微量磺胺甲恶唑对饮用水管网...群落及抗性基因的影响与控制_胡炽盛.pdf

文章栏目：相关研究DOI10.12030/j.cjee.202302085中图分类号X703文献标识码A胡炽盛,马徐,倪炯,等.微量磺胺甲恶唑对饮用水管网生物膜群落及抗性基因的影响与控制J.环境工程学报，2023,17(6):2077-2087.HUChisheng,MAXu,NIJiong,etal.Influenceofmicro-sulfamethoxazoleonthebiofilmbacterialcommunitiesandantibioticresistancegenesindrinkingwaterdistributionsystemsanditscontrolJ.ChineseJournalofEnvironmentalEngineering,2023,17(6):2077-2087.微量磺胺甲恶唑对饮用水管网生物膜群落及抗性基因的影响与控制胡炽盛1，2，马徐1，倪炯3，王亮3，王海波1，2，石宝友1，21.中国科学院生态环境研究中心饮用水科学与技术重点实验室，北京100085；2.中国科学院大学，北京100049；3.绍兴市上虞区供水有限公司，绍兴312300摘要针对饮用水管网系统可能存在的微生物风险问题，采用模拟不同处理条件下的输配水管道系统，通过宏基因组学分析探究微量磺胺甲恶唑以及次氯酸钠消毒对管道中生物膜与抗性基因组成的影响。结果表明，2gL1磺胺甲恶唑的添加对微生物群落以及抗性基因组成无明显影响，而浮霉菌门细菌表现出很强的抗次氯酸钠消毒能力。在未消毒条件下丰度前十的抗性基因与携带差异性抗性基因的细菌在消毒后丰度均明显有所下降，次氯酸钠消毒使 ARGs 总量下降了 91.9%，因此，次氯酸钠消毒通过控制携带抗性基因物种从而有效控制群落抗性基因的传播。同时，通过组间显著性差异的功能基因与组间显著性差异的抗性基因相关性分析，功能基因的变化情况与抗性基因变化情况一致，因此，长期消毒改变了细菌群落组成及其功能，并最终影响抗性基因传播。这项研究有助于控制长期运行的饮用水管网输配系统中可能存在的包括抗药基因在内的微生物相关风险问题。关键词磺胺甲恶唑；饮用水管网输配系统；细菌群落组成；抗生素抗性基因；宏基因组学饮用水安全问题对人类健康至关重要1-2。近些年饮用水安全方面的挑战涵盖了微生物的方方面面，通常细菌在饮用水管网输配系统(drinkingwaterdistributionsystems，DWDSs)的生物膜中自然定殖，并形成稳定的微生物生态系统3-4，这种稳态环境有利于细菌的生长并能够给其在面对消毒过程时提供一定的庇护作用，进而带来包括致病菌、抗性基因等微生物风险问题5。因此，探究长期运行的 DWDSs 生物膜的细菌群落组成对于控制饮用水微生物风险具有重要意义。抗生素抗性基因(antibioticresistancegenes，ARGs)会增强细菌宿主对抗生素的抵抗能力6-7，细菌产生 ARGs 通常需要一个稳定的环境，而生物膜恰恰能提供这种“温床”8-9，因此长期运行的DWDSs 生物膜最终可能导致微生物的 ARGs 风险。此外，包括磺胺甲恶唑在内的抗生素在临床上的广泛使用，不可避免地导致抗生素污染10-11。抗生素不仅会影响细菌的生长过程，还会对ARGs 的传播造成影响12-13。低剂量的抗生素(0.5mgL1)，如土霉素和磺胺甲恶唑，会加速活性氧的生成并促进 ARGs 的传播14。因此，探究微量抗生素对长期运行的 DWDSs 生物膜中 ARGs 的影响十分重要。饮用水处理和消毒被认为是 20 世纪最伟大的公共卫生成就之一15，消毒工艺通常被收稿日期：2023-04-03；录用日期：2023-05-12基金项目：国家自然科学基金资助项目(52070189，51838005)；国家重点研发计划项目(2019YFD1100105)第一作者：胡炽盛(1997)，男，硕士研究生，zshu_；通信作者：王海波(1981)，男，博士，副研究员，环境工程学报Chinese Journal ofEnvironmental Engineering第 17 卷 第 6 期 2023 年 6 月Vol.17,No.6Jun.2023http:/E-mail:[phone]认为能够抑制微生物的生长以及控制 ARGs 传播16。但同样有研究报道消毒对 ARGs 的形成存在促进作用17-20。因此，探究消毒是否对长期运行的 DWDSs 生物膜中的 ARGs 起到有效控制将有助于控制管网微生物风险。此外，消毒过程作为细菌遭受到的一种环境胁迫压力，往往会影响与细菌新陈代谢有关的功能基因21。但是关于功能基因与 ARGs 之间是否存在关系，目前研究报道不多。