水基切削液中优势硫酸盐还原.、生理特性及其活性抑制研究_朱大玲.pdf

水基切削液在金属加工领域应用广泛,在使用过程中容易腐败发臭,硫酸盐还原菌是导致其腐败变臭的主要微生物种群。为深入了解水基切削液中硫酸盐还原菌的特点并探究其抑制方法,采用涂布平板法从使用过的切削液中分离筛选出两株优势硫酸盐还原菌 Y8 和 Y10。采用16S rDNA序列分析法,菌株 Y8 和 Y10 分别鉴定为肉毒杆菌和摩氏摩根菌。生长曲线分析结果表明两株菌的生长速度都较快,厌氧条件下37 培养2 d 后均到达生长稳定期,比较发现菌株Y10 无论从生长速度和最终生物量浓度都高于菌株 Y8;采用单因素法对菌株的生长条件进行分析,结果表明经切削液体系的长期驯化,两株硫酸盐还原菌菌株均具有一定的耐逆性。菌株 Y8 的最佳生长 pH 值、NaCl 质量分数、温度和接种量分别为 9、0、35 和 1%;菌株 Y10 的最佳生长 pH 值、NaCl 质量分数、温度和接种量分别为 8、0.1%、30 和 3%。聚赖氨酸对肉毒杆菌 Y8 和摩氏摩根菌 Y10 都有较好的抑菌效果,最小抑菌质量浓度分别为 20 mg/L 和60 mg/L,因此 聚赖氨酸可作为维持水基切削液生物稳定性的候选生物抑菌剂。关键词:环境工程学;水基切削液;硫酸盐还原菌;生理特性;聚赖氨酸;活性抑制中图分类号:X172 文献标志码:ADOI:10.13637/j.issn.1009-6094.2022.0333收稿日期:20220311作者简介:朱大玲,副研究员,博士,从事生物质资源利用和功能微生物研究,zhudaling 。基金项目:天津市卤水化工与资源生态化利用重点实验室开放基金项目(BCERE201908)0 引 言金属切削液是金属加工过程中必不可少的材料,其在金属加工过程中主要起冷却、润滑、防锈和清洗与排屑作用1。金属切削液应用范围广泛,有机械加工的地方几乎都会使用切削液2。按照组成成分和介质的不同,金属切削液可分为油基切削液和水基切削液。油基切削液因含有矿物油、硫、氯、磷等成分,在高速切割过程中容易产生油雾,导致着火现象发生3,而水基切削液是将浓缩液加入大量水稀释后使用,因水的比热容大于油的比热容,导热性强,其使用过程中不会出现油雾和着火现象。虽然水基切削液具有价格低廉、导热性能好等优点,但也存在一些不足之处,如生物稳定性较差、润滑防锈性能较差、废液排放污染环境等4 5。目前制约水基切削液行业发展且迫切需要解决的难题是生物稳定性问题6。水基切削液在稀释和使用过程中,与外界环境处于开放式接触,空气、零件和机械表面等的微生物会进入切削液7。水基切削液的脂肪酸皂、矿物油、磺酸盐等成分是微生物天然的营养物质,在适宜的温度条件下,微生物会快速繁殖,导致水基切削液的快速腐败8。钢铁在含有微生物的切削液中,耐腐蚀性也会变差9。腐败的切削液性能下降,散发恶臭,只能通过更换新液来恢复切削液的质量要求,微生物导致的腐败是水基切削液换液的主要原因10。早在 1943 年 Duffett 等已开始研究切削液中的微生物种类,为后来切削液使用过程中微生物多样性研究奠定了基础11。硫酸盐还原菌(Sulfate-reducing Bacteria,SRB)是导致水基切削液腐败变臭的主要微生物种群之一12。SRB 是一类能够利用硫酸盐代谢产生硫化氢的厌氧或微氧微生物,腐败水基切削液发黑和发臭主要是由于在 SRB 作用下金属碎屑与硫酸根发生反应生成黑色的金属硫化物和具有恶臭气味的硫化氢气体13。水基切削液中微生物污染的初期,优势微生物为好氧或兼性厌氧菌,这些微生物的代谢需要消耗氧气导致切削液含氧量下降,因此在微生物污染的后期,SRB 开始大量繁殖,导致切削液腐败发黑且发臭14。