BioPlex悬液芯片技术应用指南_52页.pdf

Bio-Plex 悬液芯片技术应用指南 多重分析的领先者悬液芯片11 Bio-Plex 悬液生物芯片系统.12 Bio-Plex 技术进展.23 什么是 Bio-Plex 技术？.34 Bio-Plex 悬液芯片技术的特点 _ _ xMAP 技术的领先者.65 综述 Bio-Plex 悬液芯片技术在生命科学与医学研究中的应用.76 Bio-Plex 磁性和非磁性测定人细胞因子(组)的方法比较.197 多重磷蛋白分析：非小细胞肺癌细胞下游表皮生长因子受体蛋白磷酸化和吉非替尼抑制的检测.218 利用 Bio-Plex 磷酸化蛋白试剂盒研究采取西妥昔单抗治疗的癌症病人的表皮生长因子受体信号.249 两种基于磁性微球人细胞因子蛋白检测平板的研发与验证.2710 一种新型磁性微球复合免疫球蛋白同型分析方法的开发和验证.3011 利用 Bio-Plex Pro 小鼠 Th17 检测试剂盒分析鼠 Th17 细胞因子谱.3412 利用 Bio-Plex 人细胞因子 27-Plex 检测平板(Bio-Plex Human Cytokine 27-Plex Panel）测定Caspase-1 依赖的细胞因子分泌物.3913 Bio-Plex 检测试剂及其操作指南，包装与订购.4314 Bio-Plex FAQs.46 4|层析介质多重分析的领先者多重分析的领先者www.bio-|111234511101213 8 967Bio-Plex 系统将先进的软件包、系统校检工具、微球偶联试剂和即用型细胞因子与磷酸化蛋白测试试剂盒整合在一起，形成一个功能强大的芯片技术平台。这个系统为蛋白与核酸研究人员提供了灵活的复合式测试方案，可在单个样品中同时分析多达 100 种生物分子。这一目标通过悬液芯片技术得以实现。它由 100 种不同颜色标记的一系列微球体(xMAP 技术)组成，每个微球体可偶联一种对应不同靶分子的特异反应物。反应物可以是酶底物、受体、抗原、抗体和核酸片段等。多重检测获得的数据整合在一起有助于揭示生命分子间的相互关系及信号转导途径。Bio-Plex 悬液芯片系统组件 4.平面显示器 5.PC 6.反应试剂盒 7.清洗工作站 8.细胞裂解试剂盒 9.单重预混合 多重检测试剂盒 10.COOH 羧基微球 1.芯片阅读仪 2.微孔板平台 3.高通量液流系统(HTF)11.校验试剂盒 12.维护、校正、校验(MCV)板 13.校正试剂盒完整的产品特点Bio-Plex 系统由一个完整的实验流程所必需的所有产品组成，从样品准备试剂和稀释试剂到复杂的数据分析软件。完全整合的系统确保了精确的,可重现的检测结果，并通过统一的服务和技术支持保证了系统的测试效率。验证工具 Bio-Plex 悬液芯片系统符合21 CFR 的实验工具定制的 多重混合 服务现场维护检测开发试剂盒软件预混的 检验经验证的仪器Bio-Plex 悬液芯片系统多重分析的领先者2|Bio-Rad Laboratories2Bio-Plex 技术进展创新与经验10 多年的承诺、支持与参与Luminex 公司最大的合作伙伴全球超过 2000 台的安装引领生命科学与临床诊断研究硬件、软件、检测、服务与支持Commitment to xMAP Technology2005200420062003200720022008200120092000201020111997Commitment to xMAP TechnologyTGF-assayRat cytokine/Diabetes PanelMouse Th17 PanelReceived FDA clearancefor ANA screen/Bio-Plex2200 system.Launched three magnetic researchassay panels for diabetes,angiogenesis,and acute phase markers.Bio-Plex 3DBio-Plex Manager 6.0 softwareRaw Magnetic BeadsAnnounced Bio-Plex Prowash station.Released Bio-PlexManager 5.0 software.Bio-Rad licensedxMAP technology.Released Bio-PlexManager software.Bio-Rad