因此，本研究的目的是利用模拟不同处理条件下的 DWDSs，研究微量磺胺甲恶唑对细菌群落组成和 ARGs 的影响；通过长期模拟运行探究次氯酸钠消毒对 ARGs 的控制效果；最后通过相关性分析探讨功能基因与 ARGs 之间可能存在的关系，探讨消毒过程通过改变细菌的代谢过程从而影响细菌的生长进而控制 ARGs 传播。1材料与方法1.1实验水源与水质实验用水来自于中国东部一个饮用水处理厂(drinkingwatertreatmentplant，DWTP)。出水经过混凝、沉淀、砂滤处理。该原水的 pH 为 7.890.05，浊度为(1.240.10)NTU，耗氧量 CODMn为(3.000.14)mgL1，余氯质量浓度为 0，异养菌平板计数为(1205)CFUmL1，没有检测到总大肠菌群。1.2实验装置及实验设计实验在 1.50m 长全新的 PE 管材(DN60mm)中进行。管道进水为每日从 DWTP 处理后获取的60.0L 砂滤(SF)出水，并通过蠕动泵以 1.50mLs1的流速在各管中缓慢流过，运行为期 1a。共采用 9 根管道来模拟饮用水管网输配系统(DWDSs)，共设计 3 种实验条件，各条件有 3 个平行。条件 A1，不使用消毒剂的 SF 出水作为实验进水；条件 A2，在不使用消毒剂的 SF 出水添加2.00gL1的磺胺甲恶唑作为实验进水。条件 B1，SF 出水添加 2.00gL1的磺胺甲恶唑并使用次氯酸钠(NaClO)消毒剂进行消毒作为实验进水。其中，磺胺甲恶唑的添加质量浓度是考虑到了可能发生的磺胺类抗生素污染情况22；而以游离氯消毒的出厂水质量浓度一般控制在 0.30.8mgL123-24，因此，实验模拟管网进水游离氯质量浓度控制在 0.50mgL1。1.3管壁生物膜样品的采集及 DNA 提取在模拟的 DWDSs 运行 1a 后，将每根 PE 管切成 3 段，每段长约 50.0cm。使用无菌金属刮刀从管段内部采集生物膜，刮刀距离切口至少 40.0cm，以尽量减少污染的风险25。使用 FastDNASpinKitsforSoil(MPBiomedicalsCo.,USA)试剂盒的说明进行 DNA 提取。用 NanoDrop2000(ThermoFisherScienrific.,USA)和 TBS-380(YPH-Bio.,China)分别测量 DNA 质量浓度和纯度，并进行凝胶测试以验证其完整性(1%琼脂糖凝胶电泳)。每根管道 3 个 DNA 样品混合为 1 个样品，每个条件 3 个平行共 3 个 DNA 样品进行送样。1.4宏基因组学分析Illumina 高通量测序是用 HiSeq2000 平台进行的。宏基因组序列库由美吉生物公司构建。使用Fastp 软件(http:/ fastq 文件进行了过滤。使用 IDBA-UD/Megahit(https:/ Newbler(https:/ngs.csr.uky.edu/Newbler)对序列进行多重混合拼接组装。使用Prodigal 对拼接结果中的contigs 进行基因预测。使用CD-HIT 软件(http:/www.bioinformatics.org/cd-hit/)构建非冗余基因集。微生物群落组成分析利用 NR 数据库进行比对(参数 blastp；E105)，并通过 NR 库对应的分类学信息数据库获得物种注释结果，然后使用物种对应的基因丰度总和计算该物种的丰度。功能基因与京都基因与基因组百科全书(KEGG)的基因数据库进行比对(参数 blastp；E105)，再根据对应的基因丰度总和计算该功能类别的丰度。抗生素抗性基因(ARGs)与抗性基因数据库(CARD)进行比对(参数 blastp；E105)，将目标基因与其耐药功能注释信息结合，获得注释结2078环境工程学报第17卷果。以上基因丰度是用 TPM(transpermillion)，即基因丰度以该基因通过基因长度标准化后的基因丰度在该样本中所有基因长度标准化后的基因丰度总和中占比的百万倍表示。2结果与讨论2.1微生物群落分析1)微生物群落组成。如图 1(a)所示，当在 DWDSs 的进水中加入磺胺甲恶唑时，由 TPM 计算的生物膜中门分类水平微生物群落的总丰度仅改变了 0.09%。丰度前十的门分别为放线菌门、变形菌门、浮霉菌门、拟杆菌门、酸酐菌门、疣微菌门、蓝藻门、厚壁菌门、芽单胞菌门以及硝化螺旋菌门。在不添加消毒剂的情况下，放线菌门和变形菌门的细菌在条件 A1 和 A2 的生物膜中占主导地位，丰度总和占总细菌的比例分别为 83.1%和 83.7%。许多研究表明，这 2 个门类是不同管道图1群落门水平与种水平组成Fig.1Therelativeabundanceoftotalbacterialcommunitiesatphylumlevelandspecieslevel.第6期胡炽盛等：微量磺胺甲恶唑对饮用水管网生物膜群落及抗性基因的影响与控制2079生物膜中的主要的细菌类型26-27。