建立合适的动脉粥样硬化.pdf

文章编号100723949(2003)1120520465205 方法学研究三种大鼠动脉粥样硬化模型复制方法的比较郭延松,吴宗贵,杨军柯,黄高忠(第二军医大学长征医院心血管内科,上海200003)关键词 病理学与病理生理学;大鼠动脉粥样硬化模型的复制;高脂+维生素D+内皮损伤;动脉粥样硬化,大鼠模型;高脂;维生素D;内皮损伤摘 要 为研究动脉粥样硬化的发病机制,比较了三种大鼠动脉粥样硬化斑块模型建立的方法。分别予单纯高脂、高脂+维生素D、高脂+维生素D+内皮损伤三种不同方法处理大鼠,90天后比较血脂、血钙、胸主动脉的形态学改变、巨噬细胞和 2平滑肌肌动蛋白含量。结果发现,三组实验组与正常对照组相比,总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇均明显升高(P 0.01);高脂+维生素D组、高脂+维生素D+内皮损伤组与正常对照组和高脂组相比,血钙均明显升高(P0.01);高脂+维生素D组、高脂+维生素D+内皮损伤与正常对照组相比,内膜增厚、中膜萎缩(P 0.05或P 0.01);单纯高脂组、高脂+维生素D组CD68为弱阳性,高脂+维生素D+内皮损伤组为强阳性;高脂+维生素D组内膜有较厚的 2平滑肌肌动蛋白阳性,高脂+维生素D+内皮损伤组斑块表面只有很薄的 2平滑肌肌动蛋白阳性;单纯高脂组只可形成高脂血症,无法形成动脉粥样硬化病变;高脂+维生素D组可形成纤维斑块;高脂+维生素D+内皮损伤组可形成较成熟的动脉粥样硬化斑块。证明了大鼠可作为研究动脉粥样硬化的良好动物模型,高脂+维生素D+内皮损伤组可形成较成熟的动脉粥样硬化斑块。中图分类号R363文献标识码AComparison on the Three Duplication Methods of Atherosclerosis Model in R atsG UO Yan2Song,WU Z ong2Gui,Y ANGJun2Ke,and HUANG Gao2Zhong(Department of Cardiovasology,Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai200003)KEY WORDSAtherosclerosis;Rat;Model;High lipid;Vitamin D;Endothelium Injure ABSTRACTAimT o investigate pathogenesis of atherosclerosis,three methodsfor establishment of rat animal model werecompared.MethodsThree different methods,including high lipid only,high lipid+Vitamin D overload,and high lipid+Vitamin D overload+endothelium injure,were usedfor inducing atherosclerosis in rats.After 90 days,serum lipid,serum cal2cium,morphology change of thoracic aorta were determined,and immunohistochemical assay of macrophage and(2smooth muscleactin were performed.ResultsThe levels of serum total cholesterol(TC),triglyceride(TG),LDLC in three groups(hyper2lipidemia group,hyperlipidemia+vitamin D3 group,and hyperlipidemia+vitamin D3+endothelium denudate group)were ob2viously higher than those in control group(P 0.01).The levels of serum calcium in two groups(hyperlipidemia+vitamin D3group and hyperlipidemia+vitamin D3+endothelium denudate group)were also obviously higher than those in control group andhyperlipidemia group(P 0.01).Compared with control group,there were