received patenton magnetic beaduse in immunoassays.Released Bio-Plex Manager 2.0software 21 CFR Part II.Released Bio-Plex Manager 3.0software with high and lowPMT settings.Launched Bio-Plex 200 systemfor life science research.Installed Bio-Plex 2200system at first customer site.Launched first magneticresearch assays:Bio-Plex Pro andPrecision Pro assays.Launched over 80Bio-Plex Pro magneticcytokine assays.Launched Bio-Plex 100 systemfor life science research offeringcytokine assays.Launched Bio-Plexvasculitis panel;23 IVD assays now cleared by FDA.Launched phosphoprotein assays.多重分析的领先者www.bio-|33什么是 Bio-Plex 技术？整合专用的仪器和软件，容易使用的系统熟悉的 96 孔板检测流程同步定量分析一滴样品中多达 100 种不同的蛋白质、多肽、DNA 片段、和/或 RNA 片段Luminex 公司（xMAP 技术）授权的基于微球的技术可以进行任何含氨基化合物的微球偶联的灵活研究平台，用于溶液中的相互作用或检测使用基于微球的荧光检测技术微球上的检测Bio-Plex 系统技术的背后是使用了微球任何定位在固相底物上的检测都在微球上进行反应发生在微球表面时微球处于悬浮状态在 10ul 样品中悬浮的微球可超过一百万个颜色编码微球微球内部染上两种不同的荧光染料：红色和红外红色和红外两种荧光染料各使用了 10 种不同的浓度这样就产生了 100 种不同颜色比例的微球，并进行编码，从 1 号到 100 号 11091100多重分析的领先者4|Bio-Rad Laboratories3抗体偶联到微球上特异性抗体偶联到不同颜色的微球上每种颜色的微球指向一种特异的分析物这样微球的颜色就解决了分析物对特异性抗体的识别捕捉目标分析物偶联好不同抗体的不同颜色微球混合，与待检样品进行温育检测样品悬浮时，微球表面的探针分子与目标分析物结合未结合的分析物将在一系列的清洗步骤中去除 11091100132567881325678813256788多重分析的领先者www.bio-|53捕捉检测抗体生物素标记的检测抗体结合到目标分析物上温育后，未结合的检测抗体在一系列的清洗步骤中去除捕捉荧光报告分子荧光标记的链亲和霉素藻红素(SA-PE)报告分子结合到生物素标记的检测抗体上温育后，未结合的荧光报告分子在清洗步骤中去除仪器检测在 Bio-Plex 系统上测定反应好的待检样品染色的微球在鞘流路中序列推进仪器中红色激光（635nm 分类激光）测量微球内在染料并识别微球编码和分析物绿色激光（532nm 绿色报告激光）测量微球外荧光报告分子，以测定分析物浓度多重分析的领先者6|Bio-Rad Laboratories4为完善 xMAP 技术，Bio-Rad 研发了系统性能验证和校正的工具，以确保实验检测结果的准确性、重复性和可比性。系统校验校正操作由 Bio-Plex Manager 软件自动完成，结果储存在 Bio-Plex 数据库中。校验校正过程通过一个改进的维护、校正、验证板（MCV 板）自动执行，如下图，其中最重要的是报告激光验证和分类激光验证，这 2 项完整的验证通过与否决定了实验数据是否具有准确性、重复性和可比性。