响应面优化石榴皮多酚提取物提取工艺及其活性研究.pdf
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1、2023 年 6 月第 3 期228238甘肃农业大学学报 JOURNAL OF GANSU AGRICULTURAL UNIVERSITY第5 8卷双 月 刊响应面优化石榴皮多酚提取物提取工艺及其活性研究张茂栖,涂倩,杨育静,简玉英,谢大明,黄茂微,包沅鑫,曾珍,刘韫滔,李诚(四川农业大学食品学院,四川 雅安 625014)摘要:【目的】优化从石榴皮中提取多酚的工艺,并探究3种常见石榴皮提取物(会理水晶石榴(HL)、突尼斯软子石榴(TN)、云南蒙自甜石榴(MZ)的组成成分和抗氧化抑菌活性。【方法】采用单因素试验、响应面分析法研究提取时间、乙醇浓度、温度、料液比对总酚含量的影响并确定最优提取工
2、艺,核磁共振法分析石榴皮提取物成分,通过抗氧化抑菌试验,评估其抗氧化抑菌能力。【结果】最佳提取条件为:提取时间77 min、乙醇浓度36.0%、温度66.9、料液比1 37。在此条件下,总酚含量为(242.0261.94)mgGAE/g,。石榴皮提取物的主要成分为糖类、有机酸、酚类化合物等物质。抗氧化能力依次为HLTNMZ丁基羟基茴香醚。3种细菌对石榴皮提取物的敏感度依次为:荧光假单胞菌金黄色葡萄球菌大肠杆菌,抗菌能力依次为HLTN=MZ。【结论】HL的抗氧化抑菌能力最强,研究结果为石榴皮提取物提取及利用提供了实验依据。关键词:石榴皮提取物;提取优化;1H-NMR;抗氧化性能;抗菌性能中图分类
3、号:TS255 文献标志码:A 开放科学(资源服务)标识码(OSID):文章编号:1003-4315(2023)03-0228-11Studies on extraction process optimization and activities of polyphenol matter from pomegranate peel by response-surface methodologyZHANG Maoxi,TU Qian,YANG Yujing,JIAN Yuying,XIE Daming,HUANG Maowei,BAO Yuanxin,ZENG Zhen,LIU Yuntao,L
4、I Cheng(College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Yaan 625014,China)Abstract:【Objective】The study aimed to optimize extraction process of polyphenols from pomegranate peel,and to investigate the components of three common extracts(Huili crystal pomegranate(HL),Tunisian soft pomegranate
5、(TN),Yunnan Mengzi sweet pomegranate(MZ)and their antioxidant and antibacterial activities.【Method】Single factor test were designed to study the effects of extraction time,ethanol concentration,temperature and solid-liquid ratio on total phenol content through response-surface analysis,followed by d
6、etermining optimal extraction process.Nuclear magnetic resonance was used to analyze the components of pomegranate peel extracts,and the antioxidant and bacteriostatic abilities of the extracts were evaluated by antioxidant and bacteriostatic test.【Result】The optimal extraction conditions were as DO
7、I:10.13432/ki.jgsau.2023.03.028第一作者:张茂栖,硕士研究生。E-mail:通信作者:李诚,教授,博士生导师,从事畜产品加工与食品质量安全研究。E-mail:基金项目:四川省重点研发项目(2020YFN0147)。收稿日期:2022-03-02;修回日期:2022-04-22follows:extraction time for 77 min,ethanol concentration of 36.0%,temperature at 66.9 C,solid-liquid ratio of 1 37.Under these conditions,the total
8、 content of phenols was(242.0261.94)mgGAE/g.The main components of pomegranate peel extract were sugars such as pectin,organic acids,phenolic compounds,etc.The antioxidant capacity of these extracts ranged as follows:HL TN MZ butylated hydroxyanisole.The susceptibility of the three bacteria to pomeg
9、ranate peel extract ranged in the following order:Pseudomonas fluorescens Staphylococcus aureus Escherichia coli,and the antibacterial ability ranged in the order of HLTN=MZ.【Conclusion】The antioxidant and bacteriostatic capacity of HL was the strongest,and the results laid an experimental basis for