而他们在 B1 中仅占比 24.5%，因此，消毒可以明显降低放线菌门与变形菌门的细菌在细菌群落中的比例。但同时，浮霉菌门细菌无论是占比(58.1%)还是相对丰度(TPM=70099.6)，均远远高于未消毒条件 A1 和 A2，表明浮霉菌门具有较强的抗次氯酸钠消毒能力。厚壁菌门的细菌在 3 种条件(A1、A2、B1)中的丰度依次为 6839.6、6607.8 和 6802.1TPM，消毒剂的加入并没有显著影响其丰度变化，因此，厚壁菌门的细菌也具有一定的抗消毒能力，这一结果与之前的研究结果类似26。种水平上未消毒条件下(A1、A2)的优势种中(图 1(b)，酸微菌 Acidimicrobium sp.BACL27 MAG-120823-bin4 在加入磺胺甲恶唑后其相对丰度值由 64879.8TPM(A1)升高至 80593.3TPM(A2)，相应地其相对丰度占比由 7.52%上升至 9.34%。因此，微量磺胺甲恶唑对生物膜中该物种丰度产生影响。而消毒条件下(B1)，酸微菌 Acidimicrobium sp.BACL27 MAG-120823-bin4 丰度仅占 B1 条件生物膜中所有细菌的 0.07%，酸微菌属于放线菌门，而该条件下丰度前 10 的细菌均属于浮霉菌门(图 1(c)。因此，消毒可以很好的控制包括酸微菌在内的放线菌门细菌生长，而浮霉菌门的细菌能够更好地适应消毒环境，对消毒表现出一定的抗性。2)物种的相似性与差异性。A1 与 A2 条件下的群落物种不仅在丰度上差异很小，在物种种类相似程度也很高，相同的物种占到了总物种的 97%以上(图 2(a)。因此，添加磺胺甲恶唑对微生物图2Venn 结果和组间显著性差异物种分析Fig.2TheVennresultsandMetastatsanalysisatspecieslevel2080环境工程学报第17卷群落组成的改变非常小。这一结果与之前的一项研究类似，即磺胺甲恶唑在环境相关质量浓度(0.8)(图 3(d)。因此，以上结果说明消毒对抗性基因的控制效果很大程度体现在对细菌的控制上。2)群落功能基因。微生物群落的功能基因包括碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、辅助因子和维生素的代谢、核苷酸代谢、脂质代谢、信号转导、复制和修复以及翻译等(图 4(a)。除信号转导外，部分功能基因的占比在加入磺胺甲恶唑后略有上升。而 NaClO 消毒使这些功能基因明显减少，这一结果与以前的研究结果一致31。另外，对不同功能基因贡献度靠前的细菌与携带耐药性基因的细菌几乎一致(图 4(b)。在A1、A2 与 B1 群落的功能基因组成中，碳水化合物代谢类的功能基因占比分别为 13.8%、13.9%和15.8%，在消毒处理后细菌的碳水化合物代谢基因水平出现了上升，说明面对消毒带来的环境胁迫压力时，生物膜中细菌可以通过调整碳水化合物相关过程的代谢来进行响应；与此类似的还有辅助因子与维生素相关的代谢，群落在面临消毒时同样出现了上调的现象，A1、A2 和 B1 条件下该功能基因占比分别为 5.47%、5.45%和 6.75%。与此同时，功能基因与物种的相关性分析同样说明不同条件下物种丰度与功能基因变化表现出很好的相关性(R20.8)(图 4(c)。因此，细菌抗性基因的变化极有可能是与功能基因的变化趋势一致。3)群落功能基因与抗性基因之间的关系。对丰度前十的群落功能基因在 KEGG 二级通路上与第6期胡炽盛等：微量磺胺甲恶唑对饮用水管网生物膜群落及抗性基因的影响与控制2081图3群落抗性基因组成，差异抗性基因以及携带耐药性基因物种Fig.3Therelativeabundanceofantibioticresistancegenes(ARGs)ofcommunities，theMetastatsanalysisonARGsandthecontributionofeachspeciestothedifferentARGs.2082环境工程学报第17卷图4群落功能基因组成，差异功能基因以及携带功能基因物种Fig.4Therelativeabundanceofantibioticfunctionalgenesofcommunities,theMetastatsanalysisonKEGGfunctionalgenesandthecontributionofeachspeciestothedifferentfunctionalgenes第6期胡炽盛等：微量磺胺甲恶唑对饮用水管网生物膜群落及抗性基因的影响与控制2083抗性基因进行相关性网络分析后，我们发现抗性基因与每一大类的功能基因之间存在不同程度的正相关性(图 5(a)。在对显著性差异的 ARGs 与 KEGG 三级通路的功能基因进一步分析后，发现存在显著性差异的抗性基因与功能基因(图 3(d)与(图 4(d)之间仍然存在相似结果，即每一种抗性基因均与各种的功能基因有着不同程度的正相关关系(图 5(b)。