苜蓿抗感褐斑病品种内超氧化物歧化酶_过氧化物酶和多酚氧化酶活性的比较 袁庆华.pdf

苜蓿抗感褐斑病品种内超氧化物歧化酶、过氧化物酶和多酚氧化酶活性的比较袁庆华,桂枝,张文淑(中国农业科学院 畜牧研究所,北京100094)摘要:利用离体叶接种技术分别将伊鲁瑰斯、沙河、萨兰斯和沙湾4个苜蓿品种内的植株分为抗病株和感病株,并分别接种苜蓿假盘菌,对抗、感病植物叶片中的SOD、POD及PPO的活性进行了测定。结果表明,接种前抗、感株叶片中4种酶的活性基本相同,接种后17 d内酶活性先升后降,而抗病株的酶活性增加高于感病株。最后抗、感病株3种酶活性趋于一致。关键词:苜蓿;褐斑病;超氧化物歧化酶;过氧化物酶;多酚氧化酶中图分类号:S432.1文献标识码:A文章编号:100425759(2002)0220100205大量的研究结果表明,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)及多酚氧化酶(PPO)都在植物的抗病过程中起着重要的作用15。许多研究者认为,植物体内有一组保护酶系统(SOD、POD及PPO),在未受到病菌侵染前使活性氧处于低水平的动态平衡状态;当植物受到病原菌侵染后,被侵组织的活性氧突增,而该保护酶系统具有清除活性氧,防止植物受害的作用1,6,7。以往对不同作物接种病菌后保护酶的活性作了大量的实验研究13,7,以探讨保护酶与寄主抗病性的关系,作为筛选抗性材料的生化指标之一。但是,对于同一品种内,特别是同一牧草品种内不同抗、感植株的保护酶变化的研究尚不多见。笔者和我国其他人员8,9曾对苜蓿品种抗褐斑病的特性分别开展过室内与田间的特性评价。在以往工作的基础上,笔者通过离体叶接种10,已经从同一品种内600个单株中筛选出抗病单株和感病单株(待刊)。在此基础上,通过苜蓿假盘菌的接种,对抗、感株进行保护酶活性测定,以比较抗、感株酶活性的变化动态,对离体叶接种的有效性做进一步检验,并为苜蓿抗褐斑病育种提供理论依据。1材料与方法1.1实验材料1.1.1供试品种选用4个苜蓿品种,即伊鲁瑰斯、沙河、萨兰斯和沙湾,它们的病指数分别为13.48、21.48、28.25和33.68。用离体叶接种方法10从每个品种600株中筛选出最抗的和最感的苜蓿单株各5株,进行无性扦插扩繁,取扩繁后的各品种抗感单株各30株,作为供试材料。1.1.2菌种与取样方法苜蓿假盘菌(Pseudopez iza m ed icag inis)在V-8碳酸钙琼脂培养基上培养,20恒温黑暗条件下培养30 d,按袁庆华等8的方法接种病菌,分别于接种前1 d,接种后2、7、12、17 d对抗感单株逐株取相同部位的一个叶片,将同一抗病或感病单株的叶片放在一起,并用去离子水冲洗干净后,用于制备酶液。1.2实验方法1.2.1酶液提取称取0.5 g去中脉的苜蓿叶片,放入研钵中,取5 m l 1?15 mol磷酸缓冲液(pH=7.8)倒入研钵内,冰研磨成匀浆,6 000 r?m in离心20 m in,倾出上清液,放入5 m l试管内,剩余物加少量缓冲液冲洗后,再次离心(6 000 r?m in,5 m in),取上清液,如此重复3次,直到酶粗提液补足5m l。将酶液放入4冰箱中保存备用。以上方法用于SOD、PPO酶液的提取,而POD酶液的提取使用的是0.01 mol?L磷酸缓冲液(pH=7.2),其余方法同上。100-1046?2002草业学报ACTA PRA TACUL TU RA E SI N ICA第11卷第2期Vol.11,No.2收稿日期:2001208207基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号39870559)。作者简介:袁庆华(19592),女,天津人,副教授。1.2.2超氧化物歧化酶活性测定SOD活性测定参照王爱国等9和韩雅珊11的方法。3 m l反应液中含有:0.013 mol?L甲硫氨酸、6310-6mol?L氮蓝四唑、1.310-6mol?L核黄素、110-4mol?L乙二胺四乙酸(ED2TA)及pH=7.8的0.05 mol?L磷酸缓冲液,加入稀释30倍的酶粗提液1m l,在30下用4 000 L ux荧光照射10 m in,并在560 nm波长下测量透光率。以每克鲜重含有的酶活单位(U?gfw)表示。各样品均重复测定2次。