菟丝子黄酮对H2O2诱导的COV434人卵巢颗粒细胞氧化应激的影响.pdf
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1、目的研究菟丝子黄酮(flavonoid from semen cuscutae,FSC)对过氧化氢(H2O2)诱导的人卵巢颗粒细胞氧化应激的影响以及可能相关的作用机制。方法使用不同浓度H2O2处理人卵巢颗粒细胞(COV434)2 h,用CCK8检测法评估细胞增殖活力,以确定构建细胞外氧化应激模型的H2O2刺激浓度;检测不同浓度的FSC对细胞的毒性作用;使用25 g/mL、50 g/mL、100 g/mL、200 g/mL、400 g/mL的FSC处理氧化应激模型组细胞,CCK8法检测FSC对细胞增殖活力的影响。根据处理条件将细胞分为四组:Control组,FSC组,H2O2组,FSC+H2O2
2、组,使用CCK8检测细胞增殖率,活性氧(ROS)试剂盒测定细胞内 ROS 含量,采用 Western blot 测定 AMPK、PAMPK、Bax 和 P53 蛋白的表达量。结果0.5 mmol/L的H2O2处理2 h为构建COV434细胞氧化应激模型最佳条件。同时,100 g/mL FSC处理24 h为最佳预处理条件。H2O2处理后细胞增殖活力下降,ROS水平上升,FSC处理可以降低ROS水平。Western Blot结果表明,H2O2处理后PAMPK蛋白表达下调,P53和Bax表达升高,而FSC可以逆转这一趋势。结论H2O2可能通过抑制 AMPK 通路进而影响下游 P53、Bax的表达,F
3、SC可逆转H2O2所致的COV434细胞氧化损伤这一作用。【关键词】卵巢功能不全;菟丝子黄酮;氧化应激【中图分类号】R711.75【文献标识码】AThe protective effect of flavonoids from semen cuscutae on the oxidative damage of COV434human ovarian granulosa cellsBAN Zhaoqiao,LI Mujun*.Reproductive Medicine Center,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical Universi
4、ty,Nanning 537300,ChinaCorresponding author:LI Mujun,Email:【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effects and mechanisms of Flavonoidsfrom Semen Cuscutae(FSC)on oxidative injury of human ovarian granulosa cells(COV434)inducedby H2O2.MethodsTo establish an extracellular oxidative stress mod
5、el,human ovarian granulosacells(COV434)were treated with H2O2to test cell morphology and growth at different concentrations,and cell proliferation viability was assessed using the CCK8 assay to determine the appropriate H2O2stimulation concentration.Next,to test the toxic effects of the FSC on cells
6、,COV434 cells werepretreated with H2O2and then treated with 25 g/mL,50 g/mL,100 g/mL,200 g/mL,and400 g/mL of FSC for 24 h.The optimal concentration of FSC for cell protection against oxidativedamage was screened.Then the cells were divided into four groups:Control group,FSC group,H2O218妇产与遗传(电子版)202
7、3年3月第13卷第1期 ObstetricsGynecology and Genetics,March 2023,Vol.13,No.1妇产与遗传(电子版)2023年3月第13卷第1期 ObstetricsGynecology and Genetics,March 2023,Vol.13,No.1 group and FSC+H2O2group,and the corresponding cell proliferation rate was measured using a cellcounting kit(CCK 8),intracellular ROS content was measu
