糖尿病大鼠视网膜病变细胞凋亡的观察.pdf

基础论著糖尿病大鼠视网膜病变细胞凋亡的观察潘琳 周水平 郭艳茹 李光伟【摘要】目的 探讨早、中、晚期不同病程糖尿病(DM)大鼠视网膜病变(DR)毛细血管周细胞、内皮细胞凋亡的发生,为研究DR发病机制提供形态学依据。方法 90只雄性SD大鼠随机分成正常对照组(n=30)及链脲佐菌素(STZ)糖尿病大鼠6、9、12个月模型组(n=20)。各实验组分别按期处死10只大鼠,取眼球作视网膜消化铺片,PAS染色及核苷酸末端转移酶介导dUTP缺口翻译法(TUNEL法)特异性标记凋亡细胞,光镜下观察。结果 6个月模型组,TUNEL标记法显示周细胞凋亡,但未见内皮细胞凋亡。9个月模型组,PAS染色、TUNEL标记法显示周细胞、内皮细胞均有凋亡,周细胞及内皮细胞出现核固缩、核破碎、凋亡小体形成等细胞凋亡形态学改变。12个月模型组,内皮细胞凋亡多见,部分区域每个高倍视野下可见23个不同时期的内皮细胞凋亡。结论 DR期间内皮细胞及细胞周细胞均可发生凋亡,DR早期以周细胞凋亡为主,中晚期内皮细胞发生凋亡,并逐渐增多。【关键词】糖尿病视网膜病变;内皮细胞;周细胞;细胞凋亡Experimental study on programmed retinal cell death in diabetic ratsPAN Lin,ZHOU Shui2ping,GUO Yan2ru,et al.Department of cell biology,China2Japan Friendship Institutes of Clinical Med Sci2ence,China2Japan Friendship Hospital,Beijing 100029,China【Abstract】ObjectiveTo determine the occurrence of cell death in situ in diabetic2like retinopathyfrom the streptozotocin(STZ)2induced diabetic rats after 6,9,12 months1 Methods90 male Sprague2Dawley rats were randomly divided into normal control group(n=30)and diabetic model group1STZwere used to induce diabetes in rats1Rats in each group were frequently examined with blood glucose andweight,and killed after 6,9,12 months(n=20)1The sections prepared from the trypsin2digested retinawere studies with periodic acid2schiff2hematoxylin stain.The terminal deoxynucleotidyl transferase2mediat2ed dUTP nick end labeling(TUNEL)reaction was used to detect the preferentially apoptotic DNA frag2mentation1 ResultsRetinal microvessels of 6 month diabetic rats showed TUNEL2positive pericytes,which were absent in control rats1Retinal micrographs of 9,12 month diabetic rats showed pericytes andendothelial cell apoptosis respectively with TUNEL reaction and PAS stain1At 12 months,the numbers ofapoptotic endothelial cells were more,and each of the pictures showed TUNRL2positive endothelial cell orapoptotic bodies under the light microscope1 ConclusionsThese findings indicate that diabetes leads tothe accelerated death in situ of pericyte in the early stages of retinopathy,and with the advance of diseasethe endothelial cell apoptosis occurs1【Key words】Diabetic retinopathy;Endothelial cell;Pericyte;Apoptosis 糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病(DM)最常见的严重的微血管并发症。