1.2.3过氧化物酶活性测定采用愈创木酚做底物,用分光光度法测定生成物的含量。反应液中含有1m l 0.1mol?L磷酸缓冲液(pH=7.2)、1m l 0.1mol?L愈创木酚、1m l 0.8%H2O2,并加入适量的酶液后在30下反应20 m in,并在470 nm波长下测定吸光值。以1m l去离子水代替H2O2为对照。在上述反应条件下,以每分钟每克鲜重OD值变化1.00所需的酶量为一个酶活单位。各样品均重复测定2次。1.2.4多酚氧化酶活性测定在小试管中依次加入1.5m l 1?15 mol磷酸缓冲液(pH=6.8)、1.5 m l 0.02 mol邻苯二酚及适量的酶粗提液混合均匀后,放入40的水浴锅中保温30m in,在525 nm波长下测量光密度,以磷酸缓冲液代替酶液作对照。在上述反应条件下,以每分钟每克鲜重OD值变化0.01所需的酶量为一个酶活单位。各样品均重复2次。2结果与分析2.1超氧化物歧化酶活性的变化由图1可知,苜蓿的4个品种在未接种苜蓿假盘菌前,抗、感株间SOD活性无差异,接种后抗、感株SOD的活性比接种前高,随着接种后时间的延长,抗感株酶活性均显著下降,接种后17 d抗感株SOD的活性均低于接种前。接种后抗病株SOD的活性高于感病株,伊鲁瑰斯接种假盘菌后12 d,抗病株SOD的活性达到最大,比感病株高55%;萨兰斯接种后7 d,抗病株酶活性达到最高,比感病株高20%;沙湾从接种后2 d开始到接种后的17d,抗病株酶活性都高于感病株,平均比感病株高71%;沙河从接种后2 d到12 d,抗病株酶活性显著高于感病株,3个时期酶活性平均比感病株高48%。2.2过氧化物酶活性的变化从图2可以看出,未接种苜蓿假盘菌前,抗病株和感病株之间POD的活性差异较小,接种后抗、感株POD的活性都比接种前的高,但抗病株POD的活性增加明显高于感病株。萨兰斯接种后12 d,抗病株酶活性达到最大,图1接种苜蓿假盘菌后苜蓿不同品种抗感组合叶内SOD活性的变化Fig.1Changes in SOD activities in alfalfa leaves after inoculation withP.medicaginis101第11卷第2期草业学报2002年比感病株高72%;沙湾接种后2 d,抗病株POD的活性比感病株高46%;沙河于接种后7 d,抗病株的酶活性达到最高,比感病株高94%。酶活性达到最高峰后,除伊鲁瑰斯有波动外,其余3个品种的抗病株酶活性下降,而感病株酶活性有所增加,最终在第17 d时抗、感株酶活性极为接近。图2接种苜蓿假盘菌后苜蓿不同品种抗感组合叶内POD活性的变化Fig.2Changes in POD activities in alfalfa leaves after inoculation withP.medicaginis2.3多酚氧化酶活性的变化所测试的4个品种内抗病株和感病株之间PPO活性的变化如图3所示,接种前,抗感株间酶活性差异不大,图3接种苜蓿假盘菌后苜蓿不同品种抗感组合叶内PPO活性的变化Fig.3Changes in PPO activities in alfalfa leaves after inoculation withP.medicaginis201ACTA PRA TACUL TURA E SI N ICA(Vol.11,No.2)6?2002接种病菌后抗、感株酶活性均比接种前的高。接种后抗病株比感病株PPO活性高,从接种后2 d到12 d各品种抗病株酶活性分别比感病株提高6.7%23.2%(伊鲁瑰斯)、8.5%15.7%(萨兰斯)、12.4%19.5%(沙湾)和9.7%21.2%(沙河),接种后的17 d抗感株酶活性都有所下降,抗、感株之间酶活性较为接近。3讨论与结论许多研究证实1214,植物受到病原菌侵染时会产生大量的活性氧,多余的活性氧影响植物的正常生理活动,它通过非酶促方式催化细胞膜中的不饱和脂肪酸而启动膜脂过氧化,破坏细胞膜的完整性,引起细胞膜透性的增加及电解质的渗漏,最终导致细胞死亡,而超氧化物歧化酶、过氧化物酶等正是负责清除活性氧的保护酶。在不同的病害研究中SOD的活性变化差异很大,Buonario等15认为,在抗病品种中SOD活性一般呈下降趋势,而在感病品种中基本不变甚至升高,而王雅平等16认为抗感品种接种后SOD活性均升高,抗病品种比感病品种升高的幅度大,在POD的研究中,许多研究者认为,植物受病菌侵染后,体内POD的活性均显著增加,抗病品种酶活性高于感病品种2,3,7。