8、red using a reactive oxygen species(ROS)kit,and AMPK,P AMPK,Bax and P53 proteins were measured using Western blot.ResultsThe 0.5 mmol/L H2O2for 2 h was the best pretreatment condition for establish the H2O2induced oxidative stress model in COV434 cells.Meanwhile,100 g/mL FSC for 24 h was the bestpre
9、treatment condition.cell proliferation viability decreased and ROS level increased after H2O2treatment,and FSC treatment could reduce ROS level.Western blot results showed that PAMPKprotein expression was downregulated and P53 and Bax expression increased after H2O2treatment,and posttreatment with F
10、SC could reverse this trend.Conclusions H2O2may affect the expression ofdownstream P53 and Bax by inhibiting AMPK pathways,and FSC may reverse this effect of H2O2induced oxidative damage in COV434 cells.【Keywords】Premature ovarian insufficiency;Flavonoid from semen cuscutae;Oxidative stress早 发 性 卵 巢
11、 功 能 不 全(premature ovarianinsufficiency,POI)是指女性在40岁之前出现卵巢功能衰退,表现为月经紊乱、高促性腺激素和低雌激素水平1。POI的病因尚不明确,错综复杂,约90%的POI病例为特发性。近年来研究发现氧化应激(oxidative stress,OS)影响着生殖系统疾病的发生和发展。研究人员发现,POI患者疾病的发生跟活性氧(reactive oxygen species,ROS)的升高与刺激息息相关23。卵巢的正常生理活动受到多种因素调节,其中ROS对调节生理状态下的细胞内外电解质平衡起到了关键的作用,但是过多的ROS通常伴随着细胞的氧化损伤4。
12、ROS在卵巢中对各种内环境的激素分泌可能起到了信号传导作用5,因此ROS被认为是POI的诱发因素之一6。ROS水平的升高,能导致卵巢OS,从而影响卵巢功能7。而颗粒细胞是卵巢中主要的功能细胞,所以研究颗粒细胞的 OS 对卵巢储备功能及生育力保存有重要价值8。颗粒细胞氧化损伤可引起细胞凋亡,从而引发卵巢功能异常,疾病末期阶段可导致卵巢功能衰竭9。因此我们需要建立一个抗氧化系统模型,研究保护卵母细胞免受氧化应激损伤的相关机制1011。菟丝子最早记载在神农本草经,属于旋花科植物,是南方菟丝子(Cuscutae australis)晒干后的成熟种子。菟丝子用于治疗不孕不育由来已久,并有确切的临床疗效1
13、213。菟丝子是我国传统补益中药之一,副作用小,FSC是其主要有效成分,它可以通过调整激素的分泌,在分子水平调控母胎界面平衡,抗氧化,抑制卵巢颗粒细胞凋亡及其他可能相关机制14。有研究显示,FSC可以通过激活AMPK(5腺苷酸活化蛋白激酶)蛋白通路来调节细胞能量代谢15,AMPK是一种重要的细胞能量传感器,参与调控细胞能量代谢和平衡。激活AMPK蛋白通路可以促进葡萄糖摄取、增加脂肪酸氧化、抑制蛋白质合成等,有助于维持细胞能量平衡和调节整体代谢。FSC的摄取可以增加AMPK的磷酸化水平,进而促进AMPK的激活。激活AMPK后,细胞内一系列代谢过程会被调控,包括糖原合成、脂肪酸氧化、线粒体功能等。
14、因此,笔者提出如下假说,FSC通过AMPK调控代谢,增强卵巢颗粒细胞抗氧化应激的作用,对POI有潜在的治疗作用。本实验将使用卵巢颗粒细胞作为研究对象,旨在研究FSC是否具有增强颗粒细胞的抗氧化损伤作用,这一研究有望为FSC的临床应用以及早期预防和治疗POI提供新的思路和方法。材料与方法一、材料与试剂COV434人卵巢颗粒细胞系购自美国 Sigma 公司;菟丝子黄酮购自南京普怡生物科技有限公司;H2O2购自成都市科隆化学品有限公司;DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司;青霉素链霉素双抗购自北京Solarbio公司;0.25%胰酶(含 EDTA)购自美国 Gibco 公司;PBS 缓冲液购
15、自北京 Solarbio 公司;胎牛血清购自美国 Gibco 公司;二甲基亚砜(DMSO)购自北京Solarbio公司;CCK8试剂盒购自江苏碧云天生物公司;活性氧(ROS)检测试剂盒:购自江苏碧云天生物公司;兔源 AntiPAMPK(Thr172)抗体,兔源 AntiAMPK 抗体,19妇产与遗传(电子版)2023年3月第13卷第1期 ObstetricsGynecology and Genetics,March 2023,Vol.13,No.1妇产与遗传(电子版)2023年3月第13卷第1期 ObstetricsGynecology and Genetics,March 2023,Vol.