有关DR早期周细胞减少与周细胞凋亡的关系已有文献报道,而在DR早期,内皮细胞在增生的同时是否也发生凋亡?DR中、晚期大面积无细胞毛细血管形成时内皮细胞丧失的原因是否与内皮细胞凋亡有关则报道不多。本研究通过对早、中、晚不同阶段DR病变细胞凋亡的观100029 北京,中日友好医院临床医学研究所细胞生物室(潘琳、郭艳茹),中医糖尿病科(周水平),内分泌科(李光伟)察,探讨DR不同病程周细胞、内皮细胞凋亡的发生现象。材料与方法一、模型制备Sprague2Dawley(SD)雄性二级大鼠90只(180220 g),中国药品生物检定所实验动物中心购买。随机分成正常对照组(30只)和模型组(60只);两组又分 为6、9、12个 月3组。模 型 组 采 用STZ60 mg/kg腹腔一次性注射,3天后尾静脉取血测非372中华糖尿病杂志2004年第12卷第4期 Chin J Diabetes,August 2004,Vol 12,No 4空腹血糖大于1617 mmol/L为DM造模成功。实验期共12个月,实验期间大鼠自由摄食饮水,每个月检测一次血糖和体重。二、视网膜消化铺片6、9、12个月病程时各组随机各断头处死大鼠10只,取眼球固定于4%多聚甲醛72 h后,以视乳头为中心将眼球壁剪为三等份,PBS液浸泡过夜,剥离视网膜层并入3%胰酶液37 消化2 h,将消化好的毛细血管贴在净洁的载玻片上。三、PAS染色视网膜血管铺片用蒸馏水轻洗,1%高碘酸氧化5 min,蒸馏水洗5 min,Schiff试剂染色15 min,流水轻洗10 min,Mayer苏木素液复染细胞核3 min,流水轻洗,常规脱水,封片。四、TUNEL标记法TUNEL试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。按说明书操作步骤进行原位细胞凋亡标记。五、统计学方法各组间血糖检测数据用?xs表示,组间数据比较用t检验,应用SPSS1010统计软件进行分析。结果一、血糖变化实验期间模型组的血糖变化与对照组比较皆有显著性差异(P 0101),各病程时DM模型组血糖无显著性差异。二、视网膜血管形态改变(PAS染色)11 正常对照组:6、9、12个月各组视网膜毛细血管分布排列规则,内皮细胞分布于管腔内,细胞核呈椭圆形、着染较浅;周细胞位于毛细血管外周,被内皮细胞基底膜包绕,核呈圆形或三角形,着染较深(图1)。216个月模型组:局部视网膜毛细血管网分布较紊乱,周细胞减少,内皮细胞增生,可见少量隐周细胞及单条无细胞毛细血管形成,未见周细胞及内皮细胞凋亡。319个月模型组:毛细血管网排列紊乱,管壁增厚深染,管径粗细不匀,无细胞毛细血管多见。血管内皮细胞显著增生、毛细血管瘤形成(图2箭头所示为毛细血管瘤)。可见内皮细胞及周细胞凋亡;细胞变小,核浓缩、破碎,凋亡小体形成(图3箭头所示分别为周细胞内皮细胞凋亡)。4112个月模型组:大面积无细胞毛细血管形成,毛细血管基底膜明显增厚,部分毛细血管结构完全被破坏,形成不可逆的组织学改变。细胞凋亡数量增多以内皮细胞凋亡多见,有的区域每个高倍视野下可找到23个凋亡内皮细胞(图4箭头所示分别为内皮细胞周细胞凋亡)。三、TUNEL标记法正常及阴性对照组未见视网膜毛细血管周细胞,内皮细胞TUNEL标记着染均为阴性,6个月模型组周细胞出现凋亡,凋亡细胞核被TUNEL标记呈棕黄色,内皮细胞未见凋亡(图5箭头所示为凋亡周细胞)。9、12个月模型组周细胞、内皮细胞均有凋亡,12个月模型组以内皮细胞凋亡多见(图6箭头所示为凋亡内皮细胞,呈棕黄色)。讨论DR发病机制较复杂,迄今尚未阐明。在长期高血糖毒性作用下多种代谢功能发生紊乱,使血2视网膜屏障受损,从而出现视网膜毛细血管通透性增加、大面积毛细血管闭塞、无细胞毛细血管形成、周细胞减少、内皮细胞增生、毛细血管瘤形成等一系列DR病理改变。视网膜毛细血管主要由周细胞和内皮细胞组成,周细胞和内皮细胞的功能完整对维持视网膜毛细血管的稳定性具有重要作用。周细胞具表1 实验期间各组血糖变化(?xs,mmol/L)Tab 1The changes of blood glucose during the experiment in two groups(?xs,mmol/L)组别Group鼠数n成模时At model formation3个月3 months6个月6 months9个月9 months12个月12 months对照组Control104130153180143158014316013318014模型组Diabetic model719193101914513211021721111152115213P 0101 0101 0101 0101 0101472中华糖尿病杂志2004年第12卷第4期 Chin J Diabetes,August 2004,Vol 12,No 4 图1 