微生物脂肪酶催化合成中长链脂肪酸结构脂的研究进展_戚彩琴.pdf

食品与发酵工业 （）：引用格式：戚彩琴，杨波，杨光，等 微生物脂肪酶催化合成中长链脂肪酸结构脂的研究进展 食品与发酵工业，（）：，（）：微生物脂肪酶催化合成中长链脂肪酸结构脂的研究进展戚彩琴，杨波，杨光，周盛敏，刘晓君（上海理工大学 健康科学与工程学院，上海，）（丰益（上海）生物技术研发中心有限公司，上海，）摘 要 中长链脂肪酸结构脂（，）是一种根据脂质在体内消化和吸收特点所设计的一种特殊结构脂质，由天然油脂改性而来，甘油分子上同时结合着中链与长链脂肪酸，因其具有独特的代谢方式与特殊的生理功能，在食品与医药方面展现出丰富的应用潜力。针对酶促合成 的生物催化剂（固定化微生物脂肪酶）、合成方法、的生理功能及应用等研究现状进行综述，并对比了各种方法的优缺点及适用方向，对 的研发前景进行了展望，以期为进一步研究 及其他相关功能性结构脂的开发应用提供理论指导。关键词 中长链脂肪酸结构脂；微生物脂肪酶；酶促合成；生理功能；应用第一作者：硕士研究生（杨波副教授和周盛敏教授级高级工程师为共同通信作者，：；）基金项目：上海市科技创新行动计划项目（）；上海市人才发展资金资助（）；上海市青年科技启明星计划资助（）收稿日期：，改回日期：结构脂（，）是一种改性油脂，又常被称为设计脂。在早期的论文和书籍章节中，狭义的结构脂定义被明确为结构脂是根据脂质在体内消化和代谢过程所设计的一种特殊的脂肪，通过改变天然脂质中的脂肪酸组成以及各种脂肪酸在甘油三酯（，）中的位置，并将具有特殊营养或生理功能的脂肪酸结合到特定位置，从而最大限度地发挥各种脂肪酸的物理和功能性质。而后，的定义范围逐渐扩大，经化学或酶改性的油脂都属于结构脂的范畴，其中包括单甘酯、甘二酯、人乳脂、类可可脂、富含不饱和脂肪酸花生四烯酸、二十碳五烯酸（，）、二十二碳六烯酸（，）、共轭亚油酸等油脂，还包括中链甘油三酯（，）、中长链甘油三酯、人造奶油和其他塑性脂肪等。中长链脂肪酸结构脂（，）是一类新型的结构脂质，又常被称为中长链甘油三酯，由中链脂肪酸（，）和长链脂肪酸（，）结合于同一甘油分子上而形成。因此，基于甘油三酯中、及 位置的差异和脂肪酸碳链长度的不同，可分为 型、型、型和 型，如图 所示。不仅可以发挥 减少体脂肪累积的功能，还具有一般食用油的烹调特性，与 相比，显著提高了烟点，减少了煎炸时起泡状况，扩大了 在食用油中的应用。图 结构简略示意图 注：代表中链脂肪酸（）；代表长链脂肪酸（及以上）酶的来源及位置特异性 在自然界中很少存在，等研究发现，母乳中的 约占总甘油三酯的，且与 型甘油三酯相比，型甘油三酯含量最多。除此之外，一般需要人工合成，常采用化学法及酶法。若采用化学合成法，则无法控制在甘油分子上定位分布某种特定脂肪酸，且副产物多，分离纯化困难，因此大多数研究者倾向于选择酶法合成。酶法合成结构脂具有反应条件温和、安全性高、选择性高、副产物少等优点，近年来仍旧是油脂行业的研究热点之一。脂肪酶属于水解酶，能够催化水解和酯化反应。通常，脂肪酶的活性位点负责其催化活性，它由丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸或谷氨酸（）的三联体组成。脂肪酶催化酯化的机理包括 个步骤。