16、13,No.1 兔源 AntiP53 抗体,兔源 AntiBax 抗体,兔源GAPDH 抗体,辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG,均购自Affinity Biosciences公司。二、细胞培养将COV434人卵巢颗粒细胞置于37,CO2浓度为5%的培养箱中进行培养,使用10%FBS与1%青链霉素混合的DMEM培养基,选择处于对数生长期的细胞,用胰酶进行消化、传代作后续试验。通过 CCK8 法测定不同浓度 H2O2处理 2 h 的COV434细胞增殖率,以此确定H2O2的最佳选择浓度1617。成功构建氧化应激模型的判断标准是引起细胞氧化应激的同时对细胞增殖活力造成较小的损伤,取小于或接近细胞的
17、半数抑制率(IC50)值作为本次实验所需作用的最佳浓度18。将COV434细胞以1104个/孔的密度不透光地接种于96孔板上,细胞贴壁以后,以COV434细胞未做任何处理的组作为对照(Control 组),采用不同 浓 度(0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L)的H2O2分别处理COV434细胞2 h,以此求得H2O2最佳浓度。分别用25 g/mL,50 g/mL,100 g/mL,200 g/mL 和 400 g/mL 的FSC处理 COV434细胞24 h,CCK8法检测FSC的细胞增殖毒性;再用浓度为 25 g/mL
18、,50 g/mL,100 g/mL,200 g/mL的FSC 处理氧化损伤模型细胞24 h,CCK8检测细胞增殖活力。实验重复三次。三、实验分组将 COV434细胞分为4组:Control组(空白对照组)、FSC组(用含100 g/mL的FSC的培养基处理 24 h)、H2O2模型组(用 0.5 mmol/L H2O2处理2 h)、H2O2+FSC组(100 g/mL FSC处理H2O2模型组24 h)。四、DCFHDA检测细胞内活性氧(ROS)以 1105/皿的细胞数把细胞接种到于六孔板上,置于37,5%CO2培养箱中进行培养。根据组别和研究目的进行刺激处理,随后按1 1 000 用无血清培
19、养液稀释DCFHDA,使得最终浓度达到10 mol/L。除去细胞原有的培养基后,每个孔加入稀释后的DCFHDA,加入的体积能充分盖住细胞为宜,放入培养箱内避光孵化30 min。随后用无血清细胞培养液洗涤细胞,以充分清除未进入细胞的DCFHDA。最后利用激光共聚焦显微镜,设置参数488 nm激发波长,525 nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。五、Western blot检测氧化损伤蛋白AMPK、PAMPK、和P53、Bax取每组COV434细胞,加RIPA裂解液在冰上裂解,离心后取出上清液,采用BCA法检测蛋白浓度。蛋白上样量为20 g,10%SDSPAGE凝胶进行电泳分离,电
20、压 80120 V,电泳 1 h,转膜后用5%脱脂奶粉的TBST常温封闭1 h,加入AMPK(1 2 000)、PAMPK(1 2 000)、P53(1 20 00)、Bax(1 3 000),GAPDH(1 10 000),4C摇床孵育过夜。TBST冲洗3次,每次10 min。加入二抗(GoatAntiRabbit IgG(H+L)HRP,1 10 000),室温孵育1 h,制备ECL发光显影液,在化学发光成像仪中显影并摄片。利用Image J对各蛋白条带灰度值进行计算,并将GAPDH作为内参。实验重复三次。六、统计学方法应用SPSS 26.0软件进行统计分析,计量资料用(均数 标准差)(x
21、 s)表示,数据在比较前均进行了正态性检验以及方差齐性分析,满足正态性检验,采用单因素方差分析(oneway ANOVA)进行组间比较;资料满足方差齐性,用LSDt检验进行多重比较分析,将P0.05作为差异有统计学意义。结果一、FSC对氧化损伤COV434细胞增殖率的影响如图1A所示:不同浓度(0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L)H2O2体外刺激 COV434 细胞2 h后,随着H2O2浓度上升,细胞增殖率逐渐降低。H2O2浓度在0.2 mmol/L至0.5 mmol/L时,在两两比较中对细胞增殖率的影响无明显差异(P0.0
22、5);当 H2O2浓度上升到 0.6 mmol/L时,细胞增殖率与0.5 mmol/L对比显著降低(P0.05),因此选择 0.5mmol/L 的 H2O2作为后续实验建立COV434细胞氧化应激模型的浓度。如图1B所示,不同浓度(25 g/mL,50 g/mL,100 g/mL,200 g/mL,400 g/mL)FSC 作 用COV434细胞24 h,CCK8测定细胞增殖活力。结果表明,在浓度 25 g/mL 至 200 g/mL 的浓度范围内,FSC 对细胞的活力影响与 Control 组无显著差异,但是当药物浓度上升至400 g/mL后,对细胞毒性显著升高,细胞活力降低(P0.05),
23、故选取20妇产与遗传(电子版)2023年3月第13卷第1期 ObstetricsGynecology and Genetics,March 2023,Vol.13,No.1妇产与遗传(电子版)2023年3月第13卷第1期 ObstetricsGynecology and Genetics,March 2023,Vol.13,No.1 ControlFSCH2O2FSC+H2O2图2H2O2诱导COV434细胞氧化损伤的细胞形态学观察(40)二、FSC对氧化损伤COV434细胞形态及生长情况的影响将细胞分组后,对COV434细胞的大小、形态和生长状况进行了观察。研究发现Control组与FSC组
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