正常对照组大鼠:视网膜毛细血管排列规则,内皮细胞与周细胞成比例分布(PAS1000)图29个月DM组大鼠:视网膜毛细血管壁增厚内皮细胞增生,箭头所示毛细血管瘤(PAS1000)图39个月DM组大鼠周细胞内皮细胞均发生凋亡,箭头所示分别为周细胞细核浓缩核破碎,凋亡小体形成及内皮细胞核固缩(PAS1000)图412个月DM组大鼠:内皮细胞周细胞均发生凋亡,箭头所示分别为内皮细胞核浓缩、核破碎、凋亡小体形成及周细胞核浓缩(PAS1000)图56个月模型组:TUNEL法标记显示周细胞凋亡(TUNEL1000)图69个月模型组大鼠:TUNEL法标记显示内皮细胞凋亡(TUNEL1000)Fig 1Shows endothelial cells and pericytes were regular and discernible in normal control rats(Trypsin digestion,PAS1000)Fig 2Shows retinal microangiograms of diabetic rats after 9 months1The retinal capillary wall was thickened and stained heavily,endothelial proliferationand microaneurysm were visible(Trypsin digestion,PAS1000)Fig 3Represents the photomicrograghs of a retina trypsin2digested and pre2pared from 92month diabetic rats.The retinal capillary pericyte and endothelial cell apoptosis and apoptotic body were visible.(PAS1000)Fig4Shows photomicrograghs of a retinal trypsin2digest prepared from 122month diabetic rats1The retinal capillary pericyte and endothelial cell apop2tosis were seen1The round,eccentric images corresponding to pericyte nuclei,the discrete,smooth apoptosis bodies appearing as endothelial cellwere also visible(PAS1000)Fig 5Indicates the retinal microangiograms stained with TUNEL from 62month diabetic rats,which shows peri2cyte apoptosis(PAS1000)Fig 6Retinal microangiograms stained with TUNEL from 92month diabetic rats shows retinal endothelial cell apop2tosis(PAS1000)有调节内皮细胞增殖、新生血管生长、毛细血管的通透性及稳定性等多种功能,通过多种途径参与DR的发生发展,尤其与早期DR密切相关1,凋亡是在生理或病理条件下,由基因编码控制的主动的非炎性细胞死亡,又称程序性死亡。发生凋亡时,细胞内钙离子浓度升高,激活Ca2+和Mg2+依赖性核酸内切酶,将DNA在核小体间降解为180200 bp或其倍数的寡核苷酸片段,这种特征性降解的DNA片段就成为凋亡细胞的标志。细胞凋亡的形态学早期改变为细胞变小,核固缩,核破碎,晚期由细胞膜凹陷形成的凋亡小体。TUNEL法特异性标记较早期的凋亡细胞。近年研究认为DR早期周细胞选择性丧失的原因是周细胞发生凋亡2,3。关于在DR中内皮细胞是否发生凋亡国内外报道不一。Li等4研究显示由高到低的葡萄糖浓度波动只导致周细胞凋亡,而内皮细胞未见凋亡。Lorenzi等5则认为葡萄糖进入内皮细胞后扰乱了DNA功能,使DNA单链断裂发生率增高,DNA损伤严重不能修复内皮细胞而发生凋亡。有研究也显示高糖作用下培养的人血管内皮细胞凋亡率升高6。刘学政等7所观察到的6个月DR内皮细胞凋亡是用TUNEL标记法。以上报道均未在光镜下见到经典内皮细胞凋亡的形态学改变。内皮细胞是否发生凋亡一直有争议。有人认为高糖对内皮细胞增殖的抑制作用可能是通过自由基损害蛋白酶和核酸,使细胞增殖率下降,通过自化过程产生自由基诱导内皮细胞凋亡6,8。也有报道认为内皮细胞不发生凋亡1。为了探明内皮细胞是否确实发生凋亡,本实验观察了早、中、晚期不同病程DR血管内皮细胞、周细胞的凋亡改变。结果显示DR早期(6个月)TUNEL标记仅有周细胞凋亡,而PAS染色观察视572中华糖尿病杂志2004年第12卷第4期 Chin J Diabetes,August 2004,Vol 12,No 4网膜血管未见周细胞及内皮细胞发生凋亡。在DR中、晚期(912个月)内皮细胞在增生的同时发生凋亡,TUNEL标记周细胞、内皮细胞均显示凋亡,PAS染色周细胞内皮细胞均出现不同时期细胞凋亡形态学改变:细胞变小、深染、核浓缩、核碎裂及凋亡小体形成。DR晚期以内皮细胞凋亡多见,有的区域每个高倍视野下可找到23个内皮细胞凋亡。