1980 年林新勇研究了影响切削液腐败的环境因素,如 pH 值、温度、水质等,提出了切削液防腐的有效措施,为后续研究者和机械加工企业在切削液防腐方面提供了参考15。为保持良好的润滑和防锈性能,水基切削液的 pH 值通常保持在 8.6 9.616,这使得水基切削液中的 SRB 菌株在弱碱性条件下长期驯化,耐受性增强。目前用于控制水基切削液中 SRB 的物理和化学方法包括微波法、超声波法、辐射法和加入化学杀菌剂法等17,这些方法往往需要设备投入、存在安全隐患或威胁操作人员健康等原因,具有一定的局限性18。因此,寻找一种安全高效的方法来降低切削液优势微生物污染显得尤为重要。已有研究表明 聚赖氨酸(polylysine,PL)是一种具有抑菌作用的聚合多9112第 23 卷第 6 期2023 年 6 月 安全 与 环 境 学 报Journal of Safety and Environment Vol.23 No.6Jun.,2023肽19。1977 年 Shima 等20首 次 从 白 色 链 霉 菌Streptomyces albulus 中分离出 PL。PL 进入人体后会被分解成人体必需的赖氨酸,而且 PL 在小鼠试验中不会产生毒副作用21。PL 的安全性、稳定性及广谱抗菌性适合作为水基切削液的抑菌剂进行开发研究。因此本研究从腐败切削液中筛选分离纯化 SRB优势菌株并进行分子鉴定,分析其生理特性,探究PL 对两株硫酸盐还原菌的活性抑制效果,以期为维持水基切削液生物稳定性提供理论基础。1 材料与方法1.1 培养基亚硫酸铁培养基(g/L):蛋白胨20,酵母浸膏5,偏重亚硫酸钠 1,柠檬酸铁 1;固体培养基按 2%加入琼脂粉。培养基最终 pH 值为 7.5 7.7。灭菌条件为 121 灭菌 20 min。测定生理特性及最低抑菌浓度时不添加柠檬酸铁,测定菌株还原硫酸盐作用时将柠檬酸铁换为柠檬酸铁铵22。1.2 硫酸盐还原菌的分离鉴定1.2.1 硫酸盐还原菌的分离纯化将灭菌的亚硫酸盐固体培养基倾注平板,待其凝固。取腐败切削液用无菌生理盐水进行梯度稀释,取各梯度稀释液 100 L 涂布平板,将冷却至45 的灭菌石蜡倾注平板,形成隔氧封层。37 培养 48 h 后选取菌落分布平均的平板,用接种环挑取使培养基变黑的单菌落,将其置于装满液体培养基的螺口试管中,37 摇床培养 48 h。取培养好的菌液用接种环在固体培养基中进行三区划线,37 培养 48 h,挑取使培养基变黑的单菌落,将其置于装满液体培养基的螺口试管中,37 摇床培养 48 h,重复上述步骤 4 次,得到纯菌株培养液。选取生长速度快且硫酸盐还原能力强的优势菌株进行深入研究。1.2.2 硫酸盐还原菌的分子鉴定硫酸盐还原菌基因组 DNA 的提取采用酚 氯仿抽 提 的 方 法23。采 用 引 物 为27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和 1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)24,以 基 因 组 DNA为模板进行 PCR 扩增,扩增产物经北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行序列测定。所获得 16S rDNA序列在 GenBank 数据库中进行 BLAST 序列同源性比对。使用 MEGA 6.0 软件,以邻接法构建系统进化树,Bootstrap 置信值估算重复 1 000 次。1.3 菌株还原硫酸盐作用从冷藏的保菌管中取 200 L 菌液加入盛满无菌培养基的血清瓶(250 mL)中,37 下培养 72 h,对菌株进行活化。按照 3%的接种量取活化好的菌液接种至盛满培养基的螺口试管内,放于 37 的摇床中,观察培养基颜色。