香蕉长链非编码RNA_Ma...区域分析及上游调控因子筛选_李文彬.pdf
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1、 南京农业大学学报,():收稿日期:基金项目:海南省基础与应用基础研究计划(自然科学领域)高层次人才项目();国家重点研发计划项目()作者简介:李文彬,副研究员,研究方向为植物分子生物学,:。通信作者:孙建波,副研究员,研究方向为微生物学,:。李文彬,于晓玲,闫羿辰,等 香蕉长链非编码 启动子区域分析及上游调控因子筛选 南京农业大学学报,():,(),():香蕉长链非编码 启动子区域分析及上游调控因子筛选李文彬,于晓玲,闫羿辰,孙建波(中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业农村部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南省热带农业资源研究院,海南 海口;琼台师范学院,海南 海口)摘要:目目
2、的的 为了深入研究香蕉长链非编码 的功能和特性,对 的启动子顺式作用元件、病原菌响应模式及结合因子进行了初步的研究。方方法法 将 全长启动子()及从 端到 端序列互补的启动子片段()、()和()转入拟南芥,研究其在高盐和尖孢镰刀菌粗毒素胁迫下的响应模式;以 启动子 为诱饵,利用酵母单杂交技术筛选获得与该启动子结合的转录因子,并确定启动子的核心功能区。结结果果 的启动子包含多个与光照、病原菌、激素响应相关的顺式作用元件;所有启动子片段在尖孢镰刀菌粗毒素处理的 活性比高盐处理后更高,且 驱动下 的活性与全长 驱动下的活性相似;通过酵母单杂文库筛选到 个潜在的结合因子序列,其中双 结构的锌指蛋白 经
3、点对点酵母单杂交验证可与 和 互相结合。结结论论 的启动子对尖孢镰刀菌粗毒素比对高盐处理更敏感,筛选到 个锌指蛋白 可与启动子核心功能区()结合。关键词:香蕉;启动子;顺式作用元件;调控因子中图分类号:;文献标志码:文章编号:()(),(,;,):,()(),()(),():();南 京 农 业 大 学 学 报第 卷非编码()是指不编码蛋白质的。近年来的研究发现,它们在基因组中所占的比例随着物种进化水平的升高而增加,许多非编码 可以与蛋白、或 相互作用,参与多种细胞活动。非编码 根据长度分为 类:一类是小(,),长度一般在 ,包括小干扰(,)、蛋白结合(,)和(,);另一类是长度在 个核苷酸以
4、上的长链非编码(,)。其中,占非编码 的 以上,具有 尾巴与启动子结构,分化过程中有动态的表达与不同的剪接方式。长链非编码 在植物受到生物和非生物胁迫下的作用机制也是当下研究的热点之一。越来越多的研究证明 可以在表观遗传、转录及转录后等方面调控基因的表达,并广泛参与植物开花、雄性不育、营养代谢、生物与非生物胁迫等过程。基因表达决定了生物的多样性,基因转录的起始是基因表达的关键阶段,聚合酶与启动子的相互作用在基因转录起始中发挥重要作用,而启动子的结构影响它与 聚合酶的亲和力,进而影响基因表达的水平。启动子中所包含的特异性顺式作用元件对基因表达的组织特异性、作用强弱、时空表达的精确性及转录因子的结
5、合程度都非常关键,深入分析基因启动子的顺式作用元件可以全面了解基因的功能。近年来,许多研究已经证明顺式作用元件在调控基因启动响应生物 非生物胁迫方面发挥重要的作用。例如:类转录因子可以调控启动子中含有()元件的功能基因的表达,响应病原物、机械损伤或植物生长素的诱导;元件与 是基因中脱落酸()信号的响应元件;结合位点、热胁迫()、低温()、抗病与逆境胁迫应答()和增强转录水平等顺式作用元件,也被证明在植物受到逆境和非逆境胁迫影响时,可以诱导下游基因表达并激活相关代谢途径。真核生物的表达调控是多层次的,转录水平上的调控是植物基因表达调控的主要途径,启动子与转录因子的互作在转录水平调控中非常重要。转
6、录因子通过特异结合目标基因启动子区的顺式作用元件激活或抑制转录,调控目标基因的时空表达。在已有的研究中,大部分集中于转录因子对编码蛋白基因的调控作用,而对 的调控作用的研究相对较少。香蕉()为单子叶植物纲、姜目、芭蕉科、芭蕉属草本植物,是热带和亚热带国家重要的粮食和经济作物,因其口感香甜丝滑,富含蛋白质、碳水化合物、胡萝卜素、尼克酸及多种微量元素等受到人们的喜爱。香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(,)引起的土传性植物真菌性病害,病害严重,防治困难,尤其对 类且基因型为 的香蕉(如目前主栽品种巴西蕉)造成了致命性的打击,香蕉枯萎病业已成为当前危害香蕉生产的主要病害。近年来,香蕉与枯萎病菌互作机
7、制的研究越来越多,尤其是随着高通量测序技术和生物信息学的发展,发现了许多可能参与香蕉与枯萎病菌互作的,的功能研究对揭示互作机制将发挥重要的作用。基于前期转录组学的研究结果,我们选取了 个在枯萎病菌侵染后,在巴西蕉根部被显著上调表达的 命名为,初步证明过表达 的拟南芥对非生物胁迫更敏感,启动子序列、顺式作用元件及结合因子的研究对揭示该 的作用机制非常重要。本研究采用分段启动子研究的方法从 上游克隆了启动子全长 ,及 个互补片段(、和 ),通过在线序列分析软件对启动子不同片段的顺式作用元件进行分析;通过 报告基因研究 启动子对高盐和枯萎病菌粗毒素胁迫的响应模式,并初步确定核心启动子区域;利用酵母单
