多药耐药基因的临床意义与检测方法.docx

肿瘤细胞对化疗药物的多药耐受性(MDR1)是癌症治疗的主要障碍之一。所谓多药耐药(multidrug resistance,MDR)是由一种药物诱发而同时对其它多种结构和作用机制完全不同的抗癌药物产生的交叉耐药，既对广泛的结构和功能不相同的抗肿瘤药物产生的耐药，导致某些联合化疗方案失败。尽管各种新的化疗药物和治疗方案不断地产生及应用，并在某些恶性肿瘤的治疗上取得成功，但在大多数最常见的恶性肿瘤中却收获不大。临床上许多肿瘤在经历了最初有效的化疗后，又再复发，多发癌化疗者效果差其主要原因是肿瘤细胞对化疗的耐受性。肿瘤耐药原因很多，目前公认最主要是多药耐药基因的过渡表达，克服此障碍，肿瘤化疗将取得决定性突破。
1　MDR的概念
　　肿瘤细胞耐药性可分为内在性耐药(intrinsic drug resistance)和获得性耐药(acquired drug resistance)两类，既原发地存在于某些肿瘤中，称内在性耐药；继发于化疗后，称获得性耐药。
　　根据耐药谱可分为原药耐药(primary drug resistance,PDR)和多药耐药(multidrug resistance,MDR)。PDR只对诱导的原药产生耐药，而对其它药物不产生交叉耐药。而MDR是一种药物诱发，而同时对其它多种结构和作用机制完全不同的抗癌药物产生交叉耐药。内在性耐药的原因仍不清楚，而获得性耐药是由于变异的耐药肿瘤细胞亚群过渡生长所致。内在性耐药与获得性耐药作为一种独特的耐药现象是成功地治疗肿瘤的关键性难题，因而成为近几年国内外研究和探索的热点。
2　MDR的耐药机制
　　1970年 Biedler和Riehm首先描述了MDR表型：一种药物诱导产生的耐药细胞株可用对其它多种化学结构和功能完全不同的化疗药物产生耐药。他们发现对放线菌D耐药的细胞，同时也对多种抗肿瘤抗生素如柔红霉素等，以及结构与作用机制迥异的植物碱类抗肿瘤药如长春新碱等交叉耐药。1976年，Juliano等最先在耐药的中国苍鼠卵巢细胞中发现一种新的与耐药程度呈数量关系的高分子量的细胞膜糖蛋白，命名为P糖蛋白(p-glycopratain,p-gp)。因其分子量为170kda，又名pgp170，认为此蛋白可降低细胞膜对药物的通透性而引起耐药。后来又陆续研究发现在不同来源的多药耐药细胞中这种P糖蛋白的分子量范围在130～180kda，主要集中在150～180kda，它由多药耐药基因MDR编码。近十几年，国外已从耐药肿瘤细胞株中分离出耐药基因MDR1和它的表达P糖蛋白。1986年chen等克隆了编码P糖蛋白的cDNA［2］。
2.1　MDR基因家族
　　在哺乳动物，MDR基因是一较小的相对保守的基因家族。在人类基因组中，它含有两个基因MDR1和MDR2，在啮齿类由三个基因组成：MDR1，MDR2，MDR3。
2.2　MDR基因
　　基因图谱的研究表明人类MDR两种基因定位于第7号染色体的q21.1带的330kb中。含有28个外显子，28个外显子序列与cDNA完全一致，cDNA全长4.5kb。在不同的细胞系中MDR1启动子显示的活性不同，其增加子的活性亦不同，因此MDR1表达呈组织特异性。
2.3　MDR基因表型