在第一步中，丝氨酸的活性位点通过使用组氨酸和天冬氨酸去综述与专题评论 年第 卷第 期（总第 期）质子化而被激活；然后，丝氨酸活性位点与底物的羰基反应形成酰基酶中间体，由氧阴离子孔稳定；最后，亲核试剂（例如甘油单酯）攻击酰基酶中间体以释放产物并再生未占据的催化位点，从而进行脱酰化。脂肪酶广泛存在于植物、动物、昆虫和微生物中。在脂肪酶的各种来源中，微生物是最具有研究价值的来源，因为它们具有巨大的工业潜力，易于培养处理，可获得性高，而且微生物脂肪酶比植物和动物脂肪酶具有更高的稳定性。特异性是描述脂肪酶工业应用的一个重要标准，根据这一标准，脂肪酶可分为三大类：底物特异性、区域特异性和立体特异性脂肪酶，其中，区域特异性脂肪酶又分为非特异性、，特异性和脂肪酸特异性酶。针对 和 型结构脂的酶法合成，大量研究者使用的是具有，特异性的微生物脂肪酶，表 列出了一些合成 的常见脂肪酶种类。表 合成常用的酶催化剂 名称来源特异性固定化材料参考价格参考文献 米黑根霉，树脂 元 元 羊毛热霉菌，硅胶 元 元 米曲霉，大孔树脂 南极假丝酵母，树脂 米赫根毛霉，树脂 海洋微生物 菌株，树脂 南极假丝酵母，树脂 元 元 目前，研究使用最广泛的酶主要有 、，其中，的价格低于其他脂肪酶，且针对不同底物来说，这几种固定化脂肪酶的活性及特异性也有所差异。等利用大豆油与 进行酯交换反应，发现几种固定化脂肪酶表现出的活性大小为 ；同样的，等将富含花生四烯酸的真菌油与 进行酶促酯交换反应，同样对这 种固定化脂肪酶进行了反应活性比较，结果表现为 。基于此，脂肪酶的催化活性大小，在催化不同底物或在不同反应条件下常常有所差异。的酶促催化合成方法通常，酶促催化 合成的方法包括直接法和间接法。直接法根据使用的底物不同，又分为直接酯化法、酯酯交换法以及酸解法，间接法一般指两种直接法的组合，也称两步法。表 列举了近几年酶促催化合成 的最新研究。直接酯化法以甘油和游离脂肪酸为底物，在脂肪酶的催化作用下合成 的方法即为直接酯化法。反应方程如图 所示。图 直接酯化法制备 的反应示意图 注：表示长链脂肪酸；表示中链脂肪酸（下同）直接酯化法的优点是反应一步完成，反应产物易分离且副产物少。杨剀舟利用 催化辛酸、癸酸、油酸和甘油酯化合成中长链甘油三酯，在最佳反应条件下合成再经纯化后得到含中长链甘油三酯 的产品。但反应过程中产生的水可能会使得酶表面水膜加厚，从而阻碍底物与酶的结合反应。此外，因为底物中不含任何来自植物油的天然抗氧化剂，导致产品的稳定性会大受影响。食品与发酵工业 （）酯酯交换法两种甘油三酯之间或甘油三酯与脂肪酸酯之间在脂肪酶的催化作用下发生酰基交换的反应即为酯酯交换。反应方程式如图 所示。图 酯酯交换法制备 的反应示意图 此方法下的底物常为 与长链甘油三酯（，），原料易得且成本较低。酯酯交换法目前是合成 最广泛应用的手段。周盛敏利用 催化菜油与 的酯交换反应，在优化条件下合成的毛油中 含量约，而后通过分子蒸馏、脱色脱臭等工艺纯化后，含量达到 。等利用脂肪酶 催化富含花生四烯酸的单细胞油与 在无溶剂系统中发生酯交换合成富含 的结构脂，结果在最佳反应条件下 的产率为。不过，此法的问题在于难以控制产物结构的特异性，造成反应产物复杂不利于分离的弊端，因此仍需完善。