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西湖龙井产区茶树炭疽菌分离鉴定及其植物源抑菌剂筛选_李红莉.pdf
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1、茶叶科学 2023,43(2):194204 Journal of Tea Science www.tea- 收稿日期:2022-11-21 修订日期:2023-01-29 基金项目:杭州市农业与社会发展科研专项(20201203B93)、浙江省(茶树)农业新品种选育重大科技专项(2021C02067-4)、杭州市农科院创新基金项目(2022HNCT-04)、财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-23)作者简介:李红莉,女,农艺师,主要从事茶树病虫害绿色防控技术研究。*通信作者:; 西湖龙井产区茶树炭疽菌分离鉴定 及其植物源抑菌剂筛选 李红莉,周铁锋*,毛宇骁,黄海涛
2、,崔宏春,郑旭霞,赵芸*杭州市农业科学研究院,浙江 杭州 310024 摘要:为筛选出对西湖龙井产区茶树炭疽病菌具有较好抑菌活性的植物提取物,对该地区的茶树炭疽病菌进行了分离鉴定,采用菌丝生长速率法测定了 12 种植物提取物的抑菌活性,进一步采用浓度梯度试验测定了 3 种抑菌活性较好的植物提取物的抑菌毒力。研究结果表明,引起西湖龙井产区茶树炭疽病的主要病原为山茶炭疽菌(Colletotrichum camelliae);在 200 mgL-1时香荆芥酚、牛至精油和紫苏醛对该菌的抑菌活性较好,菌丝生长抑制率均在 68%以上,有效中浓度(EC50)分别为 71.459、77.155、110.753
3、 mgL-1。显微观察发现,在添加有效中浓度的香荆芥酚、牛至精油和紫苏醛的培养基上进行病原菌培养时,菌丝形态发生明显改变,呈现变形扭曲、皱缩干瘪等现象。综上所述,香荆芥酚、牛至精油和紫苏醛对山茶炭疽菌具有较强的抑菌活性,具有开发为植物源杀菌剂的应用潜力。关键词:茶树;炭疽菌;植物提取物;抑菌活性;毒力测定中图分类号:S571.1;S435.711 文献标识码:A 文章编号:1000-369X(2023)02-194-11 Isolation and Identification of Anthracnose Pathogen from Xihu Longjing Plantation and
4、Screening of Its Plant-derived Fungicides LI Hongli,ZHOU Tiefeng*,MAO Yuxiao,HUANG Haitao,CUI Hongchun,ZHENG Xuxia,ZHAO Yun*Hangzhou Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310024,China Abstract:In order to screen out plant extracts with better antibacterial activity against anthracnose in Xihu Lo
5、ngjing tea producing area,the pathogens of tea anthracnose in this region were isolated and identified,and the inhibition activities of 12 plant extracts on the identified pathogen were determined using mycelial growth rate method.Concentration gradient test was further used to determine the antibac
6、terial virulence of the top 3 plant extracts.The results show that Colletotrichum camelliae was the major pathogenic strain in the study region.At the concentration of 200 mgL-1,the antifungal activities of vitriol,oregano essential oil and perillal aldehyde were better,and their inhibition rates on
