![点击分享此内容可以赚币 分享](/master/images/share_but.png)
香蕉果实酵母双杂交文库的构...MaMADS2互作蛋白筛选_王川.pdf
《香蕉果实酵母双杂交文库的构...MaMADS2互作蛋白筛选_王川.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《香蕉果实酵母双杂交文库的构...MaMADS2互作蛋白筛选_王川.pdf(10页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、 南京农业大学学报,():收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目(,);广州市科技计划项目科学研究重点项目();广东省农产品保鲜物流共性关键技术研发创新团队项目()作者简介:王川,硕士研究生。通信作者:毕方铖,研究员,博士,主要从事水果采后生物学基础与保鲜研究,:。王川,盛鸥,窦同心,等 香蕉果实酵母双杂交文库的构建及后熟转录因子 互作蛋白筛选 南京农业大学学报,():,():香蕉果实酵母双杂交文库的构建及后熟转录因子 互作蛋白筛选王川,盛鸥,窦同心,李斌,胡春华,杨乔松,邓贵明,董涛,李春雨,易干军,毕方铖(广东省农业科学院果树研究所 农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室
2、广东省热带亚热带果树研究重点实验室,广东 广州;华中农业大学园艺林学院,湖北 武汉)摘要:目目的的 本文旨在鉴定香蕉果实后熟关键调控因子 的互作蛋白,深入解析 影响香蕉果实后熟过程的分子机制。方方法法 以 为诱饵利用酵母双杂交文库获得候选互作蛋白,通过克隆候选互作基因编码区进行点对点酵母双杂交试验来验证互作情况;利用转录组学分析互作蛋白相关基因在后熟过程中的表达情况;利用双分子荧光互补试验鉴定重要互作蛋白与 的互作;最后用蛋白免疫印迹分析 蛋白在香蕉后熟过程中的表达。结结果果 成功构建了果实在乙烯利催熟下的 文库,初级和次级文库的库容分别为 和 ,平均插入片段大小在 以上,可满足后续酵母双杂交
3、筛选的要求。最终共鉴定出 个互作蛋白,其中有 个 转录因子,个 泛素连接酶,个具有转录抑制作用的蛋白。转录组数据表明,乙烯利可抑制 个 基因的表达,而 甲基环丙烯()对其表达起诱导作用。双分子荧光互补试验表明,与 转录因子 存在互作关系。蛋白免疫印迹分析显示,在后熟过程中蛋白水平逐渐降低,这与其可以和 泛素连接酶互作是一致的。结结论论 通过构建高质量的果实 文库与酵母双杂交筛库技术,鉴定出多个与 互作的蛋白,并明确了 与另一 转录因子 之间存在明显的互作关系。关键词:香蕉;酵母双杂交文库;互作蛋白;果实成熟中图分类号:文献标志码:文章编号:(),(,;,):,“”,(),南 京 农 业 大 学
4、 学 报第 卷 ,:;家族的转录因子普遍存于植物等真核生物中,其包含一个非常保守的 结构域,是调控植物生长发育过程包括果实发育和后熟的重要因子。在番茄 转录因子中,()、()、()及 ()的突变都严重影响果实的成熟特性,且它们通过互作来共同调控果实成熟过程。而且,越橘()中的 同源基因,苹果中的()同源基因及非呼吸跃变果实草莓中的 同源基因也被证明可能参与了果实的成熟过程。在香蕉 基因组中存在近百个推定的 基因,预示着其可能参与多种生物学过程的调控。早些年在香蕉(,)中鉴定的()基因在果实中高表达且受乙烯诱导,且其能与泛素化激活酶()和()相互作用来共同调控香蕉的后熟过程。此外,研究表明()是
