化学发光原理及应用省名师优质课赛课获奖课件市赛课一等奖课件.ppt

,Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,化学发光原理及其应用,第1页,主要内容,化学发光基本原理,化学发光分析方法,常见化学发光体系及其分析应用,第2页,Part I.,化学发光基本原理,一、化学发光原理,：伴随化学反应光发射现象,一些物质在进行化学反应过程中，因为吸收了反应产生,化学能,而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长光，这种吸收化学能使分子发光过程称为,化学发光,(,chemiluminescence),。,化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称,生物发光,(,bioluminescence)。,生物发光本质是化学发光,第3页,1877年 洛粉碱,CL,1905,年 洛粉碱类似物,1928年 鲁米诺,1935年 光泽精,1960,s PMT,出现,发觉许多有机反应可产生,CL,生物体化学发光现象研究起源于古代，不过，直到十九世纪末，这种现象与简单有机反应相联络才得到解释。,第4页,化学反应,-,G,化学发光,h,荧光产生原理,入射光(,h,1,),激发下光发射现象,化学发光原理,化学反应释放能量(,-,G,),使基态物质被激发而产生后续光发射现象,入射光,h,1,荧光,h,2,磷光,h,3,1.化学发光对应能级跃迁,化学发光包含化学反应、能量传递以及后续激发态弛豫(与荧光一致)三个过程,第5页,2.化学发光光谱,化学发光光谱与发光体荧光发射光谱含有对应关系,第6页,化学发光光谱中防止了激发光源干扰,第7页,二、化学发光反应发生条件,化学反应是放热反应。,化学反应自由能改变与发光波长关系:,G,h,/,ex,2.857 10,4,千卡/,ex,摩尔,400750,nm,可见光发射时所需要,G,数值应在3871千卡(,170300 kJ/mol,),之间。,必须存在形成电子激发态通道。,激发态分子必须以辐射光子形式回到基态,或将能量传递给荧光分子。,能量，通道，荧光物质,第8页,2.化学发光反应,直接化学发光,A +B,C*+D,C*,C +,h,1,间接化学反应发光,A+B,C*+D,C*+F,F*+C,F*,F+,h,2,*,*,*,第9页,电致化学发光现象,电致化学发光(,ECL),是经过在电极上施加一定波形电压或电流信号进行电解反应产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光现象。,多环芳烃化合物含有电致化学发光特征,9,10-,二苯基蒽,将,200,Hz,左右方波电位,(+1.3,-2.2,V,vs,.SCE),加到电极,DPA-e,DPA,.,+,(+1.3 V),DPA+e,DPA,.,-,(,-2.2 V),DPA,.,+,+DPA,.,-,1,DPA*+DPA,1,DPA*,DPA+,h,(,=512nm,),+1.3,V,-2.2,V,第10页,三、化学发光表征,光谱：,仅取决于体系激发态,动力学曲线（反应时间）,化学发光强度,化学发光强度取决于发光过程量子产率(,cl,),反应速率(,dc/dt),量子产率：,凡是影响激发态荧光量子产率原因都将对化学发光量子产率产生影响,影响化学发光反应速率物质也将影响体系化学发光强度,灵敏度高，响应物种数多，不过选择性差,第11页,Part II.,化学发光分析法,使,R,过量,C,A,(t),=C,A,0,e,-k,t,I,cl,(t)=,cl,V,=,cl,kC,A,(t),=,cl,k,C,A,0,e,-k,t,尽管,A,物质,C,A,0,各不相同,但,I,到达,I,max,时间相同.,e,-kt,为常数.,I,cl,(t),C,A,0,定量分析依据,d,c,A,d,t,kRA,V=,任何对此过程产生影响物质浓度都可能用化学发光法测定,一、化学发光分析法原理,第12页,二、化学发光分析法流路,1.分立式进样化学发光仪,PMT,R1,R2,s,这类仪器适合于选择性好,量子效率高或发光体寿命长化学发光反应监测。,不适合用于快速化学发光反应(15,S),重现性监测。,暗室,第13页,2.流动注射进样化学发光仪,几乎适合用于全部 15,s,快速化学发光反应,而且能够增加适当延迟流路或采取停流技术以适应长寿命化学发光反应，所得化学发光强度能够随时间积累,样品,sample,waste,PMT,recorder,蠕动泵,流通池(,flow cell),试 剂 瓶,暗室,第14页,3.,HPLC-CL,联用,技术,流动相,A,流动相,B,高压泵,高压泵,混合器,进样阀,色谱柱,试剂1,试剂2,混合器,混合反应,DAD,检测器,废液,滤光片,流动池,光电倍增管,统计,将化学发光高灵敏度特点与,HPLC,高分离效率优势结合，能够应用于复杂体系中各种痕量物质定量分析，普通不需要复杂衍生过程,暗室,第15页,Part III.,常见化学发光体系及其,分析应用,鲁米诺化学发光体系,吖啶酯类化学发光体系,过氧化草酸酯类化学发光体系,无机物化学发光体系,碱性高碘酸钾,酸性高锰酸钾,酸性硫酸铈,稀土配合物(中性),其它化学发光体系,第16页,一、鲁米诺(,luminol),化学发光体系,量子产率：,0.150.05,氧化剂:,H,2,O,2,O,2,KMnO,4,NaClO I,2,Fe(CN),6,3-,.,催化剂:,过氧化酶 氧化血红素 过渡金属离子(,Cu,2+,、Mn,2+,、Co,2+,、V,4+,、Fe,2+,、Fe,3+,、Ni,2+,、Ag,+,、Au,3+,、Hg,2+,etc,.,),间接测定：,在生物酶作用下与,O,2,生成,H,2,O,2,葡萄糖和氨基酸,以及对应,酶,OXIDANT,BASE,luminol,*,3-,Aminophthalate,+,h,3-,APA,1.