8、杂交文库筛选 的调控因子,挖掘潜在参与 调控的转录因子,为揭示 在香蕉枯萎病菌互作中的功能和调控机制提供理论参考。材料与方法 试验材料及试剂巴西蕉()由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供;尖孢镰刀菌古巴专化型 号小种(,)()由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所彭军老师惠赠;拟南芥野生型()由本实验室保存。载体购于宝生物工程(大连)有限公司;植物表达载体 含有 和,具有潮霉素抗性,由本实验室保存;大肠杆菌感受态 和农杆菌 购于上海唯地生物技术有限公 第 期李文彬,等:香蕉长链非编码 启动子区域分析及上游调控因子筛选司;植物总 提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、普通 酶购于
9、天根生化科技有限公司;高保真酶 购于宝生物工程(大连)有限公司;限制性内切酶、和 连接酶购于 公司;染色试剂盒购自 生物公司;培养基购于北京索来宝科技有限公司;酵母单杂交试剂盒、酵母培养所需的蛋白胨、酵母提取物、肌醇磷酸神经酰胺合成酶 抑制剂(,)、均购自 公司。酵母单杂交所用的二甲基亚砜购于 公司。引物合成及测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。启动子克隆及序列分析根据香蕉转录组和基因组数据序列信息,以巴西香蕉基因组 为模板,利用高保真酶扩增香蕉 上游 ()左右的序列。克隆鉴定成功后,根据 的序列信息,设计序列上互补的从端到 端的 个启动子片段,分别为()、()和(),使用 软件设计引
10、物,个启动子片段的引物见表。表 所有启动子片段克隆用引物 启动子 正向引物 ()反向引物 ()所有片段通过 和 双酶切连接到表达载体 上替换 启动子,位于 基因的前端,质粒构建成功后用于拟南芥的转化。拟南芥的转化参照 等的方法,含有表达载体的阳性单克隆于新鲜菌液过液培养后 离心,收集菌体,重悬液(,蔗糖溶液)重悬(),然后加入拟南芥转化辅助液(,),点花法改进为浸花,即将拟南芥的花序浸入悬浮液 ,保证在花心上看到菌液。暗培养 后转至正常光照培养,即 、短日照 、长日照 。收种后,根据潮霉素抗性进行转基因植株的筛选,获得抗性植株,种植后收种,再根据孟德尔遗传法则,获得各片段转基因 代纯合株系各
11、株。尖孢镰刀菌浸染巴西蕉参照 等的方法,采用伤根后菌块包裹的方法进行接种,尖孢镰刀菌块侵染后 和 后,取伤口上部 以上的根部。蛋白染色及定量分析将拟南芥整株置于 离心管中,加入 染色液 ,避光染色 ,然后以 乙醇脱色至叶绿素完全脱掉,于基恩士()超景深三维立体显微镜 下观察拍照。蛋白活性测定参照试剂盒进行。先制备标准曲线,用于检测样品蛋白含量。取新鲜样品提取蛋白,取 蛋白上清液,加入 预热的 提取缓冲液,再加入 底物,温浴。于、和 分别取混合反应物 加入 反应终止液,室温避光保存。于激发波长 、发射波长 下,测定不同时间点的荧光强度值,计算单位质量蛋白在单位时间的荧光强度变化值。尖孢镰刀菌粗毒
12、素的提取参照许文耀等的方法,将 菌块于 (马铃薯和蔗糖 于水中煮 后,定容至 ,灭菌)中培养 ,离心 ,取上清液,用 滤膜过滤除菌,再用 滤膜过滤,镜检无孢子即为粗毒素,然后于冷冻干燥器中浓缩至 (浓缩 倍),后续备用。非生物胁迫处理高盐胁迫:拟南芥种子消毒后播种于含 的 培养基中,光照 ,发芽生长。尖孢镰刀菌粗毒素处理:拟南芥种子消毒后播种于含 粗毒素的 培养基中,光照 ,发芽生长 。南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 酵母单杂交试验诱饵载体构建:启动子 和 与 载体以 和 双酶切后连接构建诱饵载体 和,转化大肠杆菌,提取阳性克隆进行 和双酶切鉴定,并进行测序。诱饵载体 和 转化酵母菌株:
13、以 酶线性化诱饵载体和阳性对照质粒,转化 酵母感受态细胞,并取 菌液涂布于 的培养基上,培养 。利用 进行阳性克隆鉴定,取诱饵阳性克隆和阳性对照克隆,涂布于含不同浓度 的 培养基上,进行 抑制浓度的筛选。香蕉根高质量 文库构建:以受到枯萎病菌侵染 和 的香蕉根部为研究对象,提取总,加上 接头后,经 逆转录合成 第 链,利用长距离()扩增技术合成双链,并用 琼脂糖凝胶电泳进行检测,最后用 层析柱进行纯化,参照 试剂盒说明书构建。启动子 互作蛋白筛选:将香蕉根 文库和 线性化质粒共转化阳性诱饵菌株 感受态细胞,将约 酵母细胞转化液按每皿 涂布于 ()培养基上,培养 ,挑选阳性克隆至 液体培养基扩大
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