本试验结果表明,利用离体叶接种技术从同一品种内筛选出的抗病株及感病株之间SOD、POD活性变化存在差异,接种苜蓿假盘菌后抗感株SOD和POD活力均升高,但抗病株酶活性始终高于感病株,直到接种后17 d抗、感株活性差异不明显。这可能是由于寄主受到苜蓿假盘菌作用后活性氧的积累刺激了SOD和POD活性的提高。同时在PPO活性的测定中发现,苜蓿叶片受苜蓿假盘菌侵染后PPO的活性在抗病株中的增加高于感病株,其原因可能是由于抗病株受病原菌侵染后能快速促进酚类化合物和木质素的合成和累积,以抵抗病原菌的侵染和扩展,从而提高寄主的抗病能力。在苜蓿抗褐斑病育种中,通过测定SOD、POD及PPO活性的高低可作为筛选抗性材料的生化指标之一。实验结果也说明,用离体叶接种技术进行苜蓿植株抗病性选择是有效的。参考文献:1陈利锋,宁玉立,徐雍皋,等.抗感赤霉病小麦品种超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性比较J.植物病理学报,1997,27(3):2092312.2李保聚,李凤云.黄瓜不同抗性品种感染黑星病菌后过氧化物酶和多酚氧化酶的变化J.中国农业科学,1998,31(1):86288.3李靖,利容千,袁文静.黄瓜感染霜霉病菌叶片中一些酶活性的变化J.植物病理学报,1991,21(4):2772283.4李造哲,马青枝,云锦凤.披碱草和野大麦及其杂种F1和BC1过氧化物同功酶分析J.草业学报,2001,10(3):38241.5John Frame.A dvances in forage legume technologyJ.草业学报,2001,10(4):1217.6Wojtasxek P.Oxidative burst:an early plant response to pathogen infectionJ.Biochem J,1997,322:6812692.7葛秀春,宋凤鸣,郑重.稻瘟菌侵染后水稻幼苗活性氧化的产生与抗病性的关系J.植物生理学报,2000,26(3):2272231.8袁庆华,张文淑.苜蓿对褐斑病抗性筛选研究J.草业学报,2000,(4):52258.9南志标,李春杰,王斌贝文,等.苜蓿褐斑病对牧草质量光合速率的影响及田间抗病性J.草业学报,2001,(1):26234.10袁庆华,张文淑,李敏.苜蓿褐斑病的离体叶接种研究J.草业学报,2001,9(1):21224.11袁庆华,李向林,张文淑.苜蓿假盘菌及其生物学特性研究J.植物保护,2001,27(1):8212.12王爱国,罗广华,邵从本,等.大豆种子超氧化物歧化酶的研究J.植物生理学报,1983,9(1):77283.13韩雅珊.食品化学实验指导M.北京:中国农业大学出版社,1994,1482150.14Fridovich.Suertoxide dismutaseJ.A nn Rev Biochem,1975,44:1472159.15Keppler L D,M ackae E A,Fergusen IN.The initiation ofmembrane lipid peroxidation during bacteria2induced hypersendi2tive reactionJ.Physial Plant Pathol,1987,30:2332245.16宋凤鸣,郑重,葛秀春.活性氧及膜脂过氧化在植物病原物互作中的作用J.植物生理学通讯,1996,32(5):3772385.17Buonario R,Torre GD,M ontalbini P.Soluble superioxide dismutase(SOD)in susceptible and resistant host2parasite com2plex ofphaseolus unlgarisandU romyces phaseoliJ.Physiol Plant Pathol,1987,31:1732184.18王雅平,刘伊强,施磊.小麦对赤霉病抗性不同品种的SOD J.