细菌素QY-C与虾青素复合纳米脂质体制备及其特性评价_李啟彬.pdf
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1、研究报告 年第 卷第 期(总第 期):引用格式:李啟彬,吕丽铙,富思逸,等 细菌素 与虾青素复合纳米脂质体制备及其特性评价 食品与发酵工业,():,():细菌素 与虾青素复合纳米脂质体制备及其特性评价李啟彬,吕丽铙,富思逸,刘颖,张静,(广东海洋大学 食品科技学院,广东省水产品加工与安全重点实验室,广东省海洋食品工程技术研究中心,广东省海洋生物制品工程实验室,水产品深加工广东普通高等学校重点实验室,广东 湛江,)(海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心(大连工业大学),辽宁 大连,)摘 要 该研究以细菌素 和虾青素为活性物质,包封率为评价指标确定虾青素和细菌素 的添加量,采用反相蒸发法制
2、备细菌素 与虾青素复合纳米脂质体。采用纳米粒度电位仪测量其表征,傅里叶红外光谱分析虾青素与细菌素的包埋情况,最后评价抗氧化活性和抑菌活性。结果表明,制备获得的复合纳米脂质体的粒径(),多分散指数(,)值()以及 电位()个表征指标良好,并且对细菌素与虾青素的包封率均达到了 以上。红外光谱(,)的分析显示,虾青素与细菌素 均被成功负载到复合脂质体中,并且没有出现新的吸收峰,判断复合纳米脂质体包埋方式为物理包埋。对 自由基和 阳离子自由基的清除率分别为 与 ;最小抑菌浓度(,)为 ,效价为 。该研究制备的细菌素 与虾青素复合纳米脂质体包封率高、粒径小、稳定性好、抗氧化与抑菌活性强,表明在食品防腐保
3、鲜领域具有潜在的应用前景。关键词 虾青素;细菌素;纳米脂质体;抑菌活性;抗氧化活性第一作者:李啟彬(硕士研究生)和吕丽铙(本科生)为共同第一作者(张静高级实验师为通信作者,:)基金项目:广东海洋大学创新创业训练计划项目();广东省科技计划项目()收稿日期:,改回日期:在食品加工和运输过程中,由于受到外界环境的影响,食品极易发生氧化褐变与腐败变质。食品一旦被氧化,就会产生酸败与褐变等现象,严重影响感官和品质。因此,食品工业上常通过添加抗氧化剂提高食品的稳定性。同时,由于食品中含有丰富的营养成分,环境中的微生物在适宜条件下迅速繁殖,造成食品腐败变质,甚至引起食物中毒。因而添加防腐剂防止食品腐败是最
4、有效的措施。目前,食品防腐剂与抗氧化剂是食品工业不可或缺的食品添加剂,但大多为化学合成物质,远远不能满足消费者对食品安全的要求,因此,寻找天然无害的抗氧化剂和食品防腐剂迫在眉睫。细菌素是微生物核糖体产生的一种抗菌多肽类物质,大多数细菌素对许多腐败菌和致病菌都有很强的抑制作用,作为一种天然无害的生物源食品防腐剂已被逐渐应用于食品行业。前期研究发现,耐久肠球菌 产的细菌素 能抑制多种食源性致病菌和腐败菌,能在食品中起到防腐保鲜作用,是化学防腐剂的优良替代物。但是细菌素在防腐应用时易与食品体系中的脂肪、蛋白质等复杂成分相互作用,影响其防腐效果。另外,虾青素是天然强氧化剂,有“超级维生素”的称号,它能
5、有效避免细胞因自由基引起的氧化反应所带来的伤害。但是虾青素结构中的长链不饱和双键和 羟基酮电子效应非常活泼,极易在不利的环境因素(高温、光照、氧气、环境 等)下降解,影响其抗氧化活性。同时,虾青素不溶于水,其生物利用率较低,无法很好地在食品中发挥其抗氧化能力。纳米脂质体是一种油包水结构的纳米双层囊泡,其高度有序的结构能够将虾青素与细菌素 分别包埋在脂层与水层中,且互不影响,对两种物质的活性均起到很好的保护作用,从而提高活性物质的有效利用。为了维持纳米脂质体的稳定性,常使用具有潜在健康危害的胆固醇作为稳定剂,最新的研究发现虾青素也可作为纳米脂质体的稳定剂,提高纳米脂质体稳定性,进而提高了脂质体的
6、安全性。本研究采用纳米脂质体技术制备细菌素 与虾青素复合纳米脂质体,并从包封率、表征、抑菌能食品与发酵工业 ()力与抗氧化性方面进行评价,为细菌素 与虾青素复合纳米脂质体的制备和应用提供依据,以期制备一种新型的食品防腐保鲜添加剂,为食品安全提供新的解决方案。材料与方法 材料 实验菌株耐久 肠 球 菌 (:),团队分离自中国南海海域牡蛎,用于生产细菌素;单增李斯特菌(),用作指示菌。实验试剂营养肉汤(,)、营养琼脂(,)、肉汤培养基,北京陆桥技术股份有限公司;二氯甲烷、乙酸乙酯、无水乙醇,佛山西陇化工有限公司;大豆卵磷脂、试剂盒,生工生物工程(上海股份有限公司);虾青素,北京索莱宝科技有限公司;
