多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统在临床应用中的评价.docx

多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统在临床应用中的评价
李心河1，单宁宁1，2,高扬1，王惠敏1，刘延红1，夏洪印1，邹雄1，侯明2
1. 山东大学齐鲁医院检验科中心实验室，济南，250012
2. 山东大学齐鲁医院血液科，济南，250012
[摘要]目的:评价多肿瘤标志物蛋白芯片在健康人群的普查、肿瘤的早期诊断及监测预后的应用。方法:使用HD-2OO1A多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统（C-12）测定分析8330例恶性肿瘤患者，9657例良性疾病患者和23531例健康体检者血清12种常见肿瘤标志物(CA199，NSE，CEA，CA242，CA125，CA153，AFP，FER，f-PSA，PSA，β-HCG及HGH)的水平。同时对恶性肿瘤组的153例阴性标本用E170全自动免疫分析仪进行比对分析。结果:恶性肿瘤组的阳性率(85.6%)显著高于良性疾病组(41.2%)和健康体检组(7.03%)(P<0.05)。C-12对健康人群检测的特异性为95%，对健康人群肿瘤的检出率为0.2%。结论:多肿瘤标志物蛋白芯片检测技术具有较高灵敏度和特异性。运用蛋白芯片技术联合检测多种肿瘤标志物可以明显提高恶性肿瘤诊断的敏感性，可应用于预后及疗效观察，同时也可以作为无症状人群的早期肿瘤普查手段之一，对肿瘤高危人群的普查具有一定的指导意义。
关键词:肿瘤标志物;蛋白芯片；化学发光分析
Evaluation of Clinical Application of Detective System of Multi-tumor Markers Protein Chip
Li Xin-he1,Shan Ning-ning1，2,Gao Yang1,Wang Hui-min1,Liu Yan-hong1,Xia Hong-yin1，Zou Xiong1，Hou Ming2
(1.Clinical Laboratry of QiLu Hospital, Shandong University,Jinan 250012 China
2. Haematology Oncology Centre, Qilu Hospital, Shandong University, Jinan 250012, China)

[ABSTRACT]Objective:Identification of clinical applications to cancer diagnosis with multi-tumor markers protein chip and its speeificity and sensitivity in detection of non-caneer subjeets and healthy controls. Methods:The serum levels of 12 tumor markers，includingCA199，NSE，CEA，CA242，CA125，CA153，AFP，Ferritin，Free一PSA，PSA，β-HCG and HGH -----------------------------------------
[通讯作者] 邹雄(1955 - ) ,男, 教授,博士研究生导师,研究方向:肿瘤免疫。
电话：[phone]
e-mail: zx2186@

benign disease and 23531 healthy examinations.Results:The Positve rates were measured with the detective system in 8330 malignant tumor Patients，9657 Patients with
were(85.6%)in malignant tumor，(41.2%)benign disease and(7.03%)healthy groups，respectively.The malignant tumor group had signifieantly higher positive rate than that of the controls.Conclusion:Combined measurement of multiple serum tumor markers using protein biochip technique can significantly increase the diagnostic sensitivity for malignant tumor，and can also be used as an earlier tumor-screening tool to asymptomatic people，especially to the high risk ones.
KeyWords: tumormarkers;proteinbioehip; chemiluminescence assay

肿瘤是严重危害人类健康的恶性疾病，其发病率和死亡率有逐年上升的趋势[1]，故早发现、早诊断、早治疗是提高患者生存率的关键。肿瘤标志物的检测在其诊断中有着非常重要的参考价值。多数研究者主张采用联合检测肿瘤标志物的方法,可弥补单项检测的不足,有助于提高肿瘤检出率[2]。
上海数康生物科技有限公司研制开发的C-12型肿瘤用蛋白芯片主要是指通过微细加工工艺在固体芯片表面构建的微型化学分析系统,从而实现对12种肿瘤标志物的准确快速与大信息量的检测[3]。本实验室采用该诊断系统自2003年1月至今，对8330例各期肿瘤患者、9657例良性疾病患者、163例肿瘤术后监测者和23531名正常健康人群血清中甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖原199 (CA199)、糖原242(CA242)、糖原(CA125)、糖原153(CA153)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、前列腺特异抗原(PSA)、游离前列腺特异抗原(f-PSA)、铁蛋白(FER)、β-人绒毛膜促性腺激素(β-HCG),人生长激素(HGH)含量进行分析。利用多因素判别分析探讨其在临床诊断中的使用价值。