Bio-Plex 悬液芯片技术的特点xMAP 技术的领先者减少时间减少实验花费减少劳动力节约样品量，只需 50ul 或更少以及在同一孔里进行多重分析更好的重现性，以近似相同的液相动力学进行最少样品的操作 比荧光检测的比色方法更宽的动态范围和更高的灵敏度新生物标志物的快速筛选具有每孔而不是每块板的检测对照Bio-Plex 校验校正工具保证实验结果的准确性、重复性和可比性Bio-Plex 校验与校正工具悬液芯片技术的优点验证(Validation):光学模块验证：激光对准报告激光验证：使用 6 套微球进行模拟检测，验证仪器的线性、灵敏度、动态范围、斜率和信号的准确度(3)分类激光验证：验证微球分类的精确性，采用最边缘的和中间的 1、4、40、54 和100 号微球进行验证(4)鞘流路验证：孔间交叉污染2Bio-Plex Manager 6.0 软件自动化优化界面，优化后自动反馈评论标准曲线上鼠标位置自动显示有效定量范围，标准品、样品、背景和对照等信息Bio-Plex Manager 6.0 软件是功能全面的软件包，整合了系统控制、校验校正、数据采集和卓越的数据分析功能。其优点如下：兼容 Bio-Plex 100 和 200 系统一块板单次运行多个方法，如一部分细胞因子、一部分磷酸化蛋白等等标准品批次管理，无需手动输入标准品浓度值数据结果自动优化数据输出格式兼容性提高：XML 和 CSV，兼容 LIMS 数据管理系统Excel 表格数据结果输出包含标准曲线支持同一台电脑上同时安装 Luminex 的 IS2.3 软件，可进行基于该软件平台开发的数据分析软件，如 One Lamda 等Bio-Plex Manager 6.0 软件校正(Calibration)：将每次检测的信号输出标准化为已知的荧光信号 CAL1(微球分类与微球聚集体识别)(1)CAL2 模拟检测特异性信号报告(2)多重分析的领先者www.bio-|71 Bio-Plex 悬液芯片技术应用概述悬液芯片技术自发明以来的十几年中主要应用于三个领域：基因组学、蛋白质组学和临床诊断检测。在蛋白质组学领域的应用，悬液芯片技术显示出其巨大的优势，其操作与免疫检测技术（ELISA）几乎相同，已经广泛应用于蛋白质的表达谱，蛋白质翻译后修饰如磷酸化、糖基化，以及对蛋白质功能和相互作用的筛查研究中，主要领域有各种疾病、生理过程的细胞因子表达谱分析、聚焦蛋白质组学（focused proteomics）研究、转化医学、病理与药理和新药筛选等。在核酸检测方面，平板的 DNA 芯片技术广泛的用于高通量基因表达的平 行分析，但是由于一些特殊的 DNA 应用的出现，研究的范围可能仅限于某一类功能基因组，如某一类疾病的研究、SNP 分析验证、病原体检测、micro RNA 等，这类应用显然无需巨大通量的 DNA 固相芯片，而液相芯片更加合适，操作更加简便，芯片组的选择也更加灵活。而在临床诊断领域，悬液芯片是很好的疾病筛查、诊断和监控的工具，现已有广泛的应用，包括呼吸道病原体、肠道疾病病原体的筛查和检测，和一些疾病标志物的检测等等。关于悬液芯片技术在各领域的应用，详细如下表所示：综述 Bio-Plex 悬液芯片技术在生命科学与医学研究中的应用基因组学(Genomics)基因分型(Genotyping)基因多态性分析基因突变分析基于寡核苷酸微球的悬液芯片技术是高效率高通量的 SNP 分析平台（Ye et al.2001）；也是进行寡核苷酸配基检测（lannone et al.2000），单碱基突变分析（Chen et al.2000），以及聚合酶介导的寡核苷酸单碱基延伸检测（Cai et al.2000）的有效手段；也证明该技术是进行疾病特异性突变分析的有效手段（(Dunbar and Jacobson 2000,Ward et al.2002)。基因表达(Gene Expression)疾病标志物发育过程基因调控悬液芯片技术最适合进行较小通量的多重基因检测，如单次反应在 100 个以内，这只需要 1 小时即可完成 96 个样品的多重检测。蛋白质组学(Proteomics)蛋白表达谱分析(Protein Profiling)多重细胞因子检测对刺激和非刺激细胞、检验组和对照组的细胞因子定量分析已经是悬液芯片技术最普遍的应用。这些因子，包括细胞因子、趋化因子、生长因子和脂肪因子等，是一群细胞信号蛋白，对这些蛋白的同步检测能揭示细胞、组织或机体免疫反应的复杂机理。(Carson and Vignali 1999,de Jager et al.2003)。翻译后修饰细胞信号转导蛋白同步检测细胞内多重磷酸化蛋白是理解胞内信号转导所必需的，使用悬液芯片技术是更加高效的磷酸化蛋白的检测手段。(Gao et al.2003)。蛋白功能与相互作用(Iannone et al.2001)受体-配体结合酶活性蛋白-蛋白相互作用抗体交叉反应与特异性抗原表位扫描临床诊断(Clinical Diagnostics)分子诊断(Colinas et al.2000)SNP疾病相关突变检测HLA 分型多重免疫诊断血库(Smith et al.1998).