化学发光原理氧化还原型,max,=425 nm,第17页,2.邻菲罗林(1,10-,phenanthroline),氧化剂:,H,2,O,2,催化剂:,Cu,2+,Co,2+,Pb,2+,Fe,3+,Ni,2+,抑制剂:,蛋白质与,Cu,2+,形成络合物,第18页,二,、,吖啶酯类,化学发光体系,代表性物质：光泽精(,lucigenin),氧化剂：,H,2,O,2；,还原剂+,O,2,还原剂：,乳酸 尿酸 抗坏血酸,催化剂：,过渡金属离子、酶,抑制剂：,酚类物质对此反应有抑制作用,间接测定：,能够生成,H,2,O,2,基质,及对应,酶,max,=445 nm,量子产率高，易于标识，是发展化学发光免疫分析和,DNA,发光探针主要标识物,第19页,三,、,过氧化草酸酯(,TCPO),类,化学发光体系,化学发光原理能量传递型,氧化剂：,H,2,O,2,背景发光：,max,=440 nm,550nm,发射波长：,取决于共存荧光物质,第20页,四,、,碱性高碘酸钾,化学发光体系,氧分子正确发射：,490 500,nm,CO,2,双分子发射：,430 450,nm,化学发光原理活性氧中间体型,林金明,Analytical Chemistry,多酚类物质对该体系化学发光有增强作用,第21页,五,、,酸性高锰酸钾,化学发光体系,1.KMnO,4,还原剂,CL,体系,KMnO,4,+Red,Intermediate(,激发态),直接,CL,Fluorophore,Fluorophore(,激发态),间接,CL,还原剂：,氨基酸、,SO2、,碘、药品、毒品等含有还原性物质,量子产率不高，能够加入强还原性物质增强体系灵敏度,能够测定化学需氧量,Talanta,61,651-658,第22页,六,、,其它,化学发光体系,1.,高价铈,CL,体系,Chemiluminescence of Ce(IV)and surfactant Tween 20,Analyst,126,553,一些多酚类和胺类物质对该体系有增强和抑制作用,Organic Compounds,*,Organic Compounds,*,Salicylic acid,+773,Chlorogenic acid,+31,Sulphosalicylic acid,+797,Ascorbic acid,+28,2,4-,Dihydroxybenzoic acid,+557,2,4-,Dinitrophenol,*,Phloroglucinol,+408,Benzoic acid,*,m-Nitrophenol,+326,Tannic acid,-88,Resorcinol,+296,Gallic acid,-91,p-Hydroxybenzoic acid,+276,4-,t-Butylpyrocatechol,-92,o-Nitrophenol,+115,Pyrogallol,-127,Phenol,+96,Dopamine,-42,Rutin,+80,Aniline,*,Catechol,+73,p-Phenylendiamine,*,3,4-,Dihydroxybenzoic acid,+69,第23页,2.,气相,CL,体系,Journal of Chromatography A,842(,1999,)267308,以,N,氧化物为例,O,3,+NO,O,2,+NO,2,*,NO,2,*NO,2,+,h,v,(,=6002800 nm,),Light intensity NO,Measurement of NO,2,3NO,2,+Mo,3NO+MoO,3,(reduction),Total NO(initial+reduced NO,2,)=NO,x,NO,2,=NO,x,NO,450,C,(Catalyst),第24页,臭氧法测定,N,氧化物,能够与臭氧反应产生化学发光物质：,不饱和脂肪烃和芳香族化合物；,含有,N，S,等杂原子化合物；,卤代有机酸和卤代烷烃；,N,氧化物和,CO；,金属有机化合物；,细菌。,第25页,3.萤火虫发光(,firefly BL),max,=562 nm,此反应主要分析对象是,ATP 10,-11,10,-14,mol,4.,细菌发光(,bacterial BL),还原型吡啶核苷酸黄素,主要分析物,FMN 10,-12,mol,此反应惯用于,NADH,和,NADPH,试验 10,-15,mol,max,=490nm,第26页,5.,化学发光免疫分析,竞争法,：,（检验小分子抗原多采取）,开启发光试剂,Ag,+,Ag-L,+,Ab,Ag-Ab,+,Ab-,Ag-L,h,首先将待测抗原与,CL,标识抗原混合均匀，再与抗体发生,竞争反应,结合，并将未被吸附抗原洗掉。因为抗体浓度已知，标识抗原浓度能够由化学发光强度测定，二者差值即被测抗原浓度。,第27页,化学发光免疫分析仪,第28页,本章小结：化学发光分析特点,不需要外部光源,：,消除了入射光干扰(瑞利散射和拉曼散射)。,克服了光源不稳定而造成波动缺点，降低了噪声，提升了信噪比。,灵敏度高,(通常可达,ng,级或,pg,级)。,线性范围宽,(通常可达三个数量级)。,设备简单、分析快速、易实现自动化,。,不足：,方法选择性较差、发光体系相对较少、仪器商品化不够,第29页,无机物,无机离子,N,氧化物,含,S,化合物,有机物,烃、多环芳烃,醇、多酚、醛、酮、酸、酯,杂环化合物和生物酶,聚合物,活性氧,纳米粒子：,半导体纳米量子点和金属纳米粒子,本章小结：化学发光法分析对象,直接发光,增强抑制作用,第30页,