这一结果表明次氯酸钠是通过改变物种并影响其功能基因进而改变抗性基因的丰度。很多研究中都报道了功能基因对于耐药性基因的形成存在影响，例如中心碳代谢功能影响结核分枝杆菌的耐药性32，群体感应影响耐药性基因的产生33。与此同时，当环境压力改变细菌群落组成时34，物种功能基因往往也会进行改变35。因此，当次氯酸钠消毒显著引起生物膜群落变化时，群落中微生物的功能基因也发生了相应的变化，最终也会影响其耐药性基因的形成。在图 5(b)中，抗性基因 oleC 是唯一与 ABC 转运蛋白功能基因呈正相关关系。细菌在某些应激条件下产生细菌素和微毒素会对周围物种产生一定的抗菌活性以便自身生存，而 ABC 转运蛋白能够帮助细菌通过免疫蛋白或者转运等方式保护自己36。在 A1、A2 中 oleC 主要存在于放线菌门的细菌中，在添加磺胺后 oleC 的丰度占比上升了 0.14%(图 3(b)，但放线菌门的细菌的丰度却出现了下降(图 1(a)。因此，磺胺甲恶唑可能作为外源性刺激物质造成 ABC 转运蛋白功能水平的上升，进而赋予携带 oleC 抗性基因物种更强的生存优势并最终使得 oleC 抗性基因保持更高的丰度水平，同时研究证明由 oleC 的抗生素抗性效果源自 ABC-转运体的外排转运系统37。但由于放线菌门的细菌并不能适应长期的消毒，导致其细菌丰度下降，进而使得功能基因与抗性基因也出现相同的趋势。因此，oleC 抗性基因的产生与细菌功能基因的关系紧密。除 oleC 外，其他抗性基因均与各类图5群落抗性基因与功能基因、显著差异性群落抗性基因与功能基因之间的相关性网络分析Fig.5ThenetworkanalysisrevealingtherelationshipbetweenARGsandfunctionalgenesforcommunities，ARGswithKEGGfunctionalgenesandnetworkanalysisbetweenARGsandfunctionalgenesinsignificantlydifferentcommunities2084环境工程学报第17卷功能基因存在正相关性，包括氨基酸生物合成，碳代谢，嘌呤代谢，嘧啶代谢，氧化磷酸化，群体感应以及氨基酸-tRNA 的生物合成等。早先的研究证明了不同的输配水系统条件所施加的选择压力影响群落结构以及功能特性和代谢潜力水平的变化38，因此，当群落处于长期消毒时，群落的组成发生变化，上述类型的功能基因与抗性基因也随之变化。3结论1)2gL1磺胺甲恶唑的添加对生物膜细菌群落结构组成无明显影响，次氯酸钠消毒对不同细菌包括变形菌门和放线菌门有很好的控制效果，但浮霉菌门与厚壁菌门细菌表现出很强的抗次氯酸钠消毒能力。2)在未消毒条件中丰度前 10 的抗性基因(包括 Saur_rpoC_DAP、macB、mfd、aminocoumarinresistant alaS、Mtub_katG_INH、mtrA、oleC、Mtub_ropB_RIF、Ecol_ropB_RIF、patA)在次氯酸钠消毒后含量下降明显，ARGs 总量下降了 91.9%，同时携带差异性抗性基因(macB、patA)的细菌在消毒后数量也出现明显下降，因此，次氯酸钠消毒通过控制携带抗性基因物种从而有效控制抗性基因传播。3)抗性基因的形成与细菌功能代谢变化有关。组间显著性差异的功能基因(包括氨基酸生物合成、碳代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、氧化磷酸化、群体感应以及氨基酸-tRNA 的生物合成)与组间显著性差异的抗性基因存在良好的正相关关系。因此，长期消毒改变了细菌群落组成及其功能，并最终影响抗性基因传播。参考文献HOZALSKIRM,LAPARATM,ZHAOX,etal.Flushingofstagnantpremise water systems after the COVID-19 shutdown can reduceinfectionriskbyLegionellaandMycobacterium sppJ.EnvironmentalScience&Technology,2020,54(24):15914-15924.1张明露,周贺,关磊等.饮用水配水系统中微生物研究方法的进展J.环境与健康杂志,2015,32(5):458-462.2TANG W,LI Q,CHEN L,et al.Biofilm community structures andopportunisticpathogengenemarkersindrinkingwatermainsandtheroleofpipematerialsJ.ACSES&T.Water,2021,1(3):630-640.3祝泽兵,裴云燕,单莉莉等.