7、细菌素,实验室制备;、,上海麦克林生化科技有限公司;过硫酸钾,上海阿拉丁生化科技有限公司;磷酸二氢钠、硫酸氢二钠,广东光华科技股份有限公司。仪器与设备 纳米粒度电位仪,英国马尔文仪器有限公司;旋转蒸发仪,上海爱朗仪器有限公司;台式高速冷冻离心机,湖南赫西仪器装备有限公司;全自动酶标仪,美国赛默飞世尔科技公司;冷冻干燥机,东京理化器械株式会社;傅立叶红外光谱仪(,),上海上天精密仪器有限公司;氮吹仪,上海安谱实验科技股份有限公司;均质机,德国海道尔夫公司;超声波清洗器,上海生析超声仪器有限公司;高压蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;超净工作台,苏州净化设备有限公司。实验方法 细菌素 的制备将甘油保
8、存的菌株 接种于灭菌的 培养基,于 恒温摇床 培养 活化,连续活化 代,接种(,体积分数)于灭菌的 液体培养基中,培养。将 的发酵液在 条件下 离心,收集上清液。将发酵上清液与等体积乙酸乙酯混合,置于摇床 萃取 ,收集上层乙酸乙酯,下层水相再用等体积的乙酸乙酯萃取 次。收集有机相,混合,使用旋转蒸发器除去乙酸乙酯,加入超纯水重新溶解,真空冷冻干燥后,产物即为细菌素,于 保存备用。空白纳米脂质体的制备用反相蒸发法制备纳米脂质体体系。避光环境下,精确称取 的大豆卵磷脂置于 铝箔密封的锥形瓶中,加入 二氯甲烷,超声至固体完全溶解。将锥形瓶转移至均质机,冰水浴条件下提高转速至 ,往溶液中缓慢加入 超纯
9、水。完全加入后,均质,得到均匀不分层的乳白色油包水(,)乳液。转至棕色圆底烧瓶中,旋转蒸发(,)除去二氯甲烷,至烧瓶底部形成一层高黏性凝胶,然后加入 超纯水于烧瓶中,超声处理至凝胶完全脱落。有机凝胶完全悬于水中后,反复超声()缩小粒径,开,停,重复进行 次。接着,使用纳米脂质体挤出器过 聚碳酸酯膜,来回共 次,得空白纳米脂质体。虾青素最佳添加量的确定避光环境下,称取 虾青素于 棕色瓶,加入 乙酸乙酯,振荡至完全溶解,制得 虾青素溶液,再用乙酸乙酯依次进行 倍稀释,质量浓度梯度分别为、,使用全自动酶标仪在 处测定吸光值。用 软件对数据进行线性拟合,建立虾青素浓度吸光值标准曲线的回归方程(),如公
10、式()所示:()式中:,虾青素质量浓度,;,处的吸光值。同 方法,分别在称取大豆卵磷脂的同时加入虾青素 、,制备不同虾青素添加量的虾青素脂质体。制得的脂质体悬液以 、离心 ,收集上层清液,加入等体积的乙酸乙酯,经涡旋振荡后萃取 ,收集上层乙酸乙酯,并加入等体积乙酸乙酯再次萃取。收集的乙酸乙酯混合,使用全自动酶标仪在 处测定吸光值,结合公式()计算未被负载的游离虾青素,根据公式()计算得虾青素纳米脂质体的包封率:虾青素包封率 加入的虾青素 游离的虾青素加入的虾青素()研究报告 年第 卷第 期(总第 期)其中将包封率最高的虾青素纳米脂质的添加量作为复合纳米脂质体虾青素的最佳添加量,并将包封率最高的
11、虾青素纳米脂质样品保存至 冰箱,以备后续作为各种指标测定的对照。细菌素 最佳添加量的确定用超纯水将细菌素 梯度稀释,采用改良型 法测定蛋白浓度,用全自动酶标仪在 处测定吸光度值,用 软件对数据进行线性拟合,建立细菌素 浓度吸光值标准曲线的回归方程(),如公式()所示:()式中:,细菌素 质量浓度,;,处的吸光值。同 方法,但用 的 细菌素不同质量浓度(、)水溶液替代超纯水进行均质,制备不同细菌素浓度的 纳米脂质体。制得的脂质体悬液以 、离心 ,收集上层清液,采用改良型 法测定游离的细菌素浓度,用全自动酶标仪在 处测定吸光度值,结合公式()计算细菌素 的量,根据公式()计算得细菌素 纳米脂质体的
12、包封率:细菌素 包封率 加入的细菌素 游离的细菌素加入的细菌素()其中将包封率最高的细菌素 纳米脂质体的添加量作为复合脂质体细菌素的最佳添加量,并将包封率最高的细菌素纳米脂质体样品保存至 冰箱,以备后续作为各种指标测定的对照。复合纳米脂质体的制备将测得的包封率最高的虾青素添加量和细菌素 添加量,按 方法制备细菌素 与虾青素复合纳米脂质体。复 合 纳 米 脂 质 体 的 粒 径、多 分 散 指 数(,)值及 电位测量采用马尔文 测量纳米脂质体的粒径、值和 电位。制备好的纳米脂质体悬液用超纯水稀释(,体积分数)后,用动态光散射法(,)测定平均粒径和,用激光多普勒微电泳法测定 电位,检测 次。复合纳
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