞,不含肌层细胞,因此与舌上皮整合后能够维持神经支配和味觉功能,从而取得了良好
14、的移植效果。该研究表明味蕾类器官能够作为潜在的味蕾组织来源,在味蕾的再生医学研究中具有重要应用价值。目前味蕾类器官的应用研究仍处于起步阶段,而且主要以小鼠味蕾类器官的研究为主,未来期待在人源味蕾类器官的建立和应用研究等方面取得进展和突破。2 食管类器官 2.1 食管类器官的建立 食管是消化管道中连接咽与胃的重要组成部分。小鼠在食管解剖结构上与人类食管存在显著差异:小鼠的食管上皮仅有单层基底细胞层,上层角质化;而人类食管上皮则有数层基底细胞,上层无角质化15,因此,小鼠等动物模型不能作为研究人类食管功能及相关疾病的有效工具。相比之下,人源食管类器官更贴近于人类食管,是一种较为理想的 3D 替代模
15、型。Kasagi等16使用人食管细胞系 EPC2-hTERT 成功培养出食管类器官,该类器官能够重现食管上皮的自然分化过程。该研究同时发现 Notch 信号通路能够促进食管上皮的分化,抑制该信号通路会导致上皮分化受损。Kasagi 等16同时建立了利用内镜获取人类食管组织建立类器官的方法,该方法具有很高的成功率。近两年有学者建立了新的基 刘鸿渊 等/消化系统类器官研究进展 :010-64807509: 1335 于患者食管组织来源的类器官的培养方法。Karakasheva 等17将诊断性活检或微创手术获得的组织样本进行酶解(分散酶和胰蛋白酶),再将分离的细胞埋入 Matrigel 基质胶中形成
16、单细胞悬浮液进行 3D 培养。该方法建立了标准化的食管类器官的培养方案,能供其他科研工作者参考和应用。由 PSC 建立的食管类器官较组织来源食管类器官更贴近人体组织结构。Zhang 等18将来自 RUES2 细胞系的胚胎干细胞在多种生长因子包括 激活素 A(activin A )、成纤维细胞生长因子 2(fibroblast growth factor 2,FGF-2 )、BMP4 和 Rho 激酶抑制剂 Y-27632的作用下分化为内胚层,随后通过抑制 BMP、转化生长因子 (transforming growth factor-,TGF-)、Wnt 等信号通路进一步分化为前部前肠,随后将得
17、到的食管祖细胞培养成食管类器官18。Trisno 等19通过依次调节 BMP、Wnt 和视黄酸等信号通路得到食管祖细胞,建立了另一种从 PSC 建立食管类器官的方法。该研究同时发现较短时间激活 Wnt和视黄酸信号能够促进前肠向食管的方向发育,并且抑制 BMP 信号可促进基因 Sox2 表达,同样起到促进食管类器官生成的作用。2.2 食管类器官的研究应用 2.2.1 食管类器官与疾病建模 作为模拟食管结构和功能的有效工具,食管类器官近年来已广泛用于食管炎症和食管癌等方面的研究。Nakagawa 等20利用患者食管组织来源的类器官建立嗜酸性粒细胞性食管炎类器官模型。研究发现嗜酸性粒细胞性食管炎引起
18、基底细胞增生,外源性重组细胞因子(如 IL-13)能够诱导类器官模拟嗜酸性粒细胞性食管炎的炎症反应。该研究表明嗜酸性粒细胞性食管炎类器官模型能够通过诱导炎症反应模拟该疾病的发生、发展机制,从而寻找并制定可能的治疗方案。随着肿瘤组织来源类器官培养技术的成熟,多个食道类器官的癌症模型已建立成功。肿瘤组织来源的食管类器官与肿瘤组织具有高度的相似性,也保留了肿瘤的异质性,食管类器官为肿瘤患者提供了精准的治疗方案。食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是亚洲最主要的食管癌亚型,占全世界食管癌确诊病例的 40%21。Kijima 等22建立了患者来
19、源的ESCC 类器官的培养方法,该方法建立的类器官可由嵌入基底膜基质中的单细胞悬浮液快速形成,用时仅需 14 d,而成功率约为 60%。他们还使用了 5-氟尿嘧啶 离体 处理这些类器官,发现高CD44 表达的癌细胞可能是引起肿瘤耐药性的原因。巴雷特食管(Barrett esophagus,BE)被认为是食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)的一种癌前病变,而 EAC 是一种预后不佳的癌症类型,其发病率在西方国家快速上升23。2011 年,Sato 等24首次利用来自 BE 的活检组织生成了食管上皮类器官,开启了这类疾病的类器官的研究。食管肿瘤的细胞来源一直具有争
20、论,现有的研究不能确定 EAC 是否由 BE 转化而来,因为有一半的 EAC 患者在诊断时没有发生 BE 化生。2021 年,Nowicki-Osuch 等25利用食管上皮类器官发现 BE 起源于胃贲门,由 c-MYC 和肝细胞核因子 4(hepatocyte nuclear factor 4 alpha,HNF4)驱动,EAC 由 BE 样的上皮化生转化产生,此发现填补了之前的研究空白,凸显了食管类器官模拟食管的重要性。Kunze 等26研究了 Notch 信号通路与 BE 杯状细胞之间的关系,结果表明激活Notch 信号通路可引起 BE 杯状细胞密度降低,该过程与核因子 B(nuclear
21、 factor kappa-B,NF-B)的激活密切相关。Notch 是肿瘤发生过程中重要的信号通路,该研究结果为将来 EAC 的预防提供思路。基因编辑与类器官技术的结合拓展了类器官研究疾病发生的应用。Liu 等27使用CRISPR/Cas9 技术研究了 Wnt 信号通路在 BE 相 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1336 关肿瘤转化中的作用。该研究发现与野生型 BE类器官相比,激活 Wnt 信号通路导致 BE 类器官增殖和复制能力增加、细胞凋亡减少。目前食管类器官主要应用在食管癌的相关研究中,其他疾病的研究较
22、少。由于食管肿瘤的细胞来源尚未明确,大多数研究侧重寻找肿瘤发生的机制,这可能是影响食管类器官应用于其他疾病的重要原因。众多研究已证明了食管类器官在模拟肿瘤发生发展、肿瘤药物筛选等方面的重要应用价值,未来期待食管类器官应用于其他食管疾病的研究中。2.2.2 食管类器官与再生医学 目前,食管闭锁、食管狭窄、食管癌等疾病可以通过食管切除术进行治疗,但是术后往往要使用远端胃肠道填补失去的食管,为患者带来诸多生活不便和新的疾病问题。食管的结构相对简单,这一特性使得再生医学应用于食管修复的门槛较低。食管类器官单元28是一种通过在Matrigel 基质胶中接种分离的食管细胞,并与神经肌肉细胞共培养而产生的类
23、器官系统。这种类器官具有从基底样细胞到成熟鳞状细胞的上皮分化的梯度,并且可以自发蠕动。2014 年,Spurrier等28使用食管类器官单元与组织工程支架结合,食管祖细胞首先在体外培养,然后在体内形成组织工程食管,从而发挥再生作用。这项研究证明了食管类器官可以作为食管再生医学的细胞来源。未来食管类器官可以尝试与 3D 生物打印技术结合,产生更多的再生医学的应用方式。3 胃类器官 3.1 胃类器官的建立 胃是消化管重要的组成器官之一,幽门螺杆菌感染是常见的胃部疾病,能够引起炎症乃至癌症病变。长期以来,该领域一直缺乏这类感染性疾病的合适的研究模型,胃类器官的成功建立为研究这类疾病提供了一个全新的平
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