酸解法酸解被认为是在甘油骨架上引入新型脂肪酸以改善甘油三酯分子的物理化学和营养特性的最成功的方法之一。在酶的催化作用下，甘油三酯与游离脂肪酸之间发生酰基交换的反应称为酸解反应。反应方程如图 所示。图 酸解法制备 的反应示意图 基于，特异性脂肪酶的广泛应用，酸解反应合 成 的 最 常 见 的 结 构 脂 是 型。等以金枪鱼油和癸酸为原料制备富含 和 的甘油三酯，在最佳工艺条件下，制得的甘油三酯中 的含量为，比原料金枪鱼油中 含量高 。酸解法具有反应产物易分离的优势，但由于脂肪酸价格高，且反应后仍会有相当数量的游离脂肪酸，甚至于高比例的脂肪酸产生的酸性条件可能会限制酶活力，因此酸解法的使用仍然受局限，暂不适于工业应用。两步法两步法合成结构化脂质的过程一般是指将两种方法组合起来进行酶促反应，如先酯化再酸解、先醇解再酸解等，后者是最典型的一种方法，具体为在脂肪酶的催化作用下，先对天然油脂进行醇解，产生的单甘酯再与脂肪酸酯化的反应，此过程又被称为醇解酯化反应。两步法在结构脂的合成过程中可以使脂肪酸的插入率提高，有利于制备出高质量的结构脂质。等第一步将微藻油和乙醇在 催化下进行醇解反应，用于生产 位单甘脂（，），然后第二步用辛酸对纯化的 进行酯化以生产辛酸硬脂酸辛酸型，最终产物中含有的辛酸和的 多不饱和脂肪酸。与此类似的有，姜萱等首先利用 催化藻油发生醇解反应后获得富含 综述与专题评论 年第 卷第 期（总第 期）的单甘酯，再催化单甘酯和癸酸发生酯化反应合成 位富含 的，结果所得的总 含量占，含 的 占，且 占 位脂肪酸的。虽然此法下的合成产物纯度及得率较高，但反应时间过长，整个反应过程操作复杂繁琐，在 的制备应用研究中并不广泛。由表 可知，近年来研究学者对于生产 的合成方法主要着眼于酯酯交换法与酸解法，因为这两种方法较直接酯化法而言，原料植物油中具有天然存在的抗氧化物，可以弥补直接酯化法产品氧化稳定性较低的缺陷，较两步法而言，耗时相对较短且反应过程较简单。若是研究旨在合成某种特定构型的（如 型）时，酸解法比酯酯交换法显示出更好的位置特异性，产品纯度相对较高；而若是研究目的仅是合成 时，酯酯交换法比酸解法成本更低，产物分离纯化时脱除的游离脂肪酸更少，即原料损耗更少成本低廉。基于此，针对研究目的的不同以及学者的需求，合成方法的选择也大不相同。表 酶促催化合成的最新研究 反应类型底物及其摩尔比固定化酶加酶量反应温度反应时间搅拌速率（）辅助手段反应器反应结果参考文献酯酯交换棕榈酸甲酯三辛酸甘油酯 （以底物总重量计）间歇 最终得到含双长链 的产物，这些双长链中，棕榈酸辛酸（）的含量占酯酯交换三辛酸甘油酯微生物油米曲霉脂肪酶底物总质量的间歇 最终产物中、和的占比分别为、和酯酯交换椰子油高油酸菜籽油 底物总质量的间歇，油酸中链脂肪酸结构的的最大产率为酸解酯酯交换精漂脱臭油脂辛酸精漂脱臭油脂三辛酸甘油酯 底物总质量的间歇酯交换（等效碳数为 的在总中的含量为，猜测为，辛酸油酸组成的）；酸解（等效碳数为 的在总中的比例）酸解鱼油乳脂脂肪酸鱼油质量的间歇酸解产物中，位的脂肪酸分析中和的含量分别为和，位的脂肪酸分析中饱和脂肪酸的含量约为酸解藻油月桂酸 底物总质量的间歇 富含的结构脂中，月桂酸和在总脂肪酸中的含量分别为和酸解玉米油辛酸底物总质量的超声间歇 