供水管网生物膜中微生物种间相互作用及 其 影 响 因 素 综 述 J/OL.环 境 工 程:1-152023-03-17.http:/ J P S,GUPTA V V S R,STANGE C,et al.Prevalence ofantibioticresistanceandvirulencegenesinthebiofilmsfromanaquiferrechargedwithstormwaterJ.WaterResearch,2020,185:0043-1354.5LIANGJ,MAOG,YINX,etal.Identificationandquantificationofbacterial genomes carrying 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sourcewaterinFinlandJ.WaterResearch,2023,229:119495.38(责任编辑：曲娜)2086环境工程学报第17卷Influenceofmicro-sulfamethoxazoleonthebiofilmbacterialcommunitiesandantibiotic resistance genes in drinking water distribution systems and itscontrolHUChisheng1,2,MAXu1,NIJiong3,WANGLiang3,WANGHaibo1,2,*,SHIBaoyou1,21.KeyLaboratoryofDrinkingWaterScienceandTechnology,ResearchCenterforEco-EnvironmentalSciences,ChineseAcademy of Sciences,Beijing 100085,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China;3.ShaoxingShangyuwatersupplycompany,Shaoxing312300,China*Correspondingauthor,E-mail:AbstractForthemicrobialriskinthewaterofdrinkingwaterdistributionsystems(DWDSs),metagenomicanalysis was used to investigate the effects of micro-sulfamethoxazole and NaClO disinfection on biofilmbacterial communities and antibiotic resistance genes(ARGs)in the simulated DWDSs under differenttreatments.The experimental results showed that the bacterial communities and ARGs did not changesignificantlywithadditionof2g-L1sulfamethoxazole,whilethebacteriaofPlanctomycetesatphylumlevelshowedastrongresistancetoNaClO.TheabundanceoftoptenARGsandthebacteriacarryingdifferentialARGsdetectedbeforedisinfectionbothdecreasedsignificantlyafterdisinfection.ThetotalabundanceofARGsdecreasedby91.9%duetotheinfluenceofNaClO.Therefore,thespreadofARGswascontrolledbytheNaClOdisinfectionbecauseofitsinhibitiononthebacterialspeciescarryingARGsgrowth.Meanwhile,thecorrelationanalysisbetweenfunctiongenesandARGswithsignificantdifferencesamonggroupsshowedthatthechangesinfunctiongeneswereconsistentwithchangesinARGs.Therefore,longdisinfectionchangedthebacterialcommunitiesandtheirfunction,whichaffectedthepropagationofdifferent