传染性疾病筛查疫苗免疫效果筛查(Bellisario et al.2001,Prevost et al.2003).自身免疫检测过敏反应检测生物标志物检测（如激素、调控蛋白、多肽等等）(Bellisario et al.2000,de Jager et al.2003,Lukacs et al.2003).悬液芯片技术的应用5多重分析的领先者8|Bio-Rad Laboratories52 悬液芯片技术在多重蛋白质检测中的应用现在市面上有很多基于悬液芯片技术的蛋白检测产品，如 Bio-Rad 公司，包括有细胞因子、趋化因子、生长因子和脂肪炎性因子，磷酸化蛋白、总靶蛋白，以及一些疾病研究的试剂盒，包括糖尿病、血管生成、急性期以及抗体分型等等。早在 2002 年，Wilco de Jager 等就针对不同生理、类风湿性关节炎病理状态等不同样本 中的 15 种细胞因子进行表达谱的分析，之后使用 Bio-Plex 进行炎性因子表达谱分析的研究大量提高，应用于各种炎性相关疾病的研究中。如下表所示。这些试剂使用方便，已经广泛的应用于群体蛋白质组学、转化医学和新药筛选等领域中。Available TargetsBio-Plex Pro mouse Th17 PanelHuman CytokineMouse CytokineRat CytokineGroup IGroup II糖尿病Group IGroup IIGroup III糖尿病Group I糖尿病IL-1Basic FGFIL-1aMCP-3AdiponectinIL-1aIL-17IL-15IL-17AdiponectinEPOIL-12(p40)GhrelinIL-1raEotaxinIL-2RaM-CSFAdipsinIL-1bEotaxinIL-18IL-25(IL-17E)GhrelinG-CSFIL-12(p70)GLP-1IL-2G-CSFIL-3MIFC-peptideIL-2G-CSFBasic FGFIL-23GIPGM-CSFIL-13GlucagonIL-4GM-CSFIL-12(p40)MIGGhrelinIL-3GM-CSFLIFIL-27 p28GLP-1GRO/KCIL-17LeptinIL-5IFN-gIL-16b-NGFGIPIL-5IFN-gM-CSFIL-21GlucagonIFN-gIL-18PAI-1IL-6IP-10IL-18SCFGLP-1IL-6KCMIGICAMInsulinIL-1aM-CSFIL-7MCP-1(MCAF)CTACKSCGF-bGlucagonIL-9MCP-MIP-2IL-22LeptinIL-1bMIP-1aIL-8MIP-1aGRO-aSDF-1aInsulinIL-101(MCAF)PDGF-BBMIP-3aPAI-1IL-2MIP-2IL-9MIP-1bHGFTNF-bLeptinIL-12(p40)MIP-1aVEGFCD40LResistinIL-5MIP-3aIL-10PDGF-BBICAM-1TRAILPAI-1IL-12(P70)MIP-1bIL-33IL-6RANTESIL-12(p70)RANTESIPN-a2VCAM-1ResistinIL-13RANTESIL-31IL-7TNF-aIL-13TNF-aLIFVisfatinTNF-aIL-10VEGFIL-15VEGFIL-4IL-17Panel A.Group I(6-plex)Panel B.Group II(8-plex)Singleplex Assays.Group IIITGF-b AssaysIL-6IL-17FIL-25(IL-17E)TGF-b1IL-17AIL-23IL-27 p28TGF-b2IL-10IL-21ICAM-1TGF-b3IFN-gIL-22TNF-aMIP-3aIL-1bCD40LIL-33IL-31 Human Acute Phase Human Angiogenesis Human Isotyping a-2-macroglobulin Angiopoeitin-2 IgG1 CRP Follistatin IgG2 Ferritin G-CSF IgG3 Fibrinogen HGF IgG4 Haptoglobin