产物的总脂肪酸组成分析中，辛酸的含量为酸解葡萄籽油癸酸一种米根霉食品级脂肪酶底物总质量的间歇 产物的总脂肪酸组成分析中，癸酸的含量为酸解三油酸甘油酯和橄榄油癸酸和月桂酸 底物总质量的间歇 结构脂产物中，的掺入率大约为 酸解葡萄籽油癸酸 填充床 癸酸在葡萄籽油中的掺入度达到（）两步裂殖酵母微生物油乙醇 （质量比）；癸酸 底物总质量的底物总质量的室温无真空间歇醇解产物经纯化后在总脂质组成中的含量达到；：组成的甘油三酯（包括异构体）在总甘油三酯中占 在 的合成中，通常使用两种类型的反应器系统，即间歇系统和连续系统。前者被广泛用于研究人员在实验室中收集数据，设备及操作较为简单；后者在工业应用中更为常见，表现为底物连续进料到反应器中，剩余的或未反应的底物与产物一起连续流出反应器。此外，专利 中曾报道了使用填充反应器代替普通搅拌釜反应器生产 的酯化过程，表明了填充床反应器不仅可以防止固定化酶的断裂，且与在间歇反应器中进行酯交换相比，填充床反应器能显著缩短 生产的持续时间。在酶促反应中，温度、底物摩尔比、反应时间和加酶量等反应参数非常重要，它们会显著影响反应产物的得率，因此，多数研究中往往第一步就是反应条件的探索与优化。一般来说，合成的最佳反应条件范围一般是反应温度 ，酶载量 ，搅拌速度 和反应时间 。合成过程中酶的特异性也可能受到反应体系介质的影响。酶促催化合成 的反应体系主要分为微水条件下的无溶剂体系、有机溶剂体系和超临界体系。虽然在食品系统中允许使用有机溶剂，但最好使用无溶剂系统，因为后者可以提供安全和高质量的产品，减少对环境的负担。因此，目前为止大多数研究都集中在无溶剂体系中的酶促酯交换。值得一提的是，为了能提高酶促反应中脂肪酶的催化活性，研究人员会利用不同的物理辅助手段对酶促反应的整个体系进行处理，或者直接食品与发酵工业 （）处理脂肪酶而后再将其用于催化反应，这些处理手段有超声、超临界等。的代谢途径、生理功能及应用 的代谢途径 的消化过程可分为十二指肠前消化（包括口腔和胃消化）和小肠消化。尽管脂质在口腔和胃中的消化有限，但是十二指肠前消化产物可以促进 的乳化，改变其界面特性，能够促进酶与脂肪滴的结合从而辅助 的肠道消化。如图 所示，在小肠消化过程中被水解为 和游离脂肪酸，其中一部分脂肪酸经过门静脉直接到达肝脏，氧化为人体供能。在单甘酯酰基转移酶（，）和双甘酯酰基转移酶（，）作用下，小肠上皮细胞吸收的 和剩余脂肪酸重新合成新的甘油三酯，然后组装成乳糜微粒。随后，乳糜微粒通过淋巴循环转移到血液中，可以进入肝脏后被肝脏内皮细胞代谢，也可以进入其他组织中被利用或贮存在脂肪组织中。在代谢方面克服了 的劣势，在没有胰脂肪酶的情况下也可以水解，同时其可以通过进入门静脉直接吸收，或者不依赖转运蛋白，通过形成乳糜微粒进入淋巴系统。图 的体内代谢途径 的生理功能 在同一个甘油分子中同时含有 和，既可以提供足够的能量和必需脂肪酸，同时也不易因 氧化产生酮体。产品作为一种替代传统油的新型健康食用油，其安全性和功能性已在欧美、日本等发达国家获得认可。年 月，我国卫生部也批准认可了中长链脂肪酸食用油作为新资源食品，这表明 的安全性已大受认可。据报道，下面对 的生理功能进行阐述。有效抗肥胖和降低胰岛素抵抗近年来，作为一种预防和控制肥胖的功能性油脂被广泛研究，诸多学者已经进行了多项动物实验和临床实验来研究其抗肥胖作用，虽然实验结果之间会存在一些差异，但的确证实了 在控制体重、体脂和代谢方面具有重要意义。