thicker intima,thinner media in hyperlipidemia+vitamin D3 group and hyperlipidemia+vitamin D3+endothelium denudate group(P 0.05 andP 0.01).By immunohis2tochemistry,the CD68 positive level were low in hyperlipidemia group and hyperlipidemia+vitamin D3 group,and high in hyper2lipidemia+vitamin D3+endothelium denudate group.The 2actin positive level in intima is thick in hyperlipidemia+vita2min D3 group,thin in hyperlipidemia+vitamin D3+endothelium denudate group.The rats treated with high lipid only showedhyperlipidemia without As lesion;the rats treated with high lipid+Vitamin D overload showed fibrous plaque;the typical matureatheromatous plaques were presented in the rats treated with high lipid+Vitamin D overload+endothelium injure creates matureatheromatous plaque.ConclusionsRat can be used as a ideal model for research atherosclerosis.The mature atheromatousplaque may created by high lipid+Vitamin D overload and endothelium injure.收稿日期2003201221修回日期2003206230基金项目 国家重点基础研究发展规划项目(G2000056900)资助作者简介 郭延松,男,1971年出生,汉族,福建省福清市人,医学博士,主要从事冠心病研究,E2mail为ysguo1234 。吴宗贵,男,1952年出生,汉族,安徽省枞阳县人,教授,博士研究生导师,为本文通信作者,联系电话:021263610109273201。杨军柯,男,1970年出生,汉族,河南省洛阳市人,博士,主要从事冠心病研究。建立合适的动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)动物模型是研究其发病机制及探讨治疗措施的重要前提条件。As是多因素引起的慢性炎症性反应,涉及脂质浸润、钙超载、内皮损伤等致病因素,为此,本文设计了三种大鼠动脉粥样硬化模型建立的方法并进行了比较,为研究As的病因、发病机制和防治措施提供合适的动物模型。1 材料与方法1.1 实验动物健康纯种Wistar雄性大白鼠,体重200 g(34564CN 4321262/R中国动脉硬化杂志2003年第11卷第5期 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.,Ltd.All rights reserved.月龄),由第二军医大学实验动物中心提供。1.2 动物分组与喂养40只大鼠随机分为4组,每组10只:正常对照组喂基础饲料。单纯高脂组以高脂饲料(2%胆固醇、0.5%胆酸钠、3%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶和94.3%的基础饲料)喂养。高脂维生素组在喂高脂饲料的基础上加维生素D3粉剂(1.25106u/kg饲料)喂养,实验开始时于右下肢肌肉注射维生素D3针剂(3105u/kg体重),每隔30天重复一次。内皮损伤组在给予高脂维生素组相同处理的基础上,于第7天行大鼠主动脉内膜球囊损伤术1。动物饲养在带不锈钢盖底的塑料笼内,每笼2只,自由饮水,室温1923,自然采光。1.3 大鼠主动脉内膜球囊损伤术动物用戊巴比妥钠(30 mg/kg体重)腹腔麻醉,背位固定,无菌条件下作颈正中切口,分离左颈总动脉,结扎远心端,向心脏方向插入1.5F球囊,进入8cm后,注入0.2 mL生理盐水充盈球囊,手感到一定阻力向回拉约45 cm,放水后再进入8 cm,注水充盈、回拉、放水,反复3次,拔出球囊,结扎近心端。