IL-8 IgM Procalcitonin Leptin IgA SAA PDGF-BB IgE SAP PECAM-1 Tissue plasminogen activator VEGF Disease Research多重分析的领先者www.bio-|95Available AssaysCST antibodies exclusively developed and validated for Bio-Plex phosphoprotein and total target assays.Glucose/Energy Metabolism Chromatin Regulation/Acetylation Immunology/Inflammation Cell Cycle/Checkpoint Control Akt Signaling Assays Phosphoprotein Total Akt(Ser473)l l GSK-3a/b(Ser21/Ser9)l p53(Ser15)l l p53(Ser37)l l p53(Ser46)l l Histone H3(Ser10)l IkB-a(Ser32/Ser36)l l NF-kB p65(Ser536)l STAT2(Tyr689)l STAT3(Ser727)l STAT3(Tyr705)l STAT6(Tyr641)l Tyk2(Tyr1054/Tyr1055)l IGF-IR(Tyr1131)l IR-b(Tyr1146)l IRS-1(Ser636/Ser639)l2.1 悬液芯片技术与蛋白质组学研究蛋白质组学的范围是极其广泛的，传统的生物化学一般只研究一种蛋白质，其代表技术是色谱的分离纯化与分析、一维凝胶电泳分析、ELISA、Western blotting、蛋白质相互作用、晶体结构等等。然而，过去十几年来，两种技术的结合 _ 2D 电泳和质谱，产生了无偏的（Unbiased）或导向发现的（discovery-oriented proteomics）蛋白质组学。而在传统生物化学和蛋白质组学之间还有一种可称为“聚焦”蛋白质组学（focused proteomics）或者“导向系统的”蛋白质组学（System-oriented proteomics），这种蛋白质组学的代表研究技术就是悬液芯片系统。如下图所示(Gavin MacBeath,Nature Genetics 32,2002)。传统的蛋白质化学对单个蛋白的结构和功能有很清晰的了解，从而揭示其在细胞或机体中所扮演的角色，但却不能知道该蛋白质是否影响以及如何影响细胞或机体其它蛋白质表达，进而揭示细胞或系统整体性状的改变。虽然“无偏的”蛋白质组学往往可以做到这点，所谓“导向发现”的意思是可以获得一些导致差异（如不同发育、发展阶段，疾病与对照等）的未知蛋白质标志分子；但这种技术仍然有很多的局限性，例如定量问题、样品的通量问题、2D 电泳本身的重现性和灵敏度问题等等都限制了该技术的发现能力。例如在研究者准备分析一种特殊的生物样品，如癌症病人的肿瘤组织切片的研究中，不可避免的涉及一次“完全的蛋白质组学”分析，却存在样品中诸多如蛋白的丰度、修饰、活性、定位和相互作用的问题，因此在实际实验设计中，研究者往往只能限定于上述的一到两个参数，或者限定于整体蛋白质中的某一类，如炎性蛋白、血管生成标志蛋白、磷酸化蛋白等等。因此这种类型的实验其实是蛋白表达谱（expression profiling），现在已被广泛的称之为蛋白谱（Protein profiling）的分析。对于一组给定的样品，包括检测组understanding of individual proteinsunderstanding of biological processeselohw1proteomenumber of proteins under investigationtraditionalbiochemistryfocusedproteomicsunbiasedproteomics Neuroscience Translational Control Tyrosine Kinases MAP Kinase Signaling Assays Phosphoprotein Total ATF-2(Thr71)l l c-Jun(Ser63)l l ERK1(Thr202/Tyr204)l