材料和方法
1.检测对象:恶性肿瘤组8330例均为本院2003年1月至2008年4月住院及门诊患者，经临床手术及病理检查确诊，男性4693例，女性3637例，年龄15-89岁，平均年龄53岁；肿瘤术后监测组163例，均为恶性肿瘤组患者经手术、放化疗后定期监测者，男性91例，女性72例。年龄16-79岁，平均46岁；良性疾病组9657例为同期住院及门诊患者，男性4569例，女性5088例，年龄17-81岁，平均49岁；健康体检组: 健康体检者23531例,8-92岁，平均年龄51岁。
2.血清的检测方法：按照数康生物科技有限公司多种肿瘤标志物蛋白质芯片诊断系统进行多肿瘤标志物测定。
3.检测项目的正常参考范围:试剂盒提供的正常参考值见表1。
表1 C-12蛋白芯片肿瘤标志物正常参考值
肿瘤标志物
参考值
肿瘤标志物
参考值
CA125
<35kU/L
NSE
<13ng/ml
CA199
<35kU/L
PSA
<5ng/mL
CA153
<35 kU/L
f-PSA
<1ng/mL
CA242
<20kU/L
β-HCG
<3mIU/mL
CEA
<5ng/ml
HGH
<7.5ng/mL
AFP
<20ng/ml
FER
<322ng/mL(男)；<219 ng/mL(女)
4. 评价方法: 分组统计阳性例数：如有指标超过临界值即阳性(铁蛋白单独升高不计入阳性数)。
5.统计方法 所有数据均应用SPSS11.0统计学软件处理。各统计学指标用均值士标准差表示。

结 果
1. 恶性肿瘤组与良性疾病组，健康体检组阳性率比较 恶性肿瘤组的阳性率(81.4%)显著高于良性疾病组(38%)及健康体检组 (7.5%)(P<0.05)。结果见表2。

表2蛋白芯片对各组检测的阳性率(%)
组别
例数
阳性数
阴性数
阳性率
恶性肿瘤组
8330
7130
1200
85.6
良性疾病组
9657
3979
5678
41.2
健康体检组
23531
1656
21875
7.03

随机抽取蛋白芯片测得的153例肿瘤标志物为阴性的样本同时用E170进行单个肿瘤标志的检测。结果显示没有显著性差异，蛋白芯片检测为阴性的单个肿瘤标志物检测亦为阴性。
2. 恶性肿瘤组的检测结果 用蛋白芯片技术联合检测不同恶性肿瘤患者血清, 肝癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、结直肠癌阳性率较高，分别为85.6%，88.7%，79.4%，69.9%，61.9%，76.4%。各种恶性肿瘤的肿瘤标志物的阳性率详见表3（图1），表4。

表3 蛋白芯片检测常见肿瘤的阳性率
组别
例数
阳性数
阳性率
肝癌
1025
860
83.9
胃癌
1268
785
61.9
食管癌
768
427
55.6
结直肠癌
1381
1055
76.4
肺癌
2112
1476
69.9
胰腺癌
421
373
88.7
卵巢癌
961
763
79.4
子宫癌
156
89
56.9
前列腺癌
126
80
63.5
鼻咽癌
98
35
36.1
睾丸癌
14
4
31.2

图1蛋白芯片检测常见肿瘤的阳性率

表4 恶性肿瘤各种肿瘤指标的阳性率(总数11256例)
组别
例数
CA199
NSE
CEA
CA242
FER
β-HCG
AFP
f-PSA
PSA
CA125
HGH
CA153
肝癌
1025
51.2
5.6
36.2
9.6
68.4
9.4
75.1
2.3
2.3
35.4
5.2
13.8
胃癌
1268
56.2
6.1
57.6
39.3
74.1
15.8
11.9
0.35
0.51
61.5
4.87
19.1
食管癌
768
37.5
0.2
16.7
9.7
53.5
6.2
0.1
0.2
0.6
34.5
0
8.5
结直肠癌
1381
57.6
6.0
42.4
39.1
48.6
0
9.68
0.3
0.5
47.5
0.1
16.3
肺癌
2112
18.7
13.6
40.8
21.8
70.6
7.52
1.6
2.3
5.6
47.5
6.8
11.5
胰腺癌
421
74.1
0.9
50.6
53.4
61.3
9.6
10.3
0.1
0.9
26.67
0.6
7.3
卵巢癌
961
21.5
0.4
14.5
1.4
30.5
41.5
10.2
0
0
62.5
0.1
12.4
子宫癌
156
12.2
1.8
49.1
13.7
42.3
22.8
13.9
0
0
60.3
13.1
9.5
前列腺癌
126
10.8
1.9
3.9
0.7
20.9
0.1
0.8
65.7
80.9
0
0
4.6
鼻咽癌
98
16.9
0.3
6.9
14.2
57.2
0.3
5.4
0
0
22.1
0
6.4
睾丸癌
14
0.1
0
0
1.6
11.2
527
1.6
3.6
3.6
0
0
0

