核磁共振光谱NMR_之原理_39页.pdf

1Nuclear Magnetic ResonanceB9302008吳濟如B9302009李宗儒B9302012李勁樵B9302032游舒涵B9302033馮立安Nuclear Magnetic Resonance1.NMR之原理 Nuclear SpinMagnetic ShieldingChemical ShiftSpin-spin SplittingCoupling ConstantNuclear Overhouser Effecter2.NMR之應用2維和多維蛋白質光譜分析異核核磁共振和蛋白質動力學NMR在蛋白質分子的研究2NMR 之原理Nuclear spinMagnetic ShieldingChemical ShiftB9302012 李勁樵為什麼會有NMR現象呢？3NMR 基礎原理凡具奇數原子數或質量的原子核皆會有核自旋(nuclear spin)，才會被NMR spectrometer 所觀察到。當核子在外加磁場中，會被扭轉成順著磁場、低能量的spin逆著磁場、高能量的spinNMR 基礎原理 spin和 spin間的能量差可用公式B0（gyomagneticratio,是一常數，但要視所要探討的原子核而定。）spin可在吸收光子能量hv後，躍遷至 spin，B02h24如何分辨一分子中許多相同的原子呢？Magnetic Shielding 核子外的電子在磁場中會產生感應磁場對抗外加磁場，使得effectiveexternalshielding 隨著核子四周結構的不同，會有不同的電子密度 因此NMR光譜中a.吸收光譜的數量代表不同類的核子b.吸收光譜的大小代表該核子在分子中的數量5NMR 光譜我們可藉由測量其吸收的光子頻率而製成NMR光譜。如何用光譜看出此原子位於何種結構中？6Chemical Shift待測核子和tetramethylsilane(TMS)之間吸收光子頻率的差異Chemical Shift(ppm)=total spectrometer frequency(MHz)shift down from TMS(Hz)Chemical Shift 隨著核子四周結構的不同，會有不同的電子雲密度，故有不同的Chemical Shift7Chemical ShiftEx:Vinyl and Aromatic protonsChemical Shift各種不同結構之Chemical Shift8Spin-Spin Splitting Spin-Spin Splitting Spin-Spin SplittingNMR光譜計的質子同時受到外加磁場跟感應磁場影響感應磁場是如何產生的？spin-spin splitting magnetically coupled 屏蔽電子 相鄰質子magnetically coupledspin-spin splitting9Spin-Spin SplittingHa所產生的微小磁場可能會1.同向2.反相於外加磁場同向deshielded lower field 反向shielded higher field 分裂訊號的高峰等高，曲線下的面積相同質子b受質子a影響Spin-Spin Splitting到目前為止，我們已經知道：Spin-Spin Splitting具有倒數性質，換句話說，Ha造成Hb的NMR訊號分裂，Hb也會造成Ha的NMR訊號分裂。10Spin-Spin Splitting為什麼NMR訊號分裂成三段？排列組合排列組合造成 NMR訊號分裂為三段deshielded lower fieldshielded higher field抵消無影響！抵消無影響！質子b受質子a影響N+1 Rule 什麼是N+1 Rule？什麼是等位質子（equivalent proton）？如果一個NMR訊號受到N個等位質子影響而分裂，將會分裂成N+1個波峰。11N+1 Rule等位質子N+1 Rule波峰面積比可以由巴斯卡三角形推估出12The Range of Magnetic Coupling 大部分相鄰碳原子上才有Spin-Spin Splitting現象鍵結於相同碳原子：質子間相隔兩個鍵如果不等位，Spin-Spin Splitting通常會被觀測到鍵結於鄰近碳原子：質子間相隔三個鍵最普遍的情況，Spin-Spin Splitting通常會被觀測到鍵結於非鄰近的碳原子：質子間相隔多餘四個鍵Spin-Spin Splitting通常不會被觀測到The Range of Magnetic Coupling有趣的現象！13Spin-Spin Splitting的結論用實際的例子做結論！