7、 the growth of anthrax were all above 68%,and their effective medium concentrations(EC50)were 71.459,77.155 mgL-1 and 110.753 mgL-1,respectively.Microscopic observation shows that the mycelium DOI:10.13305/ki.jts.2023.02.0102 期 李红莉,等:西湖龙井产区茶树炭疽菌分离鉴定及其植物源抑菌剂筛选 195 morphology of C.camelliae had obviou
8、s changes in the medium when supplemented with above plant extracts,showing deformation,distortion,shrinkage and shriveled.These results indicate that carvacrol,oregano essential oil and perill aldehyde have strong antibacterial activities against C.camelliae and possess potential for development as
9、 plant-derived fungicides.Keywords:tea plant,anthracnose,plant extract,antifungal activity,toxicity determination 茶树Camellia sinensis(L.)O.Kuntze起源于中国,茶叶中富含茶多酚、咖啡碱、茶氨酸等多种功能性成分,具有良好的保健功效,深受消费者喜爱1-2。茶树病虫害是茶叶高产优质的重要限制因素,其中炭疽病是茶树叶部的主要真菌病害之一,在我国各茶区均有发生。西湖龙井茶产区温暖湿润的气候利于炭疽病发生蔓延,主栽品种龙井 43 易感炭疽病,近年来发病率逐年上升3。
10、受害茶树叶片轻则出现灼烧状病斑,重则造成大面积叶片脱落和植株枯死,严重影响树势和茶叶品质,造成巨大的经济损失4-5。我国已报道的茶树炭疽菌有 16 个种及 1 个未鉴定种,包括异国炭疽菌(Colletotrichum alienum)、隐秘炭疽菌(C.aenigma)、尖孢炭疽菌(C.acutatum)和博宁炭疽菌(C.boninense)等6。不同种的炭疽菌具有不同的地域分布,对茶树的致病力及对防治药剂的敏感性存在一定的差异,因此明确茶树炭疽菌的种类是开展防治技术研究及抗病品种选育的关键。目前防治茶树炭疽病仍以喷施苯并咪唑类、三唑类等化学农药为主,不仅防效难以保障,还易引起茶叶农残超标、病原
11、菌抗药性增强及茶园生态环境破坏等一系列问题。近年来,农药残留超标已成为影响我国茶叶出口的主要因素之一7。针对茶树病虫害开发绿色高效的生物农药迫在眉睫。植物提取物因其源于自然植物资源,具有环保低毒、易降解、对非靶标生物相对安全及不易产生抗性等优点,其相关研究越来越受到人们的重视8。目前,研究报道较多的天然植物提取物主要有挥发油(精油)、黄酮类、生物碱、多糖类等。植物精油是存在于芳香植物的叶、根、皮、花和果中的一类重要的次生代谢产物。其成分主要包括萜类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物和含氮含硫化合物等9。很多研究表明,植物提取物具有抑菌、杀虫、杀螨、驱虫和抗氧化等活性10-12。在美国、以色列等
12、很多国家均有植物提取物类农药投入市场,用于温室作物、园林花卉的病虫害防治。本研究从西湖龙井茶产区龙井 43 茶园的炭疽病叶片中分离优势致病菌,通过传统形态学方法并结合多基因系统发育分析对病原菌进行鉴定,以分离得到的山茶炭疽菌(C.camelliae)为靶标,采用菌丝生长速率法测定 12 种植物提取物对山茶炭疽菌的抑菌活性,筛选出 3 种效果相对较好的植物提取物进行抑菌毒力测定,并通过显微观察初步探究其抑菌机理,以期为茶树炭疽病天然绿色农药的研制提供参考。1 材料与方法材料与方法 1.1 试验材料 供试茶树炭疽病病叶于 2021 年 6 月在梅家坞、龙井村等西湖龙井茶主产区的龙井 43茶园采用五
13、点取样法采集。试验中所用的百里香精油(百里香酚含量40%)、柠檬精油(98%)、肉桂精油(85%)、牛至精油(98%)、柑橘精油(98%)、香茅精油(98%)、薰衣草精油(98%)、薄荷油(98%)、紫苏醛(95%)、香荆芥酚(HPLC 92.5%)、柠檬醛(95%)、肉桂醛(HPLC98%)均购自上海源叶生物科技有限公司。Ezup柱式真菌基因组 DNA抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司,2Taq PCR MsaterMix 购自天根生化科技(北京)196 茶 叶 科 学 43 卷 有限公司。本研究所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar,PDA)培养