植物生理学报,1993,19(4):3532358.301第11卷第2期草业学报2002年Comparison of the activities of SOD,POD and PPO within alfalfa cultivarsresistant and susceptible to alfalfa common leafYUAN Q ing2hua,GU I Zhi,ZHAN GW en2shu(Institute of A nimal Science,CAA S,Beijing 100094,China)Abstract:Plants w ithin each of four alfalfa cultivars,were grouped as resistant(R)and susceptible(S)toPseudopez iza m ed icag inisand the different groups were equally inoculated w ithPseudopez iza m ed icag inis,us2ing excised leaf tissue inoculation.Both R and S groupsw ithin each of the cultivarswere tested for activities ofthree enzymes,SOD,POD and PPO,in their leaf tissues.The result showed that the activities of the three en2zymes were sim ilar in R and S groups before inoculation.During the 17 days after inoculation,however,theactivities of the three enzymes increased first,w ith more increases in the R groups than in the S groups,andthen decreased in a later phase.Finally the R ad S groups became sim ilar each other in term s of the activities ofthe three enzymes in the leaf tissues.Key words:alfalfa;SOD;POD;PPO草业学报 投稿须知草业学报 系中国草原学会主办,国内外公开发行的高级学术期刊。本刊专门登载国内外草业科学及其相关领域如畜牧学、农学、林学、经济学等领域的创新性研究论文,综述与专论,研究简报,学科动态和研究生学位论文摘要等。欢迎国内外有关人士积极投稿。1.来稿要求微机隔行打印,研究论文、综述与专论以8000字左右为宜,研究简报一般不应超过4000字,研究生学位论文摘要应在2000字以内,一式两份寄本刊编辑部。2.来稿应包括文题,作者姓名,单位,单位地址,邮政编码,摘要,关键词(38个),正文,参考文献,英文摘要及关键词。3.附第一作者简介:姓名,性别,出生年月,民族,籍贯,职称,职务,学历。若来稿属于国家或省部级科研项目,应注明经费来源、项目名称及编号。本刊对973、国家基金、国家攻关、863等项目成果,将给予优先考虑。4.正文章条序码统一用阿拉伯数字表示,章条层次各级号码之间加圆点,末位一级不加,一般不超过4级,各级序码表示如下:第一级123.;第二级1.11.21.3.;第三级1.1.11.1.21.1.3.等。5.表格采用三线表,线条插图要清晰,线条均匀,一般要求微机绘制,须用激光打印在另纸上,照片要清晰,反差较大。图、表题及其标目、栏目及注释均应有中、英文对照,标有图、表序号。6.文稿请一律使用我国法定计量单位,并以符号表示。已废弃的非法定单位不得使用。7.参考文献采用顺序编码制著录,在正文引用处按出现的先后顺序用阿拉伯数字连续排序,用上角标。其著录格式如下:a)专著:著者.书名.出版地:出版者,出版年.b)专著中析出的文献:著者.题名.见:原文献责任者.书名.出版地:出版者,出版年.起止页.c)期刊析出文献:作者.题名.刊名,年,卷(期):起止页.参考文献的作者为3人以内的全部列出,3人以上的列出前3位,后加“等”。8.文稿中出现的生物名称,应注明拉丁学名,属、种名为斜体或在其下划 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