提高乙酸耐受性酿酒酵母JJ...1突变株构建及转录组学分析_邓衍宏.pdf
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1、第 14 卷 第 11 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.14 No.11 2023 年 6 月 Journal of Food Safety and Quality Jun.,2023 基金项目:安徽省科技重大专项(202003c08020001)、合肥市自然科学基金项目(2022047)Fund:Supported by the Anhui Province Science and Technology Major Project(202003c08020001),and the Hefei Natural Science Foundation(2022047)*通信作者
2、:杨培周,博士,副教授,主要研究方向为微生物、发酵工程、基因工程。E-mail:*Corresponding author:YANG Pei-Zhou,Ph.D,Associate Professor,School of Food and Bioengineering,Hefei University of Technology,No.485,Danxia Road,Shushan District,Hefei 230601,China.E-mail: 提高乙酸耐受性酿酒酵母 JJJ1 突变株构建及 转录组学分析 邓衍宏1,汪 虎1,周 勇1,卢久灵1,杨培周2*(1.宿州中粮生物化学有限公司
3、,宿州 234000;2.合肥工业大学食品与生物工程学院,合肥 230601)摘摘 要要:目的目的 构建 JJJ1 突变株以提高酿酒酵母在发酵过程中的乙酸耐受性,提高发酵效率。方法方法 本研究采用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术构建酿酒酵母 JJJ1 突变株,检测突变对酿酒酵母菌株的乙酸耐受性影响,基于转录组学分析突变株耐受乙酸的分子机制。结果结果 在含有 5 g/L 乙酸的液体培养基中,酿酒酵母 JJJ1 存活率是野生型菌株的 4.44 倍,发酵 120 h 后酿酒酵母突变株 JJJ1 的细胞生物量是野生型菌株的 1.15 倍,酿酒酵母 JJJ1 的生长延滞期比野生型菌株缩短了 30
4、h;转录组学研究表明,敲除 JJJ1 基因增强酿酒酵母的代谢、生物调节、膜流动性以及转运活性和电子转移活性,减少酿酒酵母细胞生理过程、细胞连接和拟核功能以及细胞结合功能。结论结论 敲除 JJJ1 基因的酿酒酵母突变株通过提高能量代谢和氨基酸合成,降低核糖体生物发生减少细胞生理活动,增强酿酒酵母菌株乙酸耐受性。关键词关键词:酿酒酵母;转录组学;JJJ1 突变株;乙酸;基因编辑;分子机制 Construction of Saccharomyces cerevisiae JJJ1 mutant for acetic acid tolerance improvement and transcripto
5、mics analysis DENG Yan-Hong1,WANG Hu1,ZHOU Yong1,LU Jiu-Ling1,YANG Pei-Zhou2*(1.Suzhou Zhongliang Biochemistry Co.,Ltd.,Suzhou 234000,China;2.School of Food and Bioengineering,Hefei University of Technology,Hefei 230601,China)ABSTRACT:Objective To construct Saccharomyces cerevisiae JJJ1 mutant,and i
6、mprove acetic acid tolerance and fermentation efficiency of Saccharomyces cerevisiae during fermentation process.Methods CRISPR-Cas9 technology was used to construct Saccharomyces cerevisiae JJJ1 mutant.The effect of JJJ1 mutation on acetic acid tolerance of Saccharomyces cerevisiae was detected.The