14、基。1.2 试验方法 1.2.1 病菌的分离纯化 采用组织分离法13进行病原菌分离。将新鲜采摘的茶树病叶冲洗 30 min,晾干后在病健交界处剪取 5 mm5 mm 组织块,分别用75%乙醇和 5%次氯酸钠消毒后用无菌水冲洗3 次,在无菌滤纸上晾干后置于 PDA 固体培养基上,在 25 培养箱中培养 3 d 长出菌丝后取菌落边缘的菌丝块转接到新鲜的 PDA 平板中央,重复此操作数次直至获得纯培养物。1.2.2 病原菌的形态学观察 在纯化后的菌落平板边缘打取直径 5 mm的菌丝块接种于 PDA 平板中央,置于 26 下培养 7 d,定期观察病原菌菌落特征及孢子形态,计算菌落生长速度,并通过柯赫氏
15、法则(Kochs Rule)将分离病原菌进行初步回接侵染验证。1.2.3 病原菌的分子鉴定 采用 Ezup 柱式真菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取病原菌基因组 DNA,对分离物 DNA的核糖体内转录间隔区(Internal transcribed spaces,ITS),钙调蛋白(Calmodulin,CaM)基因,肌动蛋白(Actin,ACT)基因,3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehy-drogenase,GAPDH)基因、-微管蛋白(Beta-tubulin,TUB2)基因进行 PCR 扩增,引物序列、退火温度等见表 1。反应体系及组分为:1
16、0PCR Buffer 2.5 L,dNTP 1 L,Taq 酶 0.2 L,10 molL-1引物(正向和反向)各 0.5 L,DNA 模板 0.5 L,补足 dd H2O 至25 L。PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测,所得序列纯化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测得的序列在 NCBI 中利用 BLAST 进行序列同源性分析,下载参考序列通过DNAMAN软件按照ITS-ACT-GAPDH-CAL-TUB2 基因顺序拼接,参考序列登录号参考文献14,以 C.boninense CBS 123755 作为外类群,利用 MEGA 7 软件最大似然法(Maximum Likeli
17、hood,ML)构建系统发育树,bootstrap 设定为 1 000。1.2.4 分离病原菌的致病性鉴定 取健康的龙井 43 新梢从上往下数的第15 叶位叶片作为一组处理,经无菌水冲洗后自然晾干,用 75%乙醇进行擦拭,将叶片表面划伤后,用直径 5 mm 打孔器打取菌饼,将长有菌丝的一面放于伤口处进行接种,以接种无菌PDA 培养基块及无伤接种病原菌作为对照,将接种后的叶片置于 26 恒温箱中进行培养,定期观察不同叶位叶片的发病情况。对接种发病的叶片,再次按照 1.2.1 章节的方法分离纯化致病菌,观察其与原接种分离物是否一致。表 1 茶树炭疽病病原菌鉴定所用引物 Table 1 Inform
18、ation of primers used in the identification of anthracnose for Camellia sinensis 基因 Gene 引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence(5-3)退火温度 Annealing temperature/ITS ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 55 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ACT ACT-512F ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC 58 ACT-783R TACGAGTCCTTCTGGCCCAT GADPH GAPDHF GCCG
19、TCAACGACCCCTTCATTGA 60 GAPDHR GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT CAL CAL-F GAATTCAAGGAGGCCTTCTC 59 CAL-R CTTCTGCATCATGAGCTGGAC TUB2 T1 AACATGCGTGAGATTGTAAGT 55 Bt2b ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC 2 期 李红莉,等:西湖龙井产区茶树炭疽菌分离鉴定及其植物源抑菌剂筛选 197 1.2.5 抑菌活性的测定 以从茶园分离得到的茶树炭疽病菌为研究对象,采用菌丝生长速率法15测定 12 种植物提取物对菌丝生长的抑制作用。将植物提取物与等体积的