1.4 血液和动脉标本的采集实验第90天,各组动物禁食过夜,在戊巴比妥钠腹腔麻醉下,分离腹主动脉,在肾动脉分叉处下方,剪开腹主动脉,插入穿刺针,以注射器采集动脉血,用3 000 r/min立即离心15 min,分离血浆,取1mL用检测血脂和血钙;剪下主动脉,取胸主动脉下段约1 cm立即用10%甲醛固定,用于常规形态学和免疫组织化学检查。1.5 血脂和血钙的检测用Abbott Aeroset TM生物化学分析仪(美国亚培公司)检测血浆总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(highdensity lipoprotein cholesterol,HDLC)、LDLC和Ca2+。1.6 病理学观察1.6.1 形态学研究 将用10%甲醛固定的胸主动脉石蜡包埋,连续切片,切片固定于载玻片上,HE染色,光镜观察,利用HPLAS21000型图象分析系统检测内膜、中层厚度。1.6.2 巨噬细胞和平滑肌肌动蛋白免疫组织化学检测 采用微波EnVision法2,应用小鼠抗大鼠CD68单克隆抗体和平滑肌肌动蛋白单克隆抗体为一抗鉴定巨噬细胞和平滑肌细胞,EnVision复合物为二抗,常规DAB2H2O2显色,苏木素复染。1.7 统计分析数据用xs表示,利用SPSS10.0统计软件行方差分析,各组间两两比较用SNK法。2结 果2.1 一般状况实验过程中共有4只大鼠死亡,其中单纯高脂组死亡1只,高脂维生素组死亡2只,内皮损伤组死亡1只,对照组无死亡。实际用于结果分析的共36只。实验发现,正常对照组大鼠的体重随饲养的时间延长而逐渐增加,但单纯高脂组、高脂维生素组和内皮损伤组大鼠的体重在最初一个月增长,到第二个月基本不变,在第三个月略有减少,但组间差异无统计学意义(表1,Table 1)。表1.各组实验大鼠体重变化(g,xs)Table 1.The changes of weight in experimental rats.分 组n0天第30天第60天第90天正常对照组1020616231102581328811单纯高脂组921112238102411122616高脂维生素组819912229122312122318内皮损伤组9207142351723418221122.2 血脂和血钙浓度的变化血脂和血钙变化见表2(Table 2)。经方差分析,与正常对照组相比,其它三组动物血清TC、TG和LDLC均明显升高(P 0.01),HDLC各组间差异无统计学意义。与正常对照组和高脂组相比,高脂维生素组和内皮损伤组动物血清Ca2+均明显升高(P 0.01)。2.3 胸主动脉形态学变化各组动物胸主动脉经HE染色在显微镜观察发现,正常对照组管腔圆形,内膜、中膜和外膜分界清楚,管腔面由单层内皮细胞覆盖,细胞完整,中膜主要见梭形平滑肌细胞;外膜较薄,为疏松结缔组织。高脂组管壁层次尚清晰,内膜内皮细胞完整,中膜无明显萎缩、增厚,外膜为疏松结缔组织。高脂维生素组管壁明显增厚,平滑肌增生明显,细胞排列紊乱,纤维组织增生伴片状或点状钙化,弹性纤维层结构不清,形成纤维增生性动脉粥样硬化斑块。内皮损伤组管壁内皮细胞脱落,内膜增厚,斑块表面纤维帽薄,突出的斑块内含有坏死物质,平滑肌细胞减少,纤维组织增生伴片状或点状钙化,中膜明显萎缩,呈较典型的成熟动脉粥样硬化斑块(图1,Figure 1)。664ISSN 100723949 Chin J Arterioscler,Vol 11,No 5 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.,Ltd.All rights reserved.表2.各组大鼠血清脂质和血钙水平(mmol/L,n=6,xs)Table 2.The changes of serum lipids in experimental rats.分 组TCTGHDLCLDLCCa2+正常对照组2.490.200.840.380.980.221.130.482.450.51单纯高脂组14.644.48b2.280.48b1.050.3811.323.54b2.440.57高脂维生素组15.874.18b2.790.50b1.050.5311.723.14b4.020.83bd内皮损伤组16.344.39b2.930.45b1.140.3513.463.55b3.970.91bdb:P 0.01,与正常对照组比较;d:P0.01,与高脂组比较图1.大鼠胸主动脉壁显微镜图像(HE染色,100)A为正常对照组,B为高脂组,C为高脂维生素组,D为内皮损伤组。Figure 1.Photomicrograph of thoracic aorta in rats(HE staining,100)2.4 胸主动脉内膜和中膜厚度用图像分析仪检测的胸主动脉壁内膜和中膜的厚度见表3(Table 3)。