10、 extraction and utilization of pomegranate peel extract.Key words:pomegranate peel,extraction optimization,1H-NMR,antioxidants,antibacterials石榴皮约占石榴果实的40%,通常作为加工副产物而废弃,石榴皮含有多种生物活性物质,其中酚类化合物是石榴皮中的主要活性物质1。研究表明,从石榴皮中获得的提取物具有良好的抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎和抗肿瘤的生物活性2-3。Haghighian等4的临床试验表明:短期服用石榴皮提取物(PPE)对患有膝盖骨关节炎的肥胖妇女的
11、总胆固醇和甘油三酯的血清水平和抗氧化状态有显著的改善效果。Gull等5将PPE添加到纳米壳聚糖涂层中,可显著延缓杏的重量损失和腐烂。PPE可作为抗氧化剂、抗菌剂或功能性食品成分的潜在来源6,因此对石榴皮进行资源再利用具有较好的环境与经济价值。PPE的提取方法主要有:超声波辅助提取(空化现象和改善传质)、高压辅助提取(破坏植物组织和增强传质效应)、高压放电辅助提取(电击穿现象破坏细胞结构)、超临界流体提取(溶剂具有低粘度和高扩散系数)、微波辅助提取(微波辐射和较高温度的破坏作用)、酶辅助提取(酶水解细胞壁)和溶剂浸提。溶剂浸提具有操作简单方便、提取成本低、无需大型仪器参与等优点,是实现PPE批量
12、生产的最佳方法之一。本研究采用溶剂浸提法,通过响应面法优化提取(提取时间、乙醇浓度、温度、料液比),得到最佳提取条件,为简便、大批量、低成本获取PPE研究应用提供参考。并评估3种常见PPE(HL、MZ、TN)的组成成分、抗氧化性能(DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子清除能力、铁还原能力)和抗菌性能(荧光假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌),为PPE的功能研究以及特殊产品开发提供理论依据与参考。1材料与方法1.1试剂与仪器3种新鲜石榴,杨凌润美农业发展有限公司;抑制与产生超氧阴离子自由基测定试剂盒(比色法),南京建成生物工程研究所;福林酚试剂,北京索莱宝科技有限公司;其它化学试
13、剂均为分析纯。Varioskan Flash荧光酶标仪,美国赛默飞世尔科技公司。1.2石榴皮粉制备手工剥离石榴皮,40 烘箱干燥60 h,粉碎,过40目筛,4 储藏备用。1.3绘制没食子酸标准曲线采用福林酚法7。配制没食子酸标准溶液,将100 L 各浓度标准溶液、6 mL 双蒸水和 500 L Folin-Ciocalteau 试剂混合均匀。静置 8 min,加入1.5 mL Na2CO3溶液(20%w/v),充分混合,静置30 min,765 nm处测量吸光度。以吸光度为Y轴,没食子酸浓度为x轴,绘制标准曲线。得回归方程:Y=0.771 5x+0.051 9,R2=0.999 61.4多酚提
14、取与测定取3.0 g石榴皮粉,按照一定的提取时间、温度、料液比、乙醇浓度进行浸提。提取后离心取上清液,稀释,按1.3所诉方法测定吸光度。以下列公式计算总酚含量(TPC):Y=XcV/m式中:Y:总酚含量(mg/g);c:所测样品总酚浓度(mg/mL);X:稀释倍数;V:提取液体积(mL);m:样品质量(g)。1.5单因素试验按1.3、1.4所述方法,固定其它条件不变,研究第 3 期张茂栖等:响应面优化石榴皮多酚提取物提取工艺及其活性研究follows:extraction time for 77 min,ethanol concentration of 36.0%,temperature at
15、 66.9 C,solid-liquid ratio of 1 37.Under these conditions,the total content of phenols was(242.0261.94)mgGAE/g.The main components of pomegranate peel extract were sugars such as pectin,organic acids,phenolic compounds,etc.The antioxidant capacity of these extracts ranged as follows:HL TN MZ butylat
16、ed hydroxyanisole.The susceptibility of the three bacteria to pomegranate peel extract ranged in the following order:Pseudomonas fluorescens Staphylococcus aureus Escherichia coli,and the antibacterial ability ranged in the order of HLTN=MZ.【Conclusion】The antioxidant and bacteriostatic capacity of
17、HL was the strongest,and the results laid an experimental basis for extraction and utilization of pomegranate peel extract.Key words:pomegranate peel,extraction optimization,1H-NMR,antioxidants,antibacterials石榴皮约占石榴果实的40%,通常作为加工副产物而废弃,石榴皮含有多种生物活性物质,其中酚类化合物是石榴皮中的主要活性物质1。研究表明,从石榴皮中获得的提取物具有良好的抗菌、抗病毒、抗氧
