PCR技术(环境微生物).ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,*,聚合酶链式反应（PCR）,1,概述,原理,流程,操作方法,应用,2,一、PCR的,概述,：,PCR（polymerase chain reaction),：,Polymerase:,DNA,聚合酶,聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。,也,称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术,近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。,3,DNA扩增的传统方法：,一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂，需数周到数月的时间，且不利于普及。,4,PCR技术的发展历史,关于,PCR,的文章首次由美国科学家,Kary Mullis,等人在,Science,杂志上发表,Science,杂志报道了耐热性,DNA,多聚酶,Taq,酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的,DNA,聚合酶）的发现,预示着分子时代的到来。,12,月,Science,杂志将,PCR,和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。,1993 Kary Mullis,因,PCR,的发明获得诺贝尔化学奖。,5,优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。,PCR能将微量的DNA大幅增加，因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。,6,PCR技术的原理,遗传物质：,细胞核,染色体,DNA（脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基构成),碱基（A、T、C、G）是按双链螺旋排列的，碱基序列的,长度和排列的顺序决定了生物的多样性。,比如人类体细胞中共有31亿个碱基对，按上述的0.1%的差，人和人之间有3百万个碱基对的差别。,7,PCR的原理,2,：,用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。,以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端互补的寡核苷酸,片段（只有20个以下碱基的核苷酸的总称）,为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。,8,PCR的原理3,PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性低温退火引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。,9,扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反应步骤分三步：,1.变性(Denaturation)：,加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94 30,2.退火(复性)(Annealling):,突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55 30,10,3.延伸(Extension):,将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物的 3 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。72,上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2540个循环后DNA可扩增10,6,10,9,倍。,11,PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y(1X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。,反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多,数情况下，平台期的到来是不可避免的。,12,双链DNA分子,13,双链断开,循环1,14,模板与引物结合,循环1,Taq,Taq,15,循环1,Taq,Taq,16,循环1,17,循环1,18,双链断开,循环2,19,模板与引物结合,循环2,Taq,Taq,Taq,Taq,20,循环2,21,94变性,双链断开,循环3,22,循环3,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq,23,循环3,24,循环n,25,PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期，原来的DNA担负起使模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物5 端之间的DNA片段。,26,标准的PCR反应体系：,10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg,2+,1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul,27,三、PCR的成分和作用：,1.缓冲液：,10 50 mM Tris-Cl,（三氨基甲烷）,(pH8.4),维持 Taq 酶作用环境的偏碱性,25 50 mM KCl,促进引物退火，50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。,100g/ml 牛血清白蛋白(BSA),对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20,、,二硫苏糖醇(DTT)也有类似作用。,28,2.MgCl,2,:,1.5 2.0 mM,Taq 酶具有 Mg,2+,依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。,29,3.dNTPs:,dATP、dGTP、dCTP、dTTP底物,0.02 0.2 mM,dNTPs 可与 Mg,2+,结合，应注意Mg,2+,浓度与dNTPs,浓度之间的关系，Mg,2+,浓度比 dNTPs 浓度高 0.2 2.5 mM。