等以山茶油和樟树籽油为原料，通过酶促反应合成了一种新的，将其用于饲养 周龄雄性小鼠（），持续 周，同时与 组饲养组对照，结果发现 组明显减轻了体重和脂肪沉积，血浆三酰甘油、血浆总胆固醇和肝脂分别降低了 、和 ，另外 组粪便脂质及与脂质动员相关的酶水平有所升高，由此判断 可能是通过调节 小鼠中与脂质动员相关的酶来减少体脂沉积。类似地，等利用瑞士雄性小鼠设置了 组饮食对比，分别是对照饮食、猪油高脂肪饮食（，）、猪油和葡萄籽油等量混合饮食（）以及猪油和富含癸酸的结构油等量混合饮食（），研究表明 组的小综述与专题评论 年第 卷第 期（总第 期）鼠体重增加减少，白色脂肪组织重量减少，因此由葡萄籽油和癸酸酸解合成的此类结构脂有望成为一种能够减轻肥胖并发症的功能性油。当前，体外细胞研究、动物研究以及一些临床人体研究揭示了 在改善胰岛素敏感性方面具有有益作用，于是，含有 的 被合理推测具有改善胰岛素抵抗的功能性，且已有研究报道证明了此结论。等比对了 与 对糖尿病 小鼠高血糖的影响，观察到在自由进食状态下，组的血浆葡萄糖显著降低，胰岛素浓度显著高于 组（），这表明饮食中 的摄入能够延迟 小鼠高血糖症的发展，推测可能是通过刺激腹腔内脂肪组织摄取葡萄糖引起胰岛素分泌增强。等也证实了食用酶促酯交换 可以改善胰岛素敏感性，可能是由于胰腺中内脏脂肪积累较少，导致对胰岛 细胞施加的压力较小，从而增加胰岛素敏感性，更加有效地调节血糖水平。因此，食用 不仅可以减少体内脂肪堆积，还可以通过提高胰岛素敏感性来缓解 型糖尿病。良好的临床营养治疗辅助营养治疗是重症患者和术后患者综合治疗的重要组成部分，因为持续的营养不良会导致免疫功能障碍、代谢紊乱、肝功能损害，影响患者的恢复。与 相比，在降低早期肝脏生化指标如天冬 氨 酸 氨 基 转 移 酶（，）、丙氨酸转氨酶（，）和总胆红素（，）方面效果很好，治疗组在加速 和 的降低方面表现出相较于其他脂肪内脂的优势，基于生物催化 的脂肪乳剂可以最大限度地利用脂肪酸进行肝脏再生。此外，乳剂还被证明了对烧伤大鼠的体重增加、氮平衡和血清白蛋白浓度有良好影响，在接受脂质乳剂肠外营养的中国患者中，与 相比，可以改善机体的营养状况和免疫功能，并减少炎症和其他不良影响，缩短住院时间。对癌症患者来说，免疫功能低下会在一定程度上加速癌细胞的扩散，因此，邹桂珍等探讨了 乳剂对胃肠癌患者术后细胞免疫功能的影响，认为术后及早给予胃肠道肿瘤病人结构脂肪乳营养支持能纠正免疫抑制，对提高细胞免疫功能有十分重要的临床意义。值得一提的是，中含有的特殊长链脂肪酸如 和，也能够抑制肿瘤细胞的生长，具有防癌抗癌的效果。其他功能性除此之外，还有助于促进脂溶性微量营养素的生物利用度，也能在一定程度上改善抑郁。含有 的膳食脂质或药物递送系统可能更易消化，但脂溶性营养素或药物的生物利用度较低，相反，可以被消化并形成混合胶束，可以溶解亲脂性生物活性物质，从而实现高生物利用度，因此与 相比，被认为可以提高脂溶性营养素的生物利用度。针对 对缓解抑郁的影响效果，等以小鼠为对象进行了研究，发现 的摄入导致强迫游泳测试中的不动时间显著减少，而且，饮食组的小鼠海马 与 的比率显著高于 饮食组。