7、 molecular mechanism of acetic acid tolerance of Saccharomyces cerevisiae JJJ1 was further explored based on the transcriptomics analysis.Results The survival rate of Saccharomyces cerevisiae JJJ1 was 4.44 times in comparison to that of the wild-type strain in liquid medium containing 5 g/L acetic a
8、cid.After 120 h of fermentation,the cell biomass of Saccharomyces cerevisiae JJJ1 was 1.15 times in comparison to that of the wild-type strain.The growth lag period time of Saccharomyces cerevisiae JJJ1 was 30 h shorter than that of the wild-type strain.Transcriptomics studies showed that the deleti
9、on of Saccharomyces cerevisiae JJJ1 enhanced the metabolism,biological regulation,membrane fluidity,transport activity and electron DOI:10.19812/ki.jfsq11-5956/ts.2023.11.001第 11 期 邓衍宏,等:提高乙酸耐受性酿酒酵母 JJJ1 突变株构建及转录组学分析 27 transfer activity,and reduced the physiological process of cells,cell junction,n
10、ucleoid function and cell binding function.Conclusion The deletion of JJJ1 gene can improve energy metabolism and amino acid synthesis and reduce ribosomal biogenesis and cell physiological activity in Saccharomyces cerevisiae.KEY WORDS:Saccharomyces cerevisiae;transcriptomics;JJJ1 mutant;acetic aci
11、d;gene editing;molecular mechanism 0 引 言 酿酒酵母广泛应用于酒类、面团发酵和工业化乙醇生产12。酿酒酵母在发酵过程中经常受到渗透压胁迫、高温胁迫、酸性胁迫等多种胁迫抑制34,其中,有机酸性胁迫是影响酿酒酵母发酵产乙醇的一个重要因素。酿酒酵母发酵过程形成副产物乙酸,乙酸的过量积累影响酿酒酵母碳水化合物代谢、氨基酸代谢、信号传导和物质运输,抑制酵母细胞增殖与乙醇发酵5。已有研究表明乙酸通过促进扩散过程进入酵母细胞,在中性细胞质中解离累积大量 H+,进而引起细胞质酸化,降低代谢活性6。为维持正常的生长环境,酿酒酵母通过 H+-ATP 酶将 H+排出细胞外,消耗
12、大量 ATP导致能量供应不足,导致细胞生长停滞甚至死亡79。此外,酸性胁迫还可能引起氧化胁迫,损伤 DNA 和细胞器10。突变关键基因能够有效提高酿酒酵母乙酸耐受性,例如突变 FPS1、HAA1、ARG3、SET5 基因可以降低酿酒酵母乙酸积累,提高应激转录,维持细胞膜完整性,减少氧化应激,降低乙酸胁迫引起的细胞损伤1114。JJJ1 是一种特殊的细胞质 J 蛋白,参与大核糖体亚基的生物生成,刺激 Hsp70 Ssa1 的 ATP 酶活性15。JJJ1 基因的缺失会导致细胞内乙酸积累减少,细胞膜流动性增强以及过氧化氢酶活性增加16。本研究通过CRISPR-Cas9技术敲除JJJ1基因构建酿酒酵
13、母 JJJ1 工程菌,采用转录组学技术研究差异基因(differential expressed genes,DEGs)、基因本体论(gene ontology,GO)功能分类和京都基因与基因组百科全书数据库(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)路径富集,分析 JJJ1 基因敲除对其他基因表达量的影响,根据DEGs 表达的功能和作用路径探究 JJJ1 基因敲除增强酿酒酵母乙酸耐受性的分子机制,以期增强酿酒酵母菌株的乙酸耐受性,更好地应用于食品发酵工业中。1 材料与方法 1.1 材料与试剂 表达 Cas9 蛋白质粒 Cas9-NAT(Addg