18、化、抗炎和抗肿瘤的生物活性2-3。Haghighian等4的临床试验表明:短期服用石榴皮提取物(PPE)对患有膝盖骨关节炎的肥胖妇女的总胆固醇和甘油三酯的血清水平和抗氧化状态有显著的改善效果。Gull等5将PPE添加到纳米壳聚糖涂层中,可显著延缓杏的重量损失和腐烂。PPE可作为抗氧化剂、抗菌剂或功能性食品成分的潜在来源6,因此对石榴皮进行资源再利用具有较好的环境与经济价值。PPE的提取方法主要有:超声波辅助提取(空化现象和改善传质)、高压辅助提取(破坏植物组织和增强传质效应)、高压放电辅助提取(电击穿现象破坏细胞结构)、超临界流体提取(溶剂具有低粘度和高扩散系数)、微波辅助提取(微波辐射和较高
19、温度的破坏作用)、酶辅助提取(酶水解细胞壁)和溶剂浸提。溶剂浸提具有操作简单方便、提取成本低、无需大型仪器参与等优点,是实现PPE批量生产的最佳方法之一。本研究采用溶剂浸提法,通过响应面法优化提取(提取时间、乙醇浓度、温度、料液比),得到最佳提取条件,为简便、大批量、低成本获取PPE研究应用提供参考。并评估3种常见PPE(HL、MZ、TN)的组成成分、抗氧化性能(DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子清除能力、铁还原能力)和抗菌性能(荧光假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌),为PPE的功能研究以及特殊产品开发提供理论依据与参考。1材料与方法1.1试剂与仪器3种新鲜石榴,杨凌润美农
20、业发展有限公司;抑制与产生超氧阴离子自由基测定试剂盒(比色法),南京建成生物工程研究所;福林酚试剂,北京索莱宝科技有限公司;其它化学试剂均为分析纯。Varioskan Flash荧光酶标仪,美国赛默飞世尔科技公司。1.2石榴皮粉制备手工剥离石榴皮,40 烘箱干燥60 h,粉碎,过40目筛,4 储藏备用。1.3绘制没食子酸标准曲线采用福林酚法7。配制没食子酸标准溶液,将100 L 各浓度标准溶液、6 mL 双蒸水和 500 L Folin-Ciocalteau 试剂混合均匀。静置 8 min,加入1.5 mL Na2CO3溶液(20%w/v),充分混合,静置30 min,765 nm处测量吸光度
21、。以吸光度为Y轴,没食子酸浓度为x轴,绘制标准曲线。得回归方程:Y=0.771 5x+0.051 9,R2=0.999 61.4多酚提取与测定取3.0 g石榴皮粉,按照一定的提取时间、温度、料液比、乙醇浓度进行浸提。提取后离心取上清液,稀释,按1.3所诉方法测定吸光度。以下列公式计算总酚含量(TPC):Y=XcV/m式中:Y:总酚含量(mg/g);c:所测样品总酚浓度(mg/mL);X:稀释倍数;V:提取液体积(mL);m:样品质量(g)。1.5单因素试验按1.3、1.4所述方法,固定其它条件不变,研究229甘肃农业大学学报2023 年时间(10、30、50、70、90、110 min)、乙醇
22、浓度(0、15、30、45、60、70%)、温度(30、40、50、60、70、80)、料液比(1 10、1 20、1 30、1 40、1 50、1 60)对TPC的影响,确定最佳提取条件。1.6响应面试验设计根据单因素试验,利用Box-Behnken模型,以时间(X1)、乙醇浓度(X2)、温度(X3)、料液比(X4)为优化因素。TPC(Y)作为响应值。试验因素和水平见表1。二阶多项式模型如下:Y=M0+i=14MiXi+i=14MiiX2i+i3j=i+14MijXiXjM0、Mi、Mii、Mij为回归系数;Xi和Xj为变量。1.7不同品种PPE制备按1.2和1.4所述的方法制备HL、TN、
23、MZ的提取液。经旋转蒸发、冷冻干燥得提取物固体,-22 储存备用。1.8PPE组成成分分析采用1H-NMR光谱分析3种PPE组成成分,1H-NMR 试 验 采 用 Z116098_0762 探 头,扫 描 频 率400.13 MHz,测定温度297.8 K,谱宽8 196.7 Hz,扫描次数16次,溶剂为D2O。1.9抗氧化活性测定测定3种PPE的各项抗氧化能力,并以丁基羟基茴香醚(BHA)作为对照。1.9.1DPPH自由基清除能力参考Ivanovic等8的方法,将提取物水溶液(100 L)与甲醇(1 mL)和0.2 mmol/L DPPH溶液(1 mL)混匀。室温下,黑暗中孵育30 min,
24、517 nm处测定吸光度。以下列公式计算清除率:清除率=A0-A1A0100%式中:A0:空白吸光度;A1:样品吸光度。1.9.2羟自由基清除能力测定参考王巨存等9的方法,0.5 mL蒸馏水代替样品作空白,1.5 mL蒸馏水代替EDTA-Fe2+和样品作对照。以下列公式计算清除率:清除率=(A0-A1)-(A0-A2)A1-A0100%式中:A0:空白组吸光度;A1:对照组吸光度;A2:样品组吸光度。1.9.3超氧阴离子清除能力采用抑制与产生超氧阴离子自由基测定试剂盒(比色法)测定。1.9.4铁还原能力的确定参考Szabo等10的方法。将1 mL样品、1 mL磷酸盐缓冲液(pH:6.6)和1
25、mL铁氰化钾(1%w/v)混合,50 C下孵育20 min。然后,在混合物中加入1 mL三氯乙酸(10%w/v),混合均匀,3 000 r/min下离心10 min。最后取1 mL上清液与200 L氯化铁(0.1%w/v)和1 mL蒸馏水混合,室温下孵育10 min,700 nm处测定吸光度。吸光度越高还原能力越强。1.10抑菌试验参考Zhang等11的方法。石榴皮提取物的抗菌活性以抑菌圈直径(mm)来表示。1.11数据统计分析所 有 试 验 一 式 三 份,软 件 Design-Expert.V8.0.6.1 用于响应面试验设计及方差分析,Origin 2021b用于图表处理及显著性分析。2
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- 响应 优化 石榴皮 提取物 提取 工艺 及其 活性 研究
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