5、一个影响果实成熟的正调控因子。等从香蕉(,)中鉴定出 个 同源基因,分别命名为,其中多个基因的表达能被乙烯所诱导,且能被乙烯抑制剂 甲基环丙烯()所抑制。此外,等发现类 的 转录因子在香蕉跃变期的果皮中高度表达,且其能与大部分成熟相关基因启动子中的 序列相结合,说明这些 基因可能参与了成熟过程。最近的研究从遗传上证明了(基因组,)和(基因组,)的突变可以显著延缓香蕉的后熟过程,且对果实其他性状无明显影响,而且发现 能通过影响其他激素信号途径来调控香蕉的后熟过程。最新的研究显示,香蕉 转录因子被认为是香蕉的后熟过程核心调控因子。这说明多个 转录因子共同参与香蕉果实后熟过程的调控。前期的报道显示,
6、在香蕉果肉和果皮中 的表达不受乙烯诱导,而其表达下调能延缓香蕉后熟过程,说明其可能在乙烯信号途径上游起重要调控作用,但与其互作的蛋白及其具体的作用机制还不明确。本研究通过构建高质量的香蕉果实酵母双杂交文库,进一步利用此文库筛选鉴定出多个与 互作的蛋白,并对互作蛋白的功能进行初步预测与分析,为进一步深入解析 调控香蕉后熟过程的分子机制奠定基础。材料与方法 试材及取样供试材料选用开花后 (成熟)的巴西蕉(,)果实。采回的新鲜香蕉经清洗后用(体积分数)乙烯利水剂稀释 倍后进行催熟处理,分别在处理前、处理后 和处理后 取样,经液氮速冻后保存于 备用。香蕉果实 提取及酵母双杂交文库(文库)的构建前期研究
7、发现,香蕉在催熟后 已转色,且大部分受诱导基因已呈现较高表达水平,因此选取香蕉催熟处理前、处理后 和处理后 的混合样品为材料,在液氮中研磨成粉后用 法提取果实 进行建库。具体如下:)提取缓冲液,(),用前加入 巯基乙醇至终浓度为(体积分数),且在 预热;)每 果 第 期王川,等:香蕉果实酵母双杂交文库的构建及后熟转录因子 互作蛋白筛选肉加入 聚乙烯吡咯烷酮()在液氮中磨成粉末,取部分粉末加入 提取液,涡旋混匀,在 水浴 ,每隔 混匀 次;)冰上冷却至室温,加入等体积氯仿抽提,于 、离心,取上清液,加入 至终浓度为 (倍体积),放置过夜;)于 、离心 沉淀,用 焦碳酸二乙酯()水溶解沉淀,用等体
8、积的水饱和酚或酸酚,氯仿顺序抽提 次,取上清液,加 体积 和 倍体积无水乙醇放在 冰箱中沉淀 以上,于 、离心 沉淀;)沉淀物用预冷的 乙醇洗涤 次,真空干燥后溶于 处理水中备用。提取获得的总 用 分离,所得 经反转录合成双链 后再连接接头,进一步利用 进行 反应并连接 载体,所得初级文库质粒利用 进行 反应并连接 载体得到酵母双杂交文库质粒。诱饵蛋白表达载体的构建、诱饵蛋白毒性及自激活检测利用基因特 异 引 物(和)将()的 编 码 区 序 列 克 隆 至,构 建 诱 饵 蛋 白 表 达 载 体,并 命 名 为。对比 ()和 ()在 平板上的生长情况来确定诱饵蛋白是否对酵母的生长有毒性。按组
9、合、转化 酵母,通过观察酵母在二缺()和四缺()培养基平板上的生长情况来确定是否存在自激活情况。酵母文库的筛选参考 (公司)使用手册说明,以携带诱饵质粒的 菌株和文库质粒为材料,采用质粒共转的方法进行香蕉果实酵母文库的筛选。挑取诱饵菌株单克隆接种至 液体培养基,于 、培养至();离心收集菌体,用 预热的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂腺嘌呤硫酸盐()液体培养基重悬并转移至 锥形瓶中,、继续培养 至细胞密度达到;离心收集菌体,用无菌蒸馏水清洗 次,加入 溶液重悬菌体,涡旋重悬菌体,静置 ,离心,弃上清液;依次加入预冷的 聚乙二醇()、文库质粒、无菌水,涡旋混匀;孵育,每 颠倒混匀 次,加入 二甲基亚砜()