ERK2(Thr185/Tyr187)l l ERK1/2(Thr202/Tyr204,Thr185/Tyr187)l l HSP27(Ser78)ll JNK(Thr183/Tyr185)l l MEK1(Ser217/Ser221)l l p38 MAPK(Thr180/Tyr182)l l p90RSK(Thr359/Ser363)l l CREB(Ser133)l l TrkA(Tyr490)l p70 S6 kinase(Thr421/Ser424)l S6 ribosomal protein(Ser235/Ser236)l Bcr-Abl(Tyr245)l l c-Abl(Tyr245)l c-Abl(Tyr412)l EGFR(Tyr)l PDGF receptor-b(Tyr751)l Src(Tyr416)l 多重分析的领先者10|Bio-Rad Laboratories5和对照组，聚焦某一类蛋白质的蛋白谱的分析往往能导向新的发现。Martin Keller et al 于 2007 年研究了活化的 Caspase 1 是非传统蛋白质分泌的调节因子,所谓传统的蛋白质分泌途径是蛋白质经核糖体合成后，通过内质网/高尔基体途径，以小泡的方式与细胞膜融合，然后将蛋白质分泌到胞外；然而，某些蛋白质却不通过上述途径分泌到胞外，但其分泌机理却不清楚，这些途径称为非传统蛋白质分泌途径，比如一些炎性蛋白，像 IL-1b，IL-18 和 IL-33 等，这些炎性蛋白必须由 Caspase 1 的激活才有活性，为此，作者将 Caspase 1 进行 RNAi 处理，以研究该蛋白质在上述炎性蛋白质分泌过程中的作用。对角质化细胞进行 Caspase 1 的 RNAi 处理，以研究 Caspase 1 的功能。对 Caspase 1 的 RNAi 细胞和对照组细胞在培养过程中进行紫外照射，刺激其分泌细胞因子。然后测定这些样品的胞外、胞内的 27 种细胞因子。结果发现对照组的 IL-1b 胞外浓度是 Caspase1 RNAi 组的 3 倍，同时其它如 TNF-,IL-1,IFN-等细胞因子的对照组浓度也比 RNAi 组的高，这是因为这些蛋白质的表达和分泌受到细胞外环境中 IL-1浓度的影响。因此，这些结果为 Caspase 1 在非传统蛋白质分泌中的重要角色提供了重要的证据，通过这种机制，也说明应激诱导的 Caspase 1 活化与炎症和细胞保护、细胞存活、再生过程等直接关联。因此，对基于 RNAi 技术的功能基因组学或蛋白质组学的研究，除了传统的 Western blotting 或 ELISA 对单个蛋白质的表达进行分析以表征 RNAi 的效果，以及用 2D 电泳技术对整体蛋白质组学进行分析以表征 RNAi 之后整体蛋白质的表达谱以外，我们还可以用悬液芯片技术，对与研究相关的某一类蛋白质谱进行表征，以寻求之间表达的差异，从而揭示一些规律，应用该技术的好处是样品通量很大，可以单次做到几十个到几百个，这是 2D 电泳远远不能比拟的，单个样品一次可以同时测定几十种目标蛋白，另一个好处是分辨率很高，可以表征丰度低至 0.2pg 的蛋白质，还有一个好处是数据处理的自动化，是否有差异可一目了然。驱动发现的蛋白质组学研究路线基因组学基因组学蛋白质组学目标基因的功能生物标志物RNAi 平台蛋白质表达谱分析：2D 电泳技术Bio-Plex 悬液芯片Bio-Plex主要检测项目 细胞因子（免疫学相关）磷酸化蛋白（细胞信号转导）糖尿病标志蛋白和脂肪炎性因子（肥胖与糖尿病）癌症生物标志物 Bio-Plex 悬液芯片的蛋白质组学研究流程 LPS IL-10 PWM LPS/IL-10SupernatantTreated PBMCsCellsPhosphoproteinsSecreted cytokinesIntracellular cytokinesLysatePBMCsLysis and centrifugation多重分析的领先者www.bio-|1152.2 悬液芯片技术在转化医学中的应用转化或转换医学（Translational Medicine,Translational Research）是近 2、3 年来国际医学健康领域出现的新概念，其主要目的是为了打破基础医学与药物研发、临床医学之间固有的屏障，在其间建立起直接关联，从实验室到病床，把基础研究获得的知识、成果快速转化为临床上的治疗新方法。