,过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入,率和室验成本。,过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。,30,4.引物(Primer-P)：,预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。,0.2 1 M,偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间,形成引物二聚体，产量降低。,偏低：产量降低。,31,5.Taq DNA 聚合酶：耐高热,0.5 5 U/100 l,1U/25 50l,偏高：引物非特异产物的扩增,偏低：产物量降低,32,6.模板DNA(Template):,最低10,2,10,5,bp DNA片段，实际用量远远,超过此量，用量需在实验中摸索。1 5 l,过高：非特异产物增加,过低：产量降低,7.水：,去离子水，补足整个反应体积。,33,PCR实验,实验材料,1模板：细菌DNA,2 T,a,gDNA聚合酶,3dNTP混合液,410倍浓度PCR缓冲液,52.5mmol/LMgCl2,6RAPD引物：S14 S15 S18 S66 S74 S88 S97 S103 S110 S115,7提取细菌DNA的相关试剂,34,操作步骤,1细菌染色体DNA的提取,2RAPD反应体系的配置,35,3反应程序：,将RAPD反应试剂加入EP管中,轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发，盖好盖子,36,打开PCR反应仪输入以下反应数据,94 摄氏度预变性5min,94摄氏度变性40s,40摄氏度退火40s,72摄氏度延伸1min,将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸10min,仪器为Model MyGene 25 Plus,37,PCR扩增产物的分析,1、凝胶电泳分析法：,聚丙烯酰胺凝胶电泳灵敏度远高于琼脂糖电泳，,用于探讨PCR扩增的灵敏度效果好，但配制复杂，,常用琼脂糖凝胶电泳。,2、点杂交,3、微孔板杂交法,38,PCR技术的局限性,为了构建特定引物，使特定DNA序列的选择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的数据库。,聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素需要优化反应条件。,PCR技术扩增产物的长度有限。,39,PCR技术的主要用途,1、目的基因的克隆：,PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基,因片段提供了简便快速的方法。,2、基因的体外突变：,可以随意设计引物在体外对目的基因片段,进行嵌和、缺失、点突变等改造。,40,3、DNA和RNA的微量分析：,PCR技术高度敏感，对模板的含量要求很低，是DNA和NA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。,4、DNA序列测定：,PCR技术的引入使DNA测序工作大大简化，也提高了测序的速度。,5、基因突变分析：,利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。,41,DNA指纹技术 1,1984年英国的遗传学家Alec Jeffreys在进行肌红蛋白的DNA序列研究时，意外发现非功能DNA（不产生蛋白的DNA）上重复着一种小片段DNA，这一含15个左右碱基的DNA片段，在不同个体间重复的频率及位置有明显的不同，Jeffreys首先在自己的DNA上进行研究，验证了这一技术，如果我们有血缘关系，这些不同会大大缩小。,42,DNA指纹技术 2,采集血样（毛发、精液、口腔粘膜细胞），分离DNA，用PCR将选定的DNA片段放大，并进行对比，统计分析，便可得出是否为作案凶手或是否有血缘关系。,43,PCR在环境监测中的应用,不同的微生物病原体具有不同的致病剂量，因此确定水样中病原体的数量和种类,提高,检测的准确度显得异常重要,水体污染问题已引起了人们的极大关注,确定自然水体或污水水样中受病原体或化学类污染物污染的程度和快速 确定污染源是一个难点问题,。,饮用水样品中只有不到1%的微生物可经实验室培养。因此,用传统培养方法研究微生 物群落,不能反映环境的真实情况。而PCR技术灵敏,便捷又具有特异性,可以针对某种或某几种致病微生物作出检测判断,因此在水环境微生物检测中,应,用越来越广泛,表,现,44,PCR技术在环境监测中的应用,DNA损伤评价污染物遗传毒性的一个很有价值的生物指 标,PCR技术的应用使得在分子水平分析DNA损伤之一D NA突变有了很大的进展,提供,了,一种在分子水平上分析 环境生物DNA损伤和检测病原体的简便方法,该方法克服 了传统方法的缺陷,更利于提高环境检测的效率和准确性,。,45,PCR技术在环境监测中的应用,PCR有许多不同种类，如实时定量PCR，多重PCR等，用PCR得到的母的片段可用于微生物检测。目前已有将PCR 技术用于饮用水中大肠杆菌的检测；用于制备基因工程中的目的片段；用于DNA杂交技术中DNA探针的制备；用于环境生物多态性的分析。,DNA探针是用生物素、荧光素等物质进行标记的能够与待测基因进行特异性互补产生杂交信号的DNA片段。荧光探针、寡聚核苷酸探针等已被应用于监测水中的大肠杆菌，取得了很好的结果。为了更灵敏、快速的检测水中大肠杆菌，目前DNA探针技术多于PCR技术结合使用。,46,PCR技术在环境检测尤其是水环境监测中所发挥的作用日益提高，随着各个层面监测的开展，其技术亦日益复杂。虽然PCR技术相对于传统的检测方法有很多优点，但仍存在着有待改进的不足：比如假阳性，当不相关的核酸分子中存在与模板非常相似的碱基序列时，PCR很可能扩出假阳性的结果，所以引物的设计与PCR条件的设定成为了目前应该研究的关键；,47,由于PCR的高灵敏度与实验试剂的计量很小，所以对操作者的技术要求较高，因为微量靶序列的污染往往对结果造成很大的影响，故操作过程要十分小心。,随着此技术的不断发展，PCR技术将作为一个必不可少的方法与其他监测技术结合起来，在水环境监测的生物层面获得广泛应用。,可以预料今后PCR技术在环境微生物领域中的应用将会进一步的扩大，在监测水体土壤中的致病细菌、病毒及指示菌等方面发挥越来越大的作用。,48,Thank you for listening,YourName,49,