1.4 硫酸盐还原菌生长曲线的测定按照 3%的接种量接种至盛满培养基的螺口试管内,每 3 只为 1 组,设置 5 组。每天取 1 组测定菌液在 600 nm 处的吸光值。1.5 硫酸盐还原菌生理特性研究1.5.1 pH 值对硫酸盐还原菌生长的影响为探究 pH 值对优势硫酸盐还原菌生长的影响,用 1 mol/L 的 NaOH 或 HCl 将亚硫酸铁培养基的 pH 值分别调节为 3、4、5、6、7、8、9、10。培养基的NaCl 质量分数为 0。灭菌后按 3%的接种量分别接种2 株硫酸盐还原菌,置于37 的摇床培养72 h 后测定菌液在 600 nm 处的吸光值。试验重复 3 次。1.5.2 NaCl 质量分数对硫酸盐还原菌生长的影响为探究 NaCl 对优势硫酸盐还原菌生长的影响,按照 NaCl 最终质量分数为 0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、1%、3%、5%的条件调节培养基的 NaCl 含量。培养基的 pH 值为 7.5 7.7。灭菌后按 3%的接种量分别接种 2 株硫酸盐还原菌,放于 37 的摇床培养 72 h 后测定菌液在 600 nm 处的吸光值(A600)。试验重复 3 次。1.5.3 温度对硫酸盐还原菌生长的影响为探究温度对优势硫酸盐还原菌生长的影响,将培养基灭菌后按 3%的接种量分别接种 2 株硫酸盐还原菌,分别放于25、30、35、40、45 的摇床培养 72 h 后测定菌液在 600 nm 处的吸光值。试验重复 3 次。培养基初始 pH 值为 7.5 7.7,NaCl 质量分数为 0。1.5.4 接种量对硫酸盐还原菌生长的影响为探究接种量对优势硫酸盐还原菌生长的影响,将培养基灭菌后分别按 1%、2%、3%、4%、5%的接种量接种 2 株硫酸盐还原菌,放于 37 的摇床培养 72 h 后测定菌液在 600 nm 处的吸光值。试验重复 3 次。培养基初始 pH 值为 7.5 7.7,NaCl 质量分数为 0。1.6 PL 对硫酸盐还原菌的活性抑制为探究 PL 对切削液中优势 SRB 菌株的活性抑制效果,分别配制 PL 质量浓度为 0 220212 Vol.23 No.6 安全 与 环 境 学 报 第 23 卷第 6 期mg/L(间隔 2 mg/L)和 0 220 mg/L(间隔 20mg/L)的培养基。将配好的培养基分装到螺口试管中,每管加入 5 L 的菌液,放于37 摇床培养48 h后测定菌液在 600 nm 处的吸光值,通过分析获得 PL 对 SRB 菌株的最小抑菌浓度。试验重复 3 次。培养基初始 pH 值为 7.5 7.7,NaCl 质量分数为 0。2 结果与分析2.1 硫酸盐还原菌 16S rDNA 序列分析通过硫酸盐菌群富集及筛选纯化,从水基切削液中共分离获得出 10 株硫酸盐还原菌,选取生长速度快且硫酸盐还原特性强的 Y8 和 Y10 两菌株进行深入研究。16S rDNA 序列测定及分析结果表明SRB Y8 菌株获得的序列长度为 1 393 bp,NCBI 登录号为 MZ521004。菌株 Y8 的 16S rDNA 序列在GenBank 数据库中进行 BLAST 同源性比对,与 NCBI数据库中的 C.botulinum(MK910398)相似度最高,相似度为100%。菌株 Y8 的16S rDNA 序列采用 NJ法构建系统发育树如图 1(a)所示,该序列与C.botulinum归为一类,因此菌株 Y8 鉴定为 Clostridiumbotulinum。SRB Y10 菌株获得的 16S rDNA 序列长度为 1 391 bp,NCBI 登录号为 MZ520861。