　　MDR基因表型是与其基因产物P糖蛋白有关的。许多研究表明，MDR表型表现为MDR基因的过度表达伴有或不伴有基因扩增。研究发现，在耐药程度低的耐药细胞系，可无MDR基因扩增，只有MDR基因的表达增加(即mRNA的表达增加，P糖蛋白的功能增强)。此时低度耐药细胞P糖蛋白的功能的增加是由于mRNA转录水平增高，而非基因拷贝增加所致。
　　MDR表型最突出的特点是其编码P糖蛋白功能增加而导致产生了多药耐药性。因此P糖蛋白是MDR基因的表型标志。
2.4　P糖蛋白
　　MDR基因编码的P糖蛋白是分子量约为170Kda的胞膜蛋白，由1280个氨基酸组成，同源双链，每条链有6个跨膜疏水区，其构成三个跨膜孔有一个细胞内核苷糖连接点可能与ATP连接并发生水解作用。通常认为，P糖蛋白具有一种能量依耐的跨膜药物外输泵功能，当肿瘤细胞与抗癌药物接触时，脂溶性药物浓度梯度进入细胞，而P糖蛋白则结合药物分子，同时其ATP结合位点连上ATP，ATP水解后释放能量将药物从胞内泵出胞外，药物在胞内浓度不断下降，其细胞毒作用因而减弱甚至丧失，出现耐药现象。
　　人类MDR1和MDR2两种基因分别编码了两种结构相似，功能不同的P糖蛋白，MDR1和MDR2两种基因及其所编码的两种P糖蛋白具有高度同源性，其同源性达80%，然而这两种基因产物的表达却呈组织特异性而且有不同的生理功能。MDR1的表达产物可将亲脂类化疗药泵出细胞外，因而有耐药特性；MDR2的表达产物则主要分布在骨骼肌纤维上，可将肌纤维的代谢产物，如激素等转运到膜外，无转运亲脂类药物功能，故不具多药耐药性的作用。然而在最近的研究报告中这种基因仍然作为一个重要提示，即治疗前的髓性白血病B细胞出现高表达［1］。
3　在正常组织及肿瘤组织中MDR1基因表达
3.1　在正常组织中MDR1基因表达
　　认识P糖蛋白在体内正常表达的进行和功能是重要的。P糖蛋白在正常人体细胞内也有表达，表明MDR基因并非异常基因，P糖蛋白并非是一种异常蛋白，而且具有一定的生理功能。了解MDR1基因在正常组织中表达，具有三个作用。(1)为了建立一个肿瘤中MDR1表达增加的基线。(2)增加我们关于正常P-gp生理功能知识。(3)更好的了解在缓解人类肿瘤耐药方面的潜在作用。正常组织中分为高、中、低三个表达水平。肾上腺、肾脏高水平表达；肺、肝、结肠、空肠、直肠中等表达；而皮肤、骨骼肌、心肌、脾、食道、胃、卵巢、骨髓等则低表达或不表达。可以发现MDR1表达主要是在具有分泌和排泄功能的器官组织特殊上皮细胞中，其功能为降低有害的外源性物质对细胞的损害，具有正常的生理保护功能。维持血脑、血睾丸及血胎盘屏障(脑组织及睾丸组织血管内皮细胞、胎盘滋养叶细胞MDR1基因表达水平高)。已有报道MDR基因及其产物在正常细胞的防御中起着不可忽略的作用，尤其是对化学致癌物及化学毒素的防御［1，7，4］。
3.2　在实体肿瘤中MDR1基因表达
　　如前所述，肿瘤细胞的多药耐药性分为内在性耐药与获得性耐药两类。在肿瘤细胞中，MDR1的表达与肿瘤细胞的组织起源有关。临床研究发现，实体肿瘤中MDR1基因表达分四组：第一组癌症通常表达高水平的MDR1mRNA。大多数本组肿瘤正常组织中存在中间至高水平的P-gp 170表达，如肾细胞癌、结肠癌、肝细胞癌、肾上腺皮质癌、嗜络细胞瘤等。临床发现这些肿瘤显示出对治疗的不敏感性(那就是说存在内在性耐药)。第二组所包括的癌症偶然表达高水平的MDR1mRNA(中间MDR1表达水平)、如神经母细胞瘤、软组织肉瘤、乳腺癌，本组肿瘤趋向比第一组治疗效果好，不幸的是本组经过化疗后常常得到获得性耐药。第三组所包括的肿瘤罕见MDR1mRNA表达(几乎所有的都没检测到或低MDR1表达)如卵巢癌、食道癌、wilm's瘤、膀胱癌、肺癌等。本组肿瘤通常化疗治疗是有效的，但许多肿瘤通过药物刺激将发展为获得性耐药。第四组包括肿瘤经过化疗后MDR1基因表达水平提高。