methyl isopropyl ketoneCoupling Constants（耦合常數）從NMR訊號的分裂到訊號間的距離14Coupling ConstantsCoupling Constants（耦合常數）是什麼？Ha和Hb 彼此影響造成NMR訊號分裂，而波峰間的分裂距離是常數，Ha和Hb之間的耦合常數可用Jab來表示。Coupling Constants（耦合常數）的功用？1.辨識相鄰取代基的質子2.和外加磁場的強度無關3.區辨同分異購物和立體異購物Values for Coupling Constants 15NOE 效應(Nuclear Overhouser Effect)Nuclear Overhouser EffectNMR 之所以能解出蛋白質分子在水溶液的三維結構，主要的就是要靠NOE 效應NOE 效應是指分子中若有二個H 核子，分隔在5 之內這兩個H 會有雙偶極作用(dipolar coupling)用無線電波(radio frequency)去照射其中一個H 共振位置，使之飽合，則另一H 核子光譜的intensity 就會改變intensity 改變的百分比即為NOE用無線電波(radio frequency)去照射其中一個H 共振位置，使之飽合，則另一H 核子光譜的intensity 就會改變！16到目前為止，我介紹了到目前為止，我介紹了1.Spin-Spin SplitingNMR訊號分裂2.N+1 Rule算出分裂波峰數目3.Coupling Constant4.NOE效應互相作用的質子，分裂波峰間距相同I：質子a吸收無線電波使相鄰質子b的訊號增強I0：原有質子b的訊號強度蛋白質結構分析17多維 NMR experiment2-D NMR Why 2-D NMR?核種(homonuclear)：1H 蛋白質樣品備製 常見實驗種類：2-D COSY2-D NOESY光譜判定 每個胺基酸有7個H核子，FGF蛋白質中有接近1000個質子，總數分布在15ppm的chemical shift中，大多數互相重疊，分辨不易。為增加解析度，一維二維，改為分布在15ppmX15ppm的平面上。18纖維母細胞生長因子(FGF-1)154個胺基酸所構成，1H-NMR的1-D光譜如圖這一段只有15ppm二維NMR光譜 二維核磁共振實驗是一維核磁共振的延伸；在一維實驗的脈衝的過程中，加入演化期（evolution time）。在每次實驗中，將演化期按順序的逐次增加，來獲得數據，經兩次的傅氏轉換就可得二維共振光譜。粗略的分類，可將二維核磁共振光譜分為：化學位移相關光譜（shift correlation）及化學位移偶合常數二維光譜（J-resolved）兩大類192-D spectrum20多維 NMR experiment2-D NMR Why 2-D NMR?核種(homonuclear)：1H 蛋白質樣品備製 常見實驗種類：2-D COSY2-D NOESYpreparationevolutionevolutiont2t13D NMRdetectiont3preparationdetectiont1D NMRpulsepreparationevolutiondetectiont2t12D NMR212D NMR線性增加t1多維 NMR experiment2-D NMR Why 2-D NMR?核種(homonuclear)：1H 蛋白質樣品備製 常見實驗種類：2-D COSY2-D NOESY22化學位移相關光譜 化學位移相關光譜，簡稱COSY，是季尼（Jeener）於1971年在一次科學會議中，提出的構想。也是第一個二維核磁共振構想 二維光譜的兩軸都是氫核的化學位移。COSY實驗的脈衝序列23同核化學位移光譜 在對角線上出現的吸收峰稱為對角線峰（diagonal peak）。不在對角線出現的吸收峰稱為交叉峰（cross peak），NOESY實驗的脈衝序列242-D NOESYdiagram from bouman.chem.georgetown.edu/nmr/protein.htm252-D NOESY異核核磁共振&蛋白質動力學B9302008 吳濟如26異核核磁共振(heteronuclear NMR spectroscopy)爲何要有異核NMR?protein100a.a.H-NMR overlapping27異核核磁共振(heteronuclear NMR spectroscopy)鑑定蛋白質常用的核種：15N、13CINEPT(insensitive nuclei excitation polarization transfer)技術 蛋白質樣品備製：NH4Cl、C6H12O6異核核磁共振(heteronuclear NMR spectroscopy)常用實驗種類：1H-15N