菌株 Y10的 16S rDNA 序列在 GenBank 数据库中进行 BLAST同源性比对,与 NCBI 数据库中的 M.morganii(KT261418)相似度最高,相似度为 96.37%。菌株Y10 的 16S rDNA 序列采用 NJ 法构建系统发育树如图 1(b)所示。该序列与 M.morganii 归为一类,因此菌株 Y10 鉴定为 Morganella morganii。2.2 菌株还原硫酸盐作用硫酸盐还原菌会还原硫酸盐产生硫化氢,硫化氢遇铅盐或铁盐便形成黑色沉淀21。如图 2 所示,在添加柠檬酸铁铵的培养基中,培养基变黑且有强烈的臭味,说明 2 株菌可以还原硫酸盐产生硫化氢,具有硫酸盐还原菌的特性。2.3 硫酸盐还原菌生长曲线的测定SRB 菌株 Y8 和 Y10 菌株的生长曲线测定结果如图 3 所示。从图 3(a)可以看出,0 2 d 时,SRB菌株 Y8 的菌液 A600一直在快速升高,菌株处于生长指数期;3 5 d 时,菌液的 A600趋于平稳,达到 0.80以上,菌株处于生长稳定期。从图 3(b)中可以看出,0 1 d 时,SRB 菌株 Y10 的菌液 A600快速升高,菌株处于生长指数期;2 5 d 时,菌液的 A600趋于平稳,达到 1.00 以上,菌株处于生长稳定期。通过比较可以发现菌株 Y10 无论从生长速度和最终生物量浓度都要高于菌株 Y8。图 1 SRB 菌株 Y8 和 Y10 基于 16SrRNA基因序列构建的 NJ 系统发育树Fig.1 Phylogenetic trees of SRB strains Y8 and Y10constructed by neighbor-joining basedon 16SrRNA gene sequence图 2 SRB 菌株 Y8 和 Y10 对硫酸盐的还原Fig.2 Reduction of sulfate by SRB strains Y8 and Y10肉毒杆菌 Y8 为芽孢杆菌科梭菌属菌株,梭菌属菌株的发酵代谢途径为丁酸与丙酮 丁醇发酵,其发酵产物为混合的有机酸或醇类。根据东秀珠等25编著的常见细菌系统鉴定手册,肉毒杆菌发酵可以产生乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸等。摩氏摩根菌Y10 为肠杆菌科摩氏摩根菌属菌株,摩氏摩根菌属菌株的发酵代谢途径为混合酸发酵,在发酵过程中会产生乳酸、乙酸、甲酸等小分子有机酸和乙醇、2,3丁二醇等醇类26。无论是丁酸与丙酮 丁醇发酵还是混合酸发酵,都存在酸和醇转换的阶段。在发酵的初期,发酵产物主要是以小分子有机酸为主,这会使得发酵体系的 pH 值下降,当 pH 值下降到一定程度,酸性环境就会抑制细菌的生长,且会激发细菌细1212 2023 年 6 月 朱大玲,等:水基切削液中优势硫酸盐还原菌的分离、生理特性及其活性抑制研究 Jun.,2023图 3 SRB 菌株 Y8 和 Y10 的生长曲线Fig.3 Growth curves of strains Y8 and Y10胞内的代谢途径的改变,转向丙酮 丁醇和乙醇 2,3丁二醇发酵,这是发酵产物主要为醇类为主。这可能是 2 株菌的生物量在第 4 d 都出现下降后又上升的原因。2.4 硫酸盐还原菌生理特性研究2.4.1 pH 值对硫酸盐还原菌生长的影响pH 值对 2 株硫酸盐还原菌生长的影响如图 4所示。从图 4(a)可以看出,pH 值在 3 6 和 pH=10 时,SRB 菌株 Y8 菌液的 A600均在 0.05 以下,表明在偏酸和偏碱 pH 值条件下菌株 Y8 几乎没有生长。SRB 菌株 Y8 在弱碱性条件下生长良好,A600达到0.80 以上。pH 值在 7 9 时,随着 pH 值的增大,菌液的 A600也在提高,因此 SRB 菌株 Y8 的最佳生长pH 值为 9。