转化医学最早由 EA.Zerhouni 提出的 NIH 路线图计划（NIH Roadmap），提出将医学生物学基础研究成果迅速有效的转化为可在临床应用的理论、技术、方法和药物的概念。因此，转化医学具有 2 个层面的涵义，其一是将基础研究的结果直接用于临床，其二是实验室成果迅速产业化。因此转化医学具有双向、开放，提供新疗法、新药物，对疾病进程和特性提供反馈意见，以及“驱动临床研究引擎的激发器”等特点。早在 2005 年，Julio E.Celis 等就提出悬液芯片技术可作为“驱动发现”的乳腺癌转化型研究的标准技术。之后 Bio-Plex 悬液芯片技术广泛的用于转化医学的研究，这些研究主要聚焦在对不同样品，如疾病与对照等的各种炎性因子表达谱的分析，包括细胞因子、趋化因子、生长因子和脂肪因子等，从而找到能预警疾病、表征疾病不同发展阶段和指导用药的生物标志分子或标志分子的特定组合。最简单的例子是 Gerd G Gauglitz 等于 2008 年研究细胞因子是否能预测吸入式损伤的烧伤病人能否存活，其背景是在以往的案例中，吸入式损伤程度相同的病人采用同样的抢救措施，但有些病人能存活下来，而有些病人却不能存活。作者从炎症的角度出发，旨在寻找能预测存活的细胞因子。在一次火灾后，有 28 个伤员进入医院，经测定这些病人吸入式损伤程度相同或基本相同，在进入医院的 24 小时内对这些病人第一次采血，然后进行常规的抢救，经过 35 天，发现有 15 人存活，而另外 13 人却不能存活，这时对他们进行第二次采血，然后对这些血液样品同时测定 17 种细胞因子，结果发现在刚进入医院的 24 小时内，不能存活的 13个病人其 IL-4，IL-6，IL-7，IL-10 和 IL-13 的血清水平比存活组高出很多，经过统计学分析，作者得到结论，如果吸入式损伤的烧伤病人在刚进入医院 24 小时内其 IL-6，IL-7 和 IL-10 的水平比正常水平高出很多，则说明这类病人很可能不能存活，除了常规的抢救措施之外，必需采取更紧急有效的措施进行抢救。香港中文大学的 Vincent Wai-Sun Wong 于 2009 年研究 了中国人群中肥胖的乙肝病人的脂肪炎性因子(adipokine)和乙肝病毒对肝损伤的相互关系。全世界有 3.5 亿乙肝病人，而且其中不少会发展为肝硬化和肝癌。疾病的发展与很多因素有关，包括病人自身情况、病毒方面的因素、生活方式、以及病毒的超感染等。同时肥胖和代谢综合症在发达国家和发展中国家流行，近期数据表明代谢因素也会影响慢性乙肝的自然发展，而且已有研究表明患有代谢综合症的慢性乙肝病人具有更高的肝硬化和肝纤维化的风险，为此，作者研究了乙肝病人中脂肪炎性因子对肝损伤的作用，也研究了病毒方面的因素是否会影响脂肪因子、胰岛素抵抗和肝硬化等。脂肪炎性因子(adipokine)是脂肪组织分泌一系列生物活性蛋白，包括瘦素(leptin)、脂联素(adiponectin)、抵抗素(resistin)、TNF-、IL-6 等，这些蛋白质影响胰岛素抵抗和炎性。作者选择了来自香港Prince of Wales 医院的 266 个慢性乙肝病人，做组织切片，常规的临床检查，在实验室检测中则采用了 Bio-Rad 的糖尿病检测试剂盒检测这些样品的脂肪炎性因子。其中最主要的结果是 BMI 指数、腰围与血清中 adiponectin 负相关，大量的肝坏死与血清中升高的 TNF-和 IL-6 有关，而且这两种因子的高水平将促进肝癌发生，血液中的乙肝病毒量和病毒基因型与反常的 TNF-和 IL-6 水平无关，这说明脂肪炎性因子和乙肝病毒分别独立影响着肝损伤，最重要的是更高的 HBV DNA 将有更高的血清中 adiponectin，这有助于减少脂肪肝，因此慢性乙肝病人由于 adiponectin(脂联素)的升高而使代谢综合症的风险降低。这其实说明肥胖的乙肝病人中的脂联素与 TNF-和 IL-6 的水平存在一个平衡，一旦这个平衡被打破，如脂联素下降，则该肥胖病人将有更高的肝硬化和肝癌的风险。悬液芯片技术在用药指导的研究方面，南方医科大学附属珠江医院的肾移植研究所的刘占国等在 2008 年研究了全血细胞因子表达谱评估免疫抑制剂对人免疫的效果，寻求在临床上灵敏而准确的测定方法以评估移植病人的免疫状态，医师可以根据检测结果决定使用何种免疫抑制剂以及剂量，以降低排异或感染的发生。研究者对 3 个 2030 岁健康志愿者，抽血，血细胞 96 孔培养 3-12 小时，不同时间用不同试剂刺激，上清收集，-20 保存用于分析。