本实验结果提供了DR中、晚期内皮细胞发生凋亡及周细胞凋亡的形态学证据,这对探讨内皮细胞在DR中的生物学特性及深入研究DR的发病机制无疑将具有重要意义。参考文献1Anderson DR,Davis EB,Glaucom A,et al1Capillaries and peri2cytes15 preliminary evidence that carbon dioxide relaxes precyte con2tractile tone1Ophthalmologica,1996,210:280228412Podesta P,Romeo G,Liu WH,et al1Bax is increased in the retinaof diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivoand in vitro1Am J Phthol,2000,156:10252103213Li W,Yanoff M,Liu X,et al1Retinal capillary pericyte apoptosis inearly human diabetic retinopathy1Chin Med J(Engl),1997,110:659266314Li W,Liu X,Yanoff,et al1Cultured retinal capillary pericytes dieby apoptosis after an abrupt fluctuation from high to low glucose lev2els:Acomparativestudywithretinalcapillaryendothelialcell1Diabetilogia,1996,39:537254115Lorenzi M,Montisano DF,Toledo S,et al1High glucose inducesDNA damage in cultured endothelial cells1J Clin Invest,1986,77:322232516Parzer SM,Wagner L,Pettermann L,et al1High2glucose2triggeredapoptosis in cultured endothelial cell1Diabetes,1995,44:13232132717 刘学政,萧红,曲维新,等 1 糖尿病大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡及其相关基因的表达 1 中华眼科杂志,2001,37:5926218Graier WF,Grubenthal I,Dittrich P,et al1Interacellar mechanismofhigh D2glucose2induced modulation of vascular cell proliferation1EurJ Phamacol,1995,294:22122291(收稿日期:2002212231)病例报告胰岛素自身免疫低血糖昏迷一例周玉萍 杨亚超 患者,女,50岁。农民,2001年起无明显诱因常于清晨45时出现心慌、乏力、多汗、明显饥饿感,少量进食后可缓解。2003年3月某天凌晨,患者于睡眠中突然意识丧失,口吐白沫,四肢抽搐,小便失禁,急送当地医院。当时化验血糖0105 mmol/L。诊断为低血糖昏迷,给予静滴葡萄糖液等治疗后,逐渐苏醒。近1月来上述症状发作频繁,但无昏迷,均可自 行 缓 解 或 少 量 进 食 后 缓 解。查 体:神 志 清,BP100/60 mm Hg。皮肤潮湿多汗,眼球无明显突出,甲状腺 度肿大,质软,无结节,未闻及血管杂音。呼吸急促,心率90次/min,律齐,未闻及杂音,腹平软,肝脾未及。双手平举细震颤(+),四肢无力,肌张力正常。双侧肌腱反射活跃。实验室检查:空腹血糖312 mmol/L。胰岛素抗体5118%作者单位:264200 山东威海市立医院内分泌科(正常 1000 mU/L(正常2162619 mU/L),C肽分 别 为2216、1915、17和2315g/L(正 常 为018315g/L),均 明 显 高 于 正 常。甲 状 腺 功 能 检 查:FT39173 pmol/L(正常为218711 pmol/L),FT43918 pmol/L(正常1222 pmol/L),TSH 0105 mU/L(正常0127412 mU/L),甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(MCAb)正常。胰腺CT未见异常。OGTT试验血糖波动在211410160 mmol/L。饥饿试验72 h尚能耐受。诊断胰岛素自身免疫综合征合并甲状腺机能亢进症,给予口服丙基硫氧嘧啶100 mg,日3次,心得安10 mg,日2次,泼尼松20 mg,日1次,治疗3周,未再发生低血糖。观察半年,患者甲状腺功能正常,血糖稳定于516617 mmol/L。(收稿日期:2004203208)672中华糖尿病杂志2004年第12卷第4期 Chin J Diabetes,August 2004,Vol 12,No 4