3.3　在恶性血液学方面检测MDR1基因表达
　　许多血液失调的病人在治疗过程中发展成为耐药。由此MDR概念产生。研究白血病病人耐药的最大优势是不论治疗前与治疗后都很容易获得肿瘤标本，且不受肿瘤大小、存在部位和血管血流等非耐药因素的影响。因此与实体肿瘤相比恶性血液病人MDR1表达的数据是回归性的且经过了化疗治疗。
　　在正常血液细胞内(全骨髓、脾、纯净的淋巴细胞)发现低和非常低MDR1水平表达。在几乎所有类型白血病、多发性骨髓瘤和非何杰金氏淋巴瘤不论治疗或未经治疗病人都有MDR1水平增高的报道，MDR1水平可以在一个由低到高范围甚至在未治疗病人中出现高水平表达。我们用非同位素原位杂交方法检测正常人骨髓MDR1mRNA表达阳性率低于10%，强度为弱阳性。
　　恶性血液病在MDR1表达方面可以分为三个不同组。第一组MDR1水平通常在未治疗前增高即内在性耐药肿瘤，如CML在其复发期。第二组为未经治疗的癌症病人MDR1水平偶尔提高，如成人急性淋巴性白血病(ALL)、成人急性非淋巴细胞白血病(ANLL)、何杰金氏淋巴瘤。第三组，在有些癌症中经治疗复发时，MDR1水平提高，包括ALL、ANLL。
　　在临床急性白血病研究中发现，MDR1mRNA阳性组的缓解率(CR)，明显低于MDR1mRNA阴性组的CR，并且MDR1mRNA阳性患者达到缓解而需疗程较MDR1阴性患者长。有文献报道MDR1基因表达阳性的初治患者CR率为27%～60%［7］，而MDR1基因表达阴性者CR率为72%～90%，说明MDR1基因表达是导致诱导缓解失败的主要原因。
4　MDR1基因表达研究的临床意义
　　研究MDR1基因表达与临床化疗的关系，是从分子水平而非细胞水平来探讨肿瘤对化疗药物的敏感性与耐受性，可用来预测病人对化疗的反应以及化疗过程中疗效的判断和监测预后，可望使肿瘤在更高水平上进行治疗和观察，使化疗个体化，临床医生可根据每个病人MDR1的表达水平判断耐药程度，合理地制定化疗方案，具体来讲［2］：(1)预测病人对化疗药物的敏感性与耐受性，有针对性地选择最有效的药物，避免盲目用药，减少不必要的毒副作用。(2)化疗过程中，若MDR1表达逐渐增高，要注意获得性多药耐药性的发生，及时调整化疗方案。(3)在未进行化疗前，MDR1即显高表达，表示存在内在性多药耐药性，可考虑使用MDR逆转剂配合抗癌药物化疗。(4)预测肿瘤复发、转移及预后。(5)在研究中评价MDR逆转药物的疗效。
　　与MDR1基因相关的化疗药物包括(1)烷化剂类。(2)植物碱类抗肿瘤药。(3)抗肿瘤抗生素类。(4)激素类等。通常为分子量大的亲脂类化合物。与MDR1基因无关的化疗药物包括(1)抗代谢类药物，如5-氟脲嘧啶等。(2)铂类化合物如顺铂等［2，5］。