然后用 Bio-Plex 悬液芯片同时检测 17 种细胞因子。结果表明：1.每多重分析的领先者12|Bio-Rad Laboratories5种免疫抑制剂具有独特的细胞因子谱标志，这有助于临床医师通过测定病人的细胞因子谱及时确定免疫抑制剂是否不足或过量；2.不同组合联合使用免疫抑制剂也具有独特的细胞因子谱；3.医师应该仔细而且快速的测定病人的细胞因子谱，以决定之后的免疫抑制剂的使用，从而减少排异或感染的发生；4.同步多重检测细胞因子对评估病人的免疫状态是非常强大的工具，尤其是不同类型、不同剂量和不同组合都有各自的细胞因子谱标志，这有助于临床医师及时调整药物类型和剂量；5.该技术也可应用于癌症、自身免疫疾病、或对免疫抑制剂的过敏紊乱等。除了上述的几个例子，悬液芯片技术在转化医学的其它各种疾病的研究都有广泛的应用，包括转移性黑色素瘤(Erika von Euw et al,2009)，肾细胞癌的疫苗治疗(Christiane Geiger et al,2005)，糖尿病的基因治疗(Susan L Samson et al，2008)，风湿等等。综上所述，转化医学的最重大的背景是机体内分子和细胞水平 的病变远远早于组织和器官的病变，而基于 Bio-Plex 悬 液芯片技术的转化医学可以回答或者部份回答是否早期已经发生分子和细胞水平的病变，其结果也可以指导医师决定用药，实现个性化治疗。因此，Bio-Plex 悬液芯片 技术是从分子和细胞水平进行转化型研究的重要手段。2.3 悬液芯片技术与病理和药理研究悬液芯片技术在病理领域的应用是最早也是最广泛的，主要是从炎性和细胞信号转导的角度阐明各种疾病的治病机理，特别是各种病原体的致病机理，如呼吸道疾病、炭疽杆菌等等，对于其它的疾病如肿瘤、糖尿病、自身免疫疾病如风湿、关节炎、红斑狼疮（Marije I.Koenders et al,2007,Fang Du et al,2008）等等也都有大量的报道。Jason E.Comer 等与 2005 年研究了体内炭疽毒素对T淋巴细胞活化的直接抑制，以阐明炭疽毒素的致病机理，在这之前已有科学家报道炭疽毒素对树突状细胞和巨噬细胞这两种抗原递呈细胞的抑制，但对 T 淋巴细胞还未有报道，但这对于炭疽毒素对机体免疫系统的作用机理却是至关重要的。作者采用小鼠模型，将致死毒素和水肿毒素两种炭疽毒素分别注射到小鼠身 上，然后取出 T 淋巴细胞进行原代培养，在培养过程中用抗 CD3 抗体和抗 CD28 抗体对细胞进行刺激，模拟体内抗原递呈作用以活化T细胞，然后用 Bio-Plex 悬液芯片检测细胞培养液的 18 种细胞因子。结果显示，与对照组相比，打了致死毒素的样品几乎所有的细胞因子的水平大大下降，有的甚至降到背景值，打了水肿毒素的样品的细胞因子也有不同程度的下降，而且细胞继续培养到 4 天，绝大部分的细胞因子的水平仍不能回复到正常水平。这说明打了炭疽毒素之后，T 淋巴细胞的活化受到直接的抑制，从而机体的免疫系统崩溃，为了进一步探索炭疽毒素直接抑制T细胞活化背后机制，以阐明免疫系统崩溃的原因，作者又用 Bio-Plex 悬液芯片技术同时检测了打两种炭疽毒素的 T 细胞的胞内病人选择病人选择结论个体化 用药统计学分析结论Markersprofile常规临床检验测定细胞因子谱 LPS IL-10 PWM LPS/IL-10SupernatantTreated PBMCsCellsPhosphoproteinsSecreted cytokinesIntracellular cytokinesLysatePBMCsLysis and centrifugation用于临床预测、诊断、治疗等Bio-Plex 平台转化医学研究的 2 种实验设计多重分析的领先者www.bio-|135多种磷酸化蛋白，以探索炭疽毒素对 T 细胞内信号转导的影响，结果发现，与对照组相比，打了致死毒素的样品中的 p-ERK、p-AKT、p-P38、p-GSK/、p-ATF-2 等 5 种磷酸化蛋白的磷酸化水平大大下降，而打了水肿毒素的样品p-JNK 的磷酸化水平也有一定程度的下降，从 T 淋巴细胞的信号转导途径上看，很多导向各种细胞因子如 IL-2 等的信号途径因炭疽毒素的作用而受到阻断，从而使信号不能传递给转录因子，从而引起各种细胞因子的表达大大降低。这就从细胞信号转导和转录水平阐明了炭疽毒素的致病机理，作者也说明这些结果能