2. 肿瘤术后监测组检测结果：对49例C-12阳性的肺癌患者，52例肝癌患者，14例卵巢癌患者，48例结直肠癌患者分别于根治性手术后第3-4周、第6-9周、3个月、6个月、12个月进行跟踪检测。检测值在第3-4周明显下降，与术前检测值有明显差异（P＜0.05）。但术后3个月，6个月，12个月血清肿瘤标志物之间无明显差异，见表5。在随访过程中，5例肺癌，6例肝癌，1例卵巢，4例结直肠癌患者检测中出现阳性并呈上升趋势，后经临床检查如CT，B超或手术后病理检测确定为肿瘤复发或发生转移。

表5 C-12阳性的肝癌组术前、术后肿瘤标志物血清水平(X±S)
组别
术前
（52例）
术后3-4周
（51例）
术后6-9周
（49例）
术后3月
（47例）
术后6月
（40例）
术后12月
（39例）
CA199
75.24±83.72
44.58±35.14
25.65±24.38
20.54±23.63
19.98±17.44
19.54±20.63
NSE
3.25±2.24
2.11±2.15
2.94±3.11
2.44±2.33
2.10±1.98
2.83±1.17
CEA
39.47±40.75
17.75±18.34
7.76±10.48
6.58±6.13
4.37±5.13
3.96±7.11
CA242
15.64±25.19
8.52±9.28
12.54±11.73
10.72±11.43
6.19±5.36
11.44±7.51
FER
410.73±125.78
211.14±98.63
256.19±111.61
278.51±142.82
212.85±101.77
199.52±191.77
β-HCG
0.97±0.77
0.81±0.65
0.55±0.55
0.54±0.60
0.67±0.59
0.47±0.74
AFP
332.73±125.78
46.14±58.63
19.19±18.11
18.51±16.82
17.85±23.77
12.85±30.77
f-PSA
0.07±0.76
0.01±0.65
0.05±0.38
0.04±0.52
0.04±0.59
0.09±0.27
PSA
4.63±4.77
3.65±3.44
2.55±4.15
3.54±2.60
2.67±0.19
2.88±2.34
CA125
22.73±25.71
25.14±11.58
14.19±24.61
19.51±18.52
24.85±11.77
17.13±23.37
HGH
2.07±0.76
3.16±4.21
2.99±3.38
4.26±4.52
3.21±2.88
3.79±5.27
CA153
4.58±2.96
3.58±3.99
2.15±5.11
3.71±2.44
3.967±1.58
2.77±3.45

3. 良性疾病组及健康体检组检测结果：良性疾病组肿瘤标志物的升高水平较恶性肿瘤为低，且以单项或2项指标升高为主。23531例健康体检者多种肿瘤标志物阳性1656例（铁蛋白单独升高不计入阳性数），总检出率7.0%。经临床诊断其中1489例为良性疾病，追踪病史及进一步检查发现主要为慢性炎症、息肉、药物损害、子宫内膜异位症、妊娠等引起的肿瘤标志物升高。98例经临床病理确诊为恶性肿瘤。69例不明原因肿瘤标志物升高，现仍在追踪随访中。由表6可以看出，良性疾病患者中，以单个肿瘤标志物升高为主，占81.5%；而恶性肿瘤患者多以三个或以上肿瘤标志物同时升高为主（80.7%）。

表6 肿瘤标志物阳性的健康体检者
C-12阳性个数
良性疾病（1489例）
恶性肿瘤（98例）
不明原因（69例）
1
1214（81.5%）
7（7.1%）
56（81.2%）
2
235（15.8%）
12（12.2%）
8（11.6%）
3
31（2%）
50（51.1%）
4（5.8%）
4或更多
9（0.7%）
29（29.6%）
1（1.4%）