14、ene:64329)、表达 gRNA 的质粒 gRNA-trp-Hyb(Addgene:64331)(美国Addgene 公司);高保真 PCR Mix 预混液(上海生工生物科技有限公司);聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、醋酸锂(LiAc)(分析纯)、鲑鱼精 DNA(ssDNA)、诺尔斯菌素、潮霉素 B、氨苄青霉素(北京全式金生物技术公司);乙酸(色谱纯,上海麦克林生化科技股份有限公司);酵母提取物、蛋白胨(生物试剂,北京奥博星生物技术有限公司);葡萄糖(分析纯,上海沪试试剂有限公司);酿酒酵母 S288c(实验室保存)。1.2 仪器与设备 TC-96 PCR 仪(
15、德国BIOMETRA 公司);EPS300 DNA 电泳仪、伯乐 BIO-RAD Gel Doc XR 全自动凝胶成像仪、HPX-87H 色谱柱(300 mm7.8 mm,9 m)(美国 Bio-Rad 公司);ML31 光学显微镜(广州明美光电技术公司);UV-1201紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);DHP-9082恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);HQ45Z 恒温气浴摇床(江苏金坛环宇科学仪器厂);SW-CJ-1G 型超净工作台(苏州净化公司)。1.3 实验方法 1.3.1 gRNA 扩增及表达载体的构建 在网站http:/chopchop.cbu.uib.no/faq
16、进行酿酒酵母 JJJ1基因 gRNA 序列设计,选择评分和效率最高的靶序列17。设计引物以质粒 gRNA-trp-HyB 为模板扩增,扩增 gRNA 表达载体(表 1),加样和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增参数设置为:2高保真 PCR Master Mix预混液 12.5 L、1.0 L 正向和反向引物、0.5 L DNA 模板和 10 L 无菌水;PCR 扩增:95,30 s 预热;95,15 s;56,15 s;72,3 min,35 个循环;72保温 5 min。表 1 gRNA 载体构建和 DNA 鉴定引物 Table 1 Primer
17、s for gRNA vector construction and DNA identification 引物名称引物序列 JJJ1-gRNA-F1 5-AGTGCACACCTCGATCGCGGAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3 JJJ1-gRNA-R1 5-CCTCCGCGATCGAGGTGTGCACTGATCAT TTATCTTTCACTGCGGA-3 Us-XYL15-CCCCACACACCATAGCTTCAAAAT-3 Ds-XYL15-GCGGATGTGGGGGGAGGGCGTGAA-3 1.3.2 酿酒酵母 JJJ1 基因敲除 用 LiAc-ssDNA 转化
18、法将 Cas9-NAT 和 gRNA-trp-Hyb质粒分别转化到酿酒酵母中18。在 Cas9-NAT 质粒转化到酿酒酵母过程中,将混合体系溶液涂在含有 80 g/mL 诺尔斯菌素的固体酵母蛋白胨葡萄糖(yeast peptone dextrose,28 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 第 14 卷 YPD)平板上,30下孵育 48 h,选择单个菌落作为酿酒酵母转化子;然后,将质粒gRNA-trp-Hyb和供体DNA一起转化到转化子酿酒酵母中(图1),将混合溶液涂在含 80 g/mL诺尔斯菌素和 300 g/mL 潮霉素 B 的固体 YPD 平板上,30下培养 48 h 后,挑取单菌落
19、扩大培养并进行转化子鉴定。图 1 采用 CRISPR-Cas9 途径敲除酿酒酵母 JJJ1 基因示意图 Fig.1 Schematic diagram of knocking out Saccharomyces cerevisiae JJJ1 using the CRISPR-Cas9 pathway 1.3.3 酿酒酵母在含有乙酸的固体培养基上生长 将转化获得的酿酒酵母工程菌 JJJ1 转接到装有 100 mL YPD 液体培养基中进行细胞扩增培养,培养条件为温度30,摇床转速 180 r/min,培养时间为 24 h,在 600 nm 波长下采用吸光度法测定酿酒酵母发酵液 OD600 nm