　　由于MDR相关的化疗药物包括了常用抗癌药绝大部分，可供MDR1高表达病人选择使用的抗癌药所剩无几。如何克服?目前研究方向之一是选择逆转剂。所谓逆转剂机理是，逆转剂能与耐药细胞表面的P糖蛋白结合，竞争性抑制P糖蛋白与化疗药物结合，阻止化疗药物从细胞内流出，从而提高细胞内化疗药物浓度，增强化疗效果。(图1B)目前发现的可逆转MDR的药物包括(1)钙通道阻滞剂；如异博定。(2)钙调蛋白拮抗剂：如环胞菌素A等。(3)抗心律失常药：如潘生丁，心得安等。目前主要用于临床的是异博定(VRP)和环胞霉素A(CSA)，但都存在一定毒副作用。如果还存在其它耐药机制则影响逆转效果。
5　MDR的检测方法
　　随着分子生物学的发展，检测手段不断增加。目前主要从分子水平、蛋白水平、细胞水平多途径展开了研究。
5.1　分子水平　由于人肿瘤细胞几乎不存在MDR1DNA扩增，因此，无法检测DNA变化，主要是检测MDR1mRNA的表达水平。常用的方法包括：RT-PCR、原位杂交(ISH)、Slot-blot(SB)、Northern blot(NB)、RNase保护实验等［12］。
5.2　蛋白水平　免疫组织化学法(IHC)，免疫荧光等。常用的P-gp特异性单克隆抗体有JSB-1、MRK1、C219、U12、HYB-612等，不同的单抗识别不同的抗原决定簇，每种单抗特异性和亲合力不完全相同。
5.3　细胞水平　检测细胞的药物输出功能，采用荧光染料如若丹明-123或具有天然荧光的柔红霉素与细胞共同培养后，用荧光分光度计测定单个细胞内药物浓度，与对照组比较判定细胞的耐药程度。最近国外使用流式细胞仪，高分析技术(扫描激光和聚焦显微镜)等先进设备对P-gp进行功能检测。Piwneca-Worns等描述一个人造r散射的锝洛合物hexakis［99MTC］SESTAMIBI对P-gp170进行功能图象分析。［99MTC］SESTAMIBI是一脂性具有放射性的药物性阳离子其可被多药转移机制主动转导。这项技术通过有价值的r散射性的［99MTC］进行P-gp170功能测试，是一个新颖的快速测定人体内肿瘤细胞P-gp170表达的方法。
　　以上各种方法，各有优缺点。综合评价：(1)敏感性，PCR>ISH>PGP>SB、NB及细胞功能测定。(2)特异性，PCR、ISH>PGP>SB、NB及细胞功能测定［2，12］。
　　目前MDR1基因检测强调标准实验的重要性。要求标准实验为：既要有足够的灵敏性以检测小体积样本中MDR1基因表达，并且能定量且能区别出正常组织表达还是肿瘤组织表达。要想达到该标准，几种实验组合会给临床提供更确切的信息。且参与的实验室须规范标准化报告及进行质量控制［1，7］。
　　由于上面介绍这些检测技术不论是在灵敏性方面还是特异性方面都不可避免地受到一因素的限制。这些因素导致我们不论是对正常组织还是恶性肿瘤组织MDR方面的检测都出现相互矛盾的结果。当然抗肿瘤药物耐药过程的复杂性，及一些外在其它因素如肿瘤组织的变异，其它耐药机制存在和低水平的MDR标志表达等因素都会导致一些相互矛盾的结果。还有以前治疗因素影响MDR表型及实验时间不适当等因素都会导致MDR表达与引起化疗困难的结果不一致。要解决这些问题我们还有大量的工作要做。
作者单位：张真路(430050　武汉市汉阳铁路中心医院病理科)
　　　　　吴人亮(同济医科大学病理教研室)
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