这表明，将是一种富有潜力的食品补充剂，可以保持大脑健康避免抑郁症的出现。的应用基于 的各类功能性，其被广泛应用于医药和食品领域。医药方面，常被用作术后患者的肠外营养补充，不仅可以提供能量和必需脂肪酸，还有助于改善免疫加速恢复。国外广泛应用的以 为基料油的结构脂肪乳产品主要有瑞典的（，）和（，），另外 公司的 系列产品也多用于药品、营养保健等各种领域，国内的相关产品主要有力文（华瑞制药，技术来自德国费森尤斯卡比公司），。食品方面，可以被用作健康食用油、能量棒、人造奶油、人造黄油和起酥油、饮料和煎炸油等。第一个商业化的 是 （日清奥利友集团），它是将 与菜籽油发生酯交换反应生产的，商品名为。后来，产品引起广泛关注并逐渐兴起，美国 的 产品具有 的超长碳链，具有与可可脂相似的熔融特性和口感质地，既可以用作糖果表面的巧克力涂层，也可以用于制作软点心。最近，由于发现 与母乳具有相似的甘油三酯和脂肪酸组成，其又被认为是一种有价值的人乳脂肪替代品而受到诸多关注，。这些应用研究表明，产品具有广阔的商业化前景。结语与展望 凭借其既能补充人体必需脂肪酸，又能快速代谢不堆积脂肪，且还可以提高人体免疫力等生理食品与发酵工业 （）功能，在食品及医药领域成为瞩目的焦点，具有广阔的应用价值和开发前景。基于其应用度的不断提高，需要仔细选择合适的酶促合成方法、固定化酶的种类及优化反应条件等以提高 的合成产率及效率并降低生产成本。酶法制备 因其具有产物特异性高、反应条件温和、对环境友好等优点从而被广泛研究，催化剂固定化脂肪酶对不同的底物发挥出的催化能力也不同，需要探索更丰富的酶的来源以提高产物质量并降低成本。此外，针对不同种类的 的消化吸收特性以及更详细的调节营养功能的机制仍需深入探索，以期拓宽 的开发及应用。参考文献 ，：，（）：王苑力，李桐，郭咪咪，等 中长链脂肪酸结构脂质及其制备工艺研究进展 中国粮油学报，（）：，（）：，：，（）：周盛敏 中长链脂肪酸结构脂的酶法合成、安全性评价及减肥功能研究 上海：上海交通大学，：，：李闯 中长链脂肪酸甘油三酯的酶法制备及对小鼠脂代谢的影响 石家庄：河北科技大学，：，：，：汪玲 微生物脂肪酶的性质及应用 生物化工，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，：，（，），（）：，：，（）：，：，：杨剀舟 医用中长碳链甘三酯的研制 郑州：河南工业大学，：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：姜萱，杨瑶，徐秀丽，等 酶法合成 位富含 的中长链结构脂 中国油脂，（）：；，（）：；，（）：，：，：，综述与专题评论 年第 卷第 期（总第 期），：，（），（）：，：，：，：，：，（），（）：滕桂平 结构脂质合成及超临界流体色谱分析 贵阳：贵州大学，：，：熊超越 中长链结构脂肪及其乳液的制备和减脂功效研究 南昌：南昌大学，：，（）（，），（）：，（）：，：，（）：，（）：，（），：，（）：，（）：邹桂珍，魏凯 结构脂肪乳对胃肠道肿瘤病人术后细胞免疫功能的影响 临床外科杂志，（）：，（）：，：，（）：，（）：钟凯，葛赞，计晓黎，等 结构脂质的合成及应用 化学与生物工程，（）：，（）：，：，（，）（），）（），（），；