与正常对照组相比,高脂组动物内膜和中膜厚度均无差别;高脂维生素组内膜增厚(P0.01),中膜萎缩(P 0.05);内皮损伤组内膜明显增厚(P 0.001),中膜明显变薄(P0.01)。2.5 胸主动脉巨噬细胞免疫组织化学检测用特异性巨噬细胞抗体CD68抗体为一抗,阳性为椭圆形黄染。可见正常对照组阴性、高脂组和高脂维生素组为弱阳性,内皮损伤组为强阳性(图2,Figure 2)。表3.胸主动脉内膜和中膜厚度(m,n=6,xs)Table 3.Thickness of intima and media in thoracic aorta分 组内膜厚度中膜厚度正常对照组8.31.4100.79.7单纯高脂组8.61.3102.710.1高脂维生素组37.88.9b80.79.1a内皮损伤组105.724.6c42.66.1ba:P 0.05,b:P0.01,c:P豚鼠狗兔猪,这个顺序显然与抗As的种属特异性颇为一致5。维生素D诱发动脉壁的损伤和粥样硬化形成已有报道,高脂+钙超载组在胸主动脉形成了具有平滑肌细胞增殖以及泡沫细胞形成的增生性纤维斑块,但还不是成熟的动脉粥样硬化斑块,这也限制了该模型的广泛应用。维生素D诱发As的机理目前仍存有争论,有作者认为,维生素D诱发动脉粥样硬化是由于它能使血浆胆固醇升高之故;也有作者认为,与维生素D导致的血钙升高有关。在本实验中,单纯高脂组、高脂维生素组和内皮损伤组,血脂水平无差别,似乎说明维生素D诱发动脉粥样硬化与血浆胆固醇升高无关;我们认为可能的机理是:维生素D导致血钙升高,破坏动脉管壁内皮的完整性,有利于血浆脂质对管壁侵入和损伤,从而形成动脉粥样硬化6;维生素D导致血钙升高,可促使钙盐在主动脉中膜沉积,使平滑肌细胞变性或钙化7。Kramsch等8发现在As形成过程中,平滑肌细胞的迁移和增殖,以及分泌细胞外基质都需要钙离子作为第二信使,Weinstein等9发现在As动物模型中,钙离子拮抗剂可抑制As病变的进展,也都从侧面说明了钙离子在As形成过程中的重要性。内皮损伤组胸主动脉HE染色见典型的且较成熟的动脉粥样硬化斑块:病变处内皮细胞脱落,内膜明显增厚、纤维化,血管壁向管腔内突出,斑块内含有大量864ISSN 100723949 Chin J Arterioscler,Vol 11,No 5 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.,Ltd.All rights reserved.的泡沫细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞,纤维组织增生伴片状钙化,中层平滑肌细胞明显萎缩;巨噬细胞免疫组织化学、平滑肌肌动蛋白免疫组织化学结果也说明了该模型的成功。该模型的成功建立说明了在较短时间内建立较成熟的动脉粥样硬化斑块模型,内膜的机械损伤十分必要,因为它直接造成内膜的损伤、剥脱,内弹力板的断裂,极大地加速了脂质及钙盐的沉积、血流中炎症细胞的侵入;而单纯高脂或/和钙超载只能通过较长时间的应用,使机体内环境的发生改变,进而造成易损血管的生理生物化学变化,使脂质及钙盐的沉积、炎症细胞的浸润成为可能。本实验结果表明:大鼠可作为研究As的良好动物模型。(1)单纯给予大鼠高脂饲料不易形成As病变;(2)给予大鼠高脂饲料加维生素D负荷仅仅导致纤维和平滑肌增生样的动脉粥样硬化,并没有成熟的动脉粥样硬化斑块形成;(3)给予大鼠高脂饲料及维生素D负荷的同时,予球囊损伤动脉可形成与人类As相似的较成熟的动脉粥样硬化斑块模型。参考文献1Fonseca FA,Paiva T B,Silva EG,Ihara SS,Kasinski N,Martinez T L,et al.Dietary manaesium improves endothelial dependent relaxation of ballon injuted ar2teriws in rats.Atherosclerosis,1998,139:23722422 马大烈,郑青渝,李今华,李金华,黄 玲,魏建丽.微波EnVision免疫组织化学技术及其应用.中华病理学杂志,1998,27(2):15321543 张 磊,陈国荣,郑荣远,王群姬,谢淑萍,王拥军.高脂饲料加空气干燥术建立兔颈动脉粥样硬化模型.中国动脉硬化杂志,2001,9(2):15521584 杨小毅,万载阳,谭健苗,袁中华,杨永宗.一种纯系小鼠动脉粥样硬化模型的建立.中国动脉硬化杂志,1995,3(2):1825GroenerJE,Bax W,Stuani C,Pagani F.Difference in substrate 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