从图 4(b)中可以看出,SRB 菌株 Y10在中性和弱碱性条件下生长良好,A600达到 1.50 以上;在酸性条件下不易生长,A600在 0.05 以下。pH值在 7 8 时,随着 pH 值的增大,菌液的 A600逐渐提高;pH 值在 8 10 时,随着 pH 值的增大,菌液的A600逐渐降低,因此 SRB 菌株 Y10 的最佳生长 pH 值为 8。通过比较发现在 pH 值为 10 时,SRB 菌株 Y8图 4 不同 pH 值培养条件对菌株 Y8 和菌株 Y10生长的影响Fig.4 Effects of different pH value culture conditionson the growth of strain Y8 and strain Y10菌液的 A600低于 0.05,而 SRB 菌株 Y10 菌液的 A600达到0.50,说明在 pH 值为10 时 SRB 菌株 Y10 的生长状况优于 SRB 菌株 Y8,SRB 菌株 Y10 较 Y8 具有良好的耐碱性。不同 pH 值培养条件下两者的生物量进行比较,表明 SRB 菌株 Y10 的生长速度和生物量积聚量皆高于 SRB 菌株 Y8。2.4.2 NaCl 质量分数对硫酸盐还原菌生长的影响NaCl 质量分数对 2 株硫酸盐还原菌生长的影响如图 5 所示。SRB 菌株 Y8 仅能在无盐条件即NaCl 质量分数为 0 时生长良好,且其菌液 A600达到1.10 以 上。在 NaCl 质 量 分 数 为 0.1%、0.2%、0.3%时,SRB 菌株 Y8 可以生长,其菌液 A600达到0.2 以上;在 NaCl 质量分数为 0.4%、1%时,SRB 菌株 Y8 的菌液 A600很小,低于 0.02,几乎没有生长。表明该菌株不耐盐,在含有 NaCl 的条件下不易生长(图 5(a)。ELIAS 等报道肉毒杆菌在受到盐胁迫时基因 sigK 被诱导,若基因 sigK 被破坏会导致肉毒杆菌在高盐度下的生长缺陷27。肉毒杆菌 Y8 不具有耐盐特性也可能是盐度环境下不会发生基因 sigK的诱导所致。SRB 菌株 Y10 的最适 NaCl 质量分数2212 Vol.23 No.6 安全 与 环 境 学 报 第 23 卷第 6 期图 5 不同 NaCl 质量分数培养条件对菌株 Y8 和 Y10 生长的影响Fig.5 Effects of different NaCl mass fraction cultureconditions on the growth of strains Y8 and Y10为 0.1%,菌液 A600达到 1.88 以上。在 NaCl 质量分数 0.5%5%均生长良好,A600达到 1.02 以上。因此 SRB 菌株 Y10 具有良好的耐盐性(图 5(b)。本研究团队从红树林环境中也分离到 1 株摩氏摩根菌,其在 0 5%的 NaCl 质量分数下能够存活,也具有良好的耐盐性28。2.4.3 温度对硫酸盐还原菌生长的影响温度对 2 株硫酸盐还原菌的影响如图 6 所示。温度通常通过影响硫酸盐还原菌体内酶的活性来影响硫酸盐还原菌的生长,温度过高或过低都会影响酶的活性。从图 6(a)中可以看出,在 25 35,随着温度的升高,SRB 菌株 Y8 的菌液 A600逐渐升高;在35 45,随着温度的升高,SRB 菌株 Y8 的菌液A600逐渐降低。因此 SRB 菌株 Y8 的最适生长温度为 35,A600达到 0.85。从图 6(b)中可以看出,在25 30,随着温度的升高,SRB 菌株 Y10 菌液的A600逐渐升高;在 30 45,随着温度的升高,SRB菌株 Y10 的菌液 A600逐渐降低。因此 SRB 菌株 Y10的最适生长温度为 30,A600达到 1.72 以上。