20、乳化剂吐温 80 混合后加灭菌水配成 20 gL-1的母液,使用时用灭菌水稀释到所需浓度(2 gL-1和 4 gL-1)。将 2 mL 一定浓度的植物提取物加入到刻度试管中,再用灭菌后冷却至 50 左右的 PDA 培养基定容至20 mL,充分混匀后倒入 90 mm 培养皿中配成培养基平板,以不含植物提取物的平板为对照,每个处理重复 3 次,所有制剂现用现配。将黑暗培养 5 d 的供试病原菌用 5 mm 打孔器打取长势相同的菌饼,带有菌丝的一面朝下接入培养基中央,置于 26 恒温培养 7 d 后用十字交叉法测量各处理的菌落直径,按照下列公式计算菌丝生长抑制率:抑制率=(dckdb)(dtdb)d
21、ckdb100%式中,dck为对照菌落直径,db为菌饼直径,dt为处理菌落直径。1.2.6 对茶树炭疽病菌有效中浓度(EC50)的测定 根据 1.2.5 章节的初筛试验结果,选择抑菌活性较好的 3 种植物提取物,按照质量浓度梯度制作 PDA 平板,紫苏醛的质量浓度为 50、100、150、200、250 mgL-1;香荆芥酚的质量浓度为 20、40、60、80、100 mgL-1;牛至精油的质量浓度为 50、60、70、80、100 mgL-1。采用菌丝生长速率法测定各质量浓度植物提取物对茶树炭疽病菌的菌丝生长抑制率,每个处理重复 3 次。以植物提取物质量浓度的对数为自变量 x,菌丝生长抑制率
22、为因变量 y,计算出毒力回归方程和相关系数(R2),根据回归方程求出 EC50值。1.2.7 植物提取物对茶树炭疽病菌菌丝形态的影响 将抑菌活性较好的 3 种植物提取物按照EC50浓度制作 PDA 平板,取 5 mm 长势相同的炭疽菌菌饼接种到培养基中央,26 恒温培养 7 d 后,在显微镜(Eclipse 80i,Nikon,Japan)下观察菌丝形态特征,以不添加植物提取物的 PDA 平板为对照。1.2.8 数据处理 采用 Excel 2010 和 SPSS 17.0 对试验数据进行处理。抑菌率用 SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析,采用 Duncan 氏新复极差法进行差异显著性分
23、析。2 结果与分析结果与分析 2.1 田间症状观察及致病菌分离纯化 田间观察发现,炭疽病发生时初为暗绿色水渍状病斑,后逐渐扩展为黄褐色病斑,最后变为灰白色枯斑,其上生有粒状黑色小颗粒,为病原菌的分生孢子盘,个别大型枯斑有时可跨过中央叶脉蔓延至整叶(图 1)。采用五点取样法,在种植龙井 43 的西湖龙井茶主产区的茶园采集新近发病的茶树叶片,并对叶片上的病原菌立即进行分离,纯化45 次后,得到该病原菌的纯培养物。参照分离获得的真菌培养性状和菌落形态,在茶树病叶上共分离获得 8 个真菌菌株。经初步回接验证,结果显示,HZ-A8 的致病性最强,由此对其开展后续研究。经形态学观察发现,HZ-A8 在 P
24、DA 培养基上培养 7 d,其生长速率为 11.612.9 mmd-1,菌落呈圆形,边缘整齐,气生菌丝致密,绒毛状,初为白色后为灰白色,背面白色至灰白色(图 2)。显微镜下分生孢子透明,圆柱状,无隔膜,两端钝圆。分生孢子大小为(12.6219.61)m(4.755.69)m。2.2 致病性分析 采 用 有 伤 和 无 伤 接 种 的 方 法 对 菌 株HZ-A8 的致病性进行测定,接种 2 d 后,有伤接种的茶树叶片上产生了红褐色病斑,边缘有水渍状晕圈(图 3)。其中第 13 叶位叶片上的病斑更为明显。通过观察和测量病斑面积,发现幼嫩叶片中病斑面积更大,扩展更快,而198 茶 叶 科 学 43
25、 卷 第 45 叶位相对成熟的叶片病斑面积小(图3)。将病斑组织用 PDA 培养基重新进行分离培养,获得的菌落形态和原接种菌株 HZ-A8一致,结果符合柯赫氏法则。无伤接种 HZ-A8及有伤接种 PDA 培养基的对照组叶片未出现病斑。图 1 茶树炭疽病叶片症状(从左至右症状由轻到重)Fig.1 Symptoms of tea plant anthracnose Symptoms range from mild(left)to severe(right)第 1 叶 1st leaf 第 2 叶 2nd leaf 第 3 叶3rd leaf第 4 叶4th leaf第 5 叶5th leaf第 1
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