讨 论
恶性肿瘤在我国人口中的死亡率为108.39/10万,占总死亡人数的17.9%,高居死亡原因的第二位。因此早期发现、早期诊断和早期治疗对肿瘤患者具有重要意义。血清中肿瘤标志物的检测是肿瘤诊断的重要手段之一。其临床应用价值广阔，但单指标检测往往存在特异性不强、阳性率偏低，特别是早期肿瘤的检出率不高等缺点。多肿瘤标志物联合检测可以克服这一缺点，大大提高检测肿瘤的敏感性和特异性，得到临床的广泛应用。
生物芯片是近几年发展起来的一种大规模集成化,简单快速的分析方法, 主要是指通过微细加工工艺在固体芯片表面构建的微型化学分析系统,从而实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确快速与大信息量的检测。常用的生物芯片分为三大类:基因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室。蛋白质芯片是利用芯片表面上的探针来捕获各种待检测的蛋白质,最常用的探针是抗体[4]。目前，蛋白芯片技术己经被广泛应用于多种肿瘤标志物的检测中[5，6，7]，蛋白芯片系统克服了传统蛋白分析方法的缺陷。可快速分析原始蛋白提取物或者血液中的多种蛋白质，同时提取血液、细胞或者组织中多种蛋白质的信息。本实验检测结果表明:在无任何临床症状的体检者中，经多肿瘤标志物检测后，确诊恶性肿瘤98例，检出率0.2%。在肿瘤患者经手术后定期监测的患者中5例肺癌，6例肝癌，1例卵巢，4例结直肠癌出现阳性并呈上升趋势，后经临床检查如CT，B超或手术后病理检测确定为肿瘤复发或发生转移。说明多肿瘤标志物检测对肿瘤的早期诊断和术后监测，判断预后具有重要的临床价值。
本实验检测结果表明，对同一肿瘤患者多肿瘤标志物检测，可能同时出现几种肿瘤标志物阳性，这与肿瘤标志物的特异性不高有关。因此目前均提倡采用多种肿瘤标志物联合检测，以尽可能达到提高肿瘤诊断的灵敏度和特异性。我们实验研究发现：CA199+AFP+CEA+FER对肝癌诊断的价值较大，CA199+CEA+CA242+CA125对消化道恶性肿瘤的诊断阳性率较高，CA199+CA125+CEA+FER联合诊断有助于肺癌的早期诊断。C-12芯片法对恶性肿瘤的检测总阳性率为85.6%，与各相关病种的常规血清肿瘤标志物检测灵敏度接近，提示C-12芯片法的基本临床诊断价值是显著的。由于12项指标的联合检测，C- 12蛋白芯片技术为许多常见的恶性肿瘤提供了多元化的阳性血清肿瘤标志物指标，如肝癌患者除AFP有一定阳性比例外， CA199或/和CEA及铁蛋白也呈阳性。而对于单项肿瘤标志物阳性比例不高的肿瘤如肺癌、乳腺癌、胃癌等，C-12芯片法的联合检测可以发现多项肿瘤标志物呈阳性，这不仅有助于提高临床诊断的灵敏度，而且有可能为临床治疗提供有效的监测指标。
体检人群中也有较高的肿瘤标志物阳性率,总阳性率达7.03%,单项以FER最高为4.11%, CEA次之(1.41%),CA125和CA199为0.36%和0.69%,良性疾病患者 多以单项或2项肿瘤标志物升高，而98例肿瘤患者（同时做影象学检查,后经病理学检查确诊为恶性肿瘤。）三项以上指标同时检测到阳性的有79例，占80.7%。由此可见，使用多指标联合检测，对恶性肿瘤的检出具有更高的灵敏度和特异性。
蛋白芯片技术的建立为多肿瘤标志物的检测及其相关的研究提供快速、高信息量和更为直接的研究方法，但由于肿瘤细胞生物特性的复杂及多态性,到目前为止尚未找到一种特异性和敏感性达100%的肿瘤标志物,即使联合检测目前比较成熟的和常用的肿瘤标志物,其敏感性也无法达到百分之百, 我们的实验研究显示C-12芯片法对恶性肿瘤的检测总阳性率为85.6%，对体检人群的肿瘤筛查也具有较好的灵敏度和特异性。由于C-12芯片具有高信息量，高通量，低成本的特点，在适合肿瘤临床检测的同时，对肿瘤高危人群进行肿瘤体检筛查也具有显著的临床意义。由于已有的肿瘤标志物在灵敏度和特异性方面仍然不够理想，使用肿瘤标志物进行肿瘤检测仍然有较高的假阳性和假阴性。利用肿瘤标志物对肿瘤患者进行诊断和筛查,仍需更进一步的完善和发展。

参考文献
1. 邹雄,张利宁,主编.分子免疫学与临床,济南:山东科技出版社.2002.283～300
2. 邹 雄.肿瘤标志在肿瘤早期诊断中的研究和应用发展[J].中华检验医学杂志,2002,25(2):71—72.
3. Weinberger SR,Morris TS,Pawlak M.Recent trends in protein biochip technology[J]. Pharmacogenomics,2000,1(4):395~416
4. Chapman K. The Proteinchip biomarker system from ciphergen biosystems: a novel proteomics platform for rapid biomarker discovery and validation[J].Biochem Soc Trans,2002,30(2):82
5. Sun zh-h,Fu X-L,Zhang L,et al.A Protein Chip System for Parallel Analysis of Multi-tumor Markers and its Application in Cancer Detection[J].Anticancer research,2004,1159-1166
6. Rubin RB.Merchant M A rapid Protein Profiling system that speeds study of caneer and otherdiseases[J].Am Clin Lab，2000,19(8):28-29.
7. 齐军,车轶群.使用多种肿瘤标志物蛋白质芯片诊断系统检测卵巢肿瘤.中华检验医学杂志,2003,26(6):358~360.