20、;将各发酵液以 10 倍稀释 5 个梯度,将 3 L 各浓度稀释液滴加在含有 5 g/L 乙酸的 YPD 固体培养基上,30下培养 72 h 后记录固体培养基上的菌落形态和数量。1.3.4 酸性胁迫下酿酒酵母工程菌 JJJ1 细胞形态观察 酿酒酵母工程菌JJJ1转接到100 mL含有5 g/L乙酸的YPD 液体培养基中,在 30和 180 r/min 条件下培养 72 h,每间隔 6 h 取样,测定 600 nm 处的吸光度,分析乙酸对酿酒酵母细胞生长影响;将发酵液稀释 100 倍,采用 0.4%吕氏碱性美蓝染色液染色,在光学显微镜下观察酿酒酵母染色情况以及细胞形态。基于美蓝染色特点,蓝色和未
21、被染色细胞分别代表死亡以及仍然存活的酿酒酵母。1.3.5 酿酒酵母在乙酸的胁迫下的生长和发酵情况 研究酸性胁迫对酿酒酵母产乙醇的影响。将酿酒酵母JJJ1 在 30和 180 r/min 条件下培养 24 h,取发酵液接种于含有 5 g/L 乙酸的 YPD 液体培养基中。初始葡萄糖质量浓度为 50 g/L,通过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定发酵液中的葡萄糖和乙醇含量,分析酸性胁迫对于酿酒酵母发酵产乙醇的影响。发酵液离心去除沉淀,收集上清液经 0.22 m 的滤膜过滤,HPLC 参数如下:HPX-87H 色谱柱(300
22、mm7.8 mm,9 m),0.04 mol/L H2SO4,流速 0.6 mL/min19。1.3.6 转录组学分析 在发酵过程中取 3 mL 酿酒酵母 JJJ1发酵液加入甘油后放入80冰箱冷藏备用。转录组学分析的基因测序委托上海生工生物有限公司完成,使用Illumina Hiseq 平台进行测序,测序后数据使用 RSeQC 和 BEDTools 进行质量评估和检测,使用 DESeq2 进行基因表达差异分析,对表达差异分析结果进行可视化;使用 TopGO 对 DEGs 进行 GO 功能注释20,使用ClusterProfiler 对DEGs 进行KEGG 通路富集分析;使用R语言对分析结果进
23、行可视化21,根据可视化结果分析敲除JJJ1 基因提高酿酒酵母乙酸耐受性的分子机制。1.4 数据处理 实验的测定均进行 3 次重复,采用 Origin Pro 2018 软件进行分析并制图,采用 SPSS 21.0 进行数据显著性分析。2 结果与分析 2.1 酿酒酵母 JJJ1 基因敲除结果分析 将Cas9-NAT质粒、表达20 bp gRNA的gRNA-trp-Hyb扩增质粒和供体 DNA XYL1 转化进酿酒酵母细胞中(图 2),通过诺尔斯菌素和潮霉素 B 双重抗性筛选,鉴定敲除 JJJ1基因的酿酒酵母转化子(图 2A)。对转化子进行菌落 PCR验证,图中条带显示大小约为 1400 bp,
24、经测序以及基因比对,确定该序列为 XYL1 基因(图 2B),基于基因敲除技术,获得敲除 JJJ1 基因的酿酒酵母转化子。注:A-a,b,c 为对照,分别代表没有添加插入 DNA、gRNA 和插入DNA/gRNA 的转化;d 代表正常工程菌构建转化;泳道 M、1 和 2分别代表 DNA Marker、对照和拟转化子 PCR 鉴定。图 2 JJJ1 基因突变体酿酒酵母转化子转化和筛选(A)及 菌落 PCR 鉴定(B)Fig.2 Transformation and screening of JJJ1 gene mutant Saccharomyces cerevisiae transforman
25、ts(A)and PCR identification of colony(B)2.2 乙酸耐受性的固体平板检测结果分析 耐受性检测结果表明,在含有 0 g/L 乙酸的 YPD 平板中,JJJ1 和野生型酿酒酵母生长的菌落大小和数量没有显著差异(图 3A)。在含有 5 g/L 乙酸的 YPD 平板上菌落生长情况显示,稀释10倍和100倍后,JJJ1的菌落生长密度显著高于野生型菌株,在稀释 1000 倍时野生型菌株没有菌落生长,酿酒酵母 JJJ1 有 40 个菌落生成(图 3B)。因此,在固体培养条件下,JJJ1 基因敲除提高了酿酒酵母对乙酸的耐受性。2.3 乙酸对酿酒酵母的细胞形态影响 显微镜
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