10、,用移液器吸打混匀,水浴,每 颠倒混匀 次;离心收集菌体,弃上清液,用 重悬,于、振荡培养 ,离心 收集菌体,用 溶液重悬细胞;转化液分别稀释、倍后各取 涂布于 的 、的培养基上,其中 、分别用于验证诱饵菌株和文库质粒情况,根据 平板上的单克隆数计算转化效率;将剩余重悬液按每个培养皿 均匀涂布到 的 培养皿上;倒置培养 ,挑取单克隆转移至 培养基上生长,观察颜色变化。回转验证用酵母质粒小量抽提试剂盒()分别提取阳性克隆所含的文库质粒,转化大肠杆菌感受态扩繁。将提取的质粒分别与 载体共转化 ,再将转化后的酵母铺于 培养基上,待克隆长出后,分别接种至 和 培养基进行回转验证。同步进行阳性对照()和
11、阴性对照()质粒的转化试验。利用 载体特异性引物对阳性克隆进行菌液 鉴定,送上海生工生物工程有限公司测序。根据测序结果,进一步将鉴定的候选蛋白克隆至 载体,分别与 质粒共转 酵母菌株,并将转化后的酵母涂布于 培养基上,待克隆长出后,分别接种至 和 培养基进行进一步验证。候选互作蛋白基因的表达分析对不同生长发育阶段(断蕾、)和后熟不同阶段(乙烯利处理和处理)的香蕉果实进行转录组测序分析,以此为基础提取互作蛋白基因的转录组数据,利用 软件以各阶段基因表达的 值(取 为底的对数)绘制表达热图。南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 双分子荧光互补试验()载体构建利用 和 酶切克隆载体(和)后胶回收备用
12、,然后用 引 物(和)将 基因()的编码区克隆至 载体,用引物(和)将 基因的编码区克隆至 载体,分别提取质粒进行水稻原生质体转化。水稻原生质体分离及瞬时转化取在 暗培养 的水稻幼苗茎叶,除去最外层叶鞘,用刀片切成小段(),加入 酶解液(甘露醇、巯基乙醇),、振荡酶解 ;用 滤网过滤原生质体,离心 收集原生质体,弃上清液,用预冷的 溶液 (吗啉)乙磺酸、,洗涤 次,最后用 溶液(含 、甘露醇、)重悬,并调整原生质体浓度为();向 无菌离心管中加入()质粒、原生质体、(含 、甘露醇、),轻柔混合均匀,室温静置 ;加入 缓冲液,混合均匀终止反应,离心 收集原生质体,弃上清液,加入 溶液洗涤 次,最
13、后加入 溶液,转移到 离心管中,暗培养 ,离心 收集原生体,留 原生质体用于激光共聚焦显微镜()观察。分析取约 样品在液氮中研磨,加 裂解液(含 苯甲基磺酰氟,碧云天生物技术有限公司),冰浴 ,每 混匀 次,于 、离心 ,取上清液测定蛋白浓度后用于蛋白表达检测。配制 浓缩胶和 分离胶,浓缩胶电泳电压为 ,分离胶电泳电压为 。用 孔径的 膜转膜,转膜条件为:湿转,恒流 ,。用含 脱脂奶粉的 室温封闭 ,的多克隆抗体按 倍稀释后于 过夜孵育,二抗 倍稀释后于室温孵育 ,然后用 洗涤 次,每次 ,最后用 显色试剂盒()进行显影。内参抗体 购自上海艾比玛特医药科技有限公司。多克隆抗体由南京金斯瑞生物科
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 香蕉 果实 酵母 双杂交 文库 MaMADS2 蛋白 筛选 王川
![提示](https://www.zixin.com.cn/images/bang_tan.gif)
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。