HSQC (2-D)(heteronuclear single quantum correlation)28principle appearance of a 15N-1H 2D HSQC experiment 050015N030013C0151HNMR化學位移(ppm)Lysine&ArginineLysineArginine2930www.nmr.sinica.edu.tw/Spectrometers/index.php?it=stdexpNMR assignments Distance(NOE)restraints backbone-backbone sidechain-backbone sidechain-sidechain Torsion angle restraints H-bond restraintsSimulated annealing,Restrained dynamics,or Distance geometryRestrained dynamics,or Restrained energy minimizationInitial structuresIterative relaxationmatrix approachConvergence3D heteronuclear NMR2D homonuclear NMRtriple resonance experimentsisotope-edited NOESY expts13C NOESY-HSQC3D HNHA15N NOESY-HSQCNOESY,COSY exptsNOESY experimentsCOSY experiments15N,13C-labeled cloned proteinunlabeled protein (?12 KDa)Final structure31NMR spectra Final structureAutoAssign Filtering Grouping Typing Linking Mapping蛋白質動力學 氫氘交換 Fast quench pulse labeling32氫氘交換(小部份處於開散狀態的蛋白質分子)蛋白質置於D2O不同時間、或變性條件下觀察殘基的amide proton交換速率Fast quench pulse labeling 在高濃度D2O下變性 Refolding buffer 10倍稀釋 不同回疊時間用2-D、3-D光譜分析了解蛋白質折疊或開散過程33Fast quench pulse labelingNMR 在蛋白質分子的研究B9302032 游舒涵34蛋白質與小分子之結合(Interaction)蛋白質+小分子ligand細胞內反應組織和外界的溝通(cAMP,interleukin-18)維生素B12運輸蛋白-BtuB如何利用核磁共振進行結構分析?35核磁共振核磁共振分析的步驟測量化學位移擾動(chemical shift perturbation)找出與ligand 作用的殘基解出整個complex 的結構何以蛋白質+ligand作用後會有化學位移變化?36化學位移的擾動(chemical shift perturbation)蛋白質與ligand 結合後，某些殘基和ligand 接觸或作用，使得化學環境改變經由測量各殘基化學位移的變化情形，找出ligand 的結合位(活性位置)nFGF(藍色)+SOS(紅色)之1H,15N-HSQC 重疊圖37化學位移擾動圖蛋白質分子之折疊(Protein Folding)NMR所提供的蛋白質資訊是來自各個殘基。利用NMR加上氫氘交換實驗或fast quench pulse labeling 技術，可觀察到各殘基參與蛋白質折疊或開散的情形。382002年諾貝爾化學獎表彰對生物大分子(biological macromolecules)的鑑定和結構分析方法所做出的貢獻。美國科學家約翰芬恩(John B.Fenn)日本科學家田中耕一(Koichi Tanaka)輕脫附分離(soft desorption ionization)質譜分析的方法鑑定生物大分子瑞士科學家庫爾特維特里希(KurtWthrich)核磁共振(nuclear magnetic resonance)技術測定水溶液中生物大分子三維結構”。庫爾特維特里希(Kurt Wethrich)sequential assignment and NOE左圖：NMR測出的蛋白質胺基酸相關位置右圖：電腦模擬出的立體結構39核磁共振 vs X光結晶學結成結晶溶液環境下即可樣本條件X光結晶學核磁共振可量測水溶性較差的大分子可定出蛋白質的動態結構比較較早較晚發展時間決定蛋白質分子的三度空間結構共同功能