Real-time-PCR实验原理与技术.ppt

,Real-time PCR实验原理与技术,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,实时荧光定量,PCR,实验原理与技术,胡晓,研究生实验技术,2015-12-7,1,qRT-PCR,技术原理,一、实验原理：,在,PCR,反应体系中加入,荧光染料,或,荧光探针,，利用,荧光信号积累,实时,监测,整个,PCR,反应进程，最后通过,标准曲线,对,未知模板,进行,定量分析,。,荧光信号,+,标准曲线,定量分析？,2,qRT-PCR,技术原理,Ct,值,(Cycle Threshold;,每个反应管中荧光强度达到阈值所需的循环数,),与样本初始拷贝数存在,正比,线性关系,。,以,不同,稀释,倍数,的已知模板制备,标准曲线,。,实时监测未知样本的,Ct,值，,对应,标准曲线得到未知样本的初始拷贝数。（定量分析）,3,qRT-PCR,技术荧光标记方法的分类,非特异性的,DNA,结合染料法：,荧光染料能,非特异,结合,DNA,双链结构的小沟中，而游离的荧光染料不发出,荧光,。,常用染料：,Pico Green,（灵敏度高,=25pg/mL,）,SYBR I,缺点：,易受到非特异性扩增和引物二聚体的影响。,措施,：,设计特异性引物，优化,PCR,反应条件。,4,qRT-PCR,技术荧光标记方法的分类,5,qRT-PCR,技术荧光标记方法的分类,2.,特异性荧光定量,PCR:,以荧光共振能量转移原理为基础,水解探针法,分子信标,Scorpion,引物,/,探针,复合探针,6,qRT-PCR,技术影响因素,样品,RNA,的完整性,RNA,样品中的基因组,DNA,污染,特异性良好的引物,PCR,反应,体系的优化,反转录所得,cDNA,的量必须精确地等于,相,应,的,mRNA,的量,可靠的内标,基因：,TEF-2,7,qRT-PCR,技术实验操作,8,qRT-PCR,技术实验操作,阳性模板,9,qRT-PCR,技术实验操作,制作标准品阳性对照：测定阳性,模板的,浓度，,10,倍,稀释为,10,10,，依次稀释至,10,9,、,10,8,、,10,7,、,10,6,、,10,5,、,10,4,，以备用,。,反应,体系,如下,:,(,标准品反应体系,),序号,反应物,剂量,SYBR,Green 1,染料,10l,阳性,模板上游引物,F,0.5l,阳性,模板下游引物,R,0.5l,dNTP 0.5l,Taq,酶,1,l,阳性,模板,DNA 5,l,ddH2O,32.5,l,总,体积,50,l,3.,轻,弹管底将溶液混合,，短暂,离心。,(,内参照基因反应体系,),序号 反应物 剂量,SYBR,Green 1,染料,10l,内参照上游引物,F,0.5l,内参照下游引物,R,0.5l,dNTP,0.5l,Taq,酶,1l,待测样品,cDNA,5l,ddH2O,32.5l,总,体积,50l,10,qRT-PCR,技术实验操作,1,、制备用于绘制,梯度稀释标准曲线,的,DNA,模板,：,针对,每一,需要测量的基因，选择一,确定表达,该基因的,cDNA,模板进行,PCR,反应。,序号 反应物 剂量,1,10 PCR,缓冲液,2.5 ul,2,MgCl2,溶液,1.5 ul,3,上游引物,F 0.5 ul,4,下游引物,R 0.5 ul,5,dNTP,混合液,3 ul,6,Taq,聚合酶,1 ul,7,cDNA 1 ul,ddH2O,至,25ul,轻弹管底将溶液混合，,6000rpm,短暂离心。,35,个,PCR,循环（,941,分钟；,551,分钟；,721,分钟）,;72C,延伸,5,分钟。,PCR,产物与,DNA Ladder,在,2,琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测,PCR,产物是否为单一特异性扩增条带。,将,PCR,产物进行,10,倍梯度稀释,:,将,PCR,产物进行,10,倍梯度稀释,:,设定,PCR,产物浓度为,11010,，依次稀释至,109,、,108,、,107,、,106,、,105,、,104,几个浓度梯度。,11,qRT-PCR,技术实验操作,待测样品的待测基因实时定量,PCR:,所有,cDNA,样品分别配臵实时定量,PCR,反应体系。体系配臵如下,：,序号 反应物 剂量,SYBR,Green 1,染料,10,ul,上游,引物,1ul,下游,引物,1ul,dNTP 1ul,Taq,聚合酶,2ul,待,测样品,cDNA,5ul,ddH2O 30ul,总体积,50,ul,轻弹管底将溶液混合，,6000rpm,短暂离心。,12,qRT-PCR,技术实验操作,上机前样本的制备,检测程序的设置,检测孔及相关参数的设置,热循环参数的设置,运行检测程序,结果的显示与输出,结果分析,熔解曲线,扩增曲线,13,qRT-PCR,技术实验操作,14,qRT-PCR,技术实验操作（优化）,15,qRT-PCR,技术实验操作（优化）,16,qRT-PCR,技术实验操作（优化）,假阳性：荧光染料能和任何,ds DNA,结合，因此它也能与非特异的,双链,如,引物二聚体,或,非特异性扩增产物,等结合。,要避免这些非特异荧光信号对定量精确性的影响，可以利用热循环仪内设定的熔解反应程序对扩增产物进行,熔解曲线分析。,熔解曲线峰为单一峰形，未见其他峰值，并且峰的形状也比较锐利。扩增产物特异性好。,17,qRT-PCR,技术实验操作（优化）,有研究建议在每一个循环中,PCR,延伸后增加一步，即将温度提高后再检测反应体系中的荧光。该检测温度,大于引物二聚体的退火温度,Tm,，而,小于特异性扩增产物的,Tm,值,。在此温度下，引物二聚体都变性成单链，因此只检测到与特异性,PCR,产物结合的,SYBR Green I,所发出的荧光，,消除了引物二聚体的干扰,，降低了非特异性荧光，有助于目标基因的准确定量。,18,qRT-PCR,技术实验操作（优化）,标准品的选择：,理论上可以以目的基因的,PCR,扩增产物为标准品，但是存在降解、污染等因素影响定量结果。,论坛网友给出了几种解决方法：,另设计一对引物用于荧光,PCR,；,将扩增序列插入,T,载体后作为标准品；,设计一对外围引物扩增,PCR,将产物连入,T,载体,(,+,),19,qRT-PCR,技术实验操作（优化）,20,21,半定量,PCR,1,、同管扩增：减少操作误差，引物间影响大,2,、异管扩增：扩增结果真实可信，具有操作误差,22,半定量,PCR,实验过程,总,RNA,提取；,模板,cDNA,制作；,半,定量,PT-PCR,：,23,半定量,PCR,优化步骤,引物设计及选择：,a),上下游引物设计在跨内含子的一个外显子的,5,端和下一个外显子的,3,端。,b),设计在两个离得远的外显子上。,引物的长度：,严格配对,17-19bp,。最后一个碱基为,C,或,G,；,GC,含量为,40,-60,之间。如此，管家基因与目的基因的退火温度基本一致。长度一般设计为,350bp-600bp,之间,内参的选择,同管,扩增或异管扩增的选择,PCR,循环数的选择,24,