2.4.4 接种量对硫酸盐还原菌的影响不同接种量对 SRB 菌株 Y8 和 Y10 的影响如图图 6 不同温度培养条件对菌株 Y8 和 Y10 生长的影响Fig.6 Effects of different temperature culture conditionson the growth of strains Y8 and Y107 所示。SRB 菌株 Y8 最适接种量为 1%,培养 72 h后,菌液的 A600达到 1.10,而在其他接种量条件下,菌液的 A600维持在 0.6 左右(图 7(a);SRB 菌株Y10 最适接种量为3%,接种量对该菌生长的影响不明显(图 7(b)。接种量在 1%5%,菌液的 A600维持在 1.5 以上。通常接种量会影响培养基中溶氧量的多少,肉毒杆菌 Y8 属于梭菌属菌株,该属菌株通常为严格厌氧菌,因此其最适接种量为 1%,接种量大会使得培养基中的溶氧提高,使其生物量积聚较低。摩氏摩根菌 Y10 属于肠杆菌属菌株,该属菌株通常为兼性厌氧菌,繁殖速度快,培养基中溶氧量的多少对其生长影响不明显。2.5 PL 对硫酸盐还原菌的活性抑制不同 PL 质量浓度对 SRB 菌株 Y8 和 Y10 生长的影响如图 8 所示。从图 8(a)可以看出,质量浓度为 2 20 mg/L,PL 对 SRB 菌株 Y8 的生长皆有抑制作用。随着 PL 质量浓度的不断提高,菌液的 A600逐渐降低。当 PL 质量浓度为 20 mg/L时,菌液的 A600接近 0,所以 PL 对 SRB 菌株 Y8的最低抑菌质量浓度为20 mg/L。从图8(b)可以看出,质量浓度 20 60 mg/L,PL 对 SRB 菌株 Y103212 2023 年 6 月 朱大玲,等:水基切削液中优势硫酸盐还原菌的分离、生理特性及其活性抑制研究 Jun.,2023图 7 不同接种量对菌株 Y8 和 Y10 生长的影响Fig.7 Effects of different inoculation amounts on thegrowth of strains Y8 and Y10的生长皆有抑制作用。随着 PL 质量浓度的不断提高,菌液的 A600逐渐降低。在 PL 质量浓度为60 mg/L 时菌液的 A600接近 0;在 60 220 mg/L 时菌液的 A600接近 0。所以 PL 对 SRB 菌株 Y10 的最低抑菌质量浓度为 60 mg/L。通过比较可以发现PL 对 SRB 菌株 Y8 的最低抑菌质量浓度为 20mg/L,而对 SRB 菌株 Y10 的最低抑菌质量浓度为60 mg/L,PL 对 SRB 菌株 Y8 的活性抑制显著优于 SRB 菌株 Y10,这表明 SRB 菌株 Y10 具有较强的耐受性。3 讨 论硫酸盐还原菌是导致水基切削液腐败变臭的主要菌群,本研究从腐败的水基切削液中分离纯化获得生长速度快的优势 SRB 菌株肉毒杆菌 Y8 和摩氏摩根菌 Y10。肉毒杆菌为革兰氏阳性厌氧菌,其所产神经毒素肉毒素是毒性最强的蛋白质之一29,故腐败的切削液中有肉毒杆菌 Y8 的存在,对操作人员的健康存在一定的威胁。摩氏摩根菌为革兰氏阴性兼性厌氧菌,广泛分布于多种自然环境以及人和动物的肠道内30,Gilbert 等312010 年从乳化切削液里也检测出摩氏摩根菌。本研究首次报道 2 种细菌图 8 不同 PL 质量浓度对菌株 Y8 和 Y10 的生长抑制分析Fig.8 Growth inhibition analysis of different PL massconcentration on strains Y8 and Y10具有硫酸盐还原菌特性。生理特性分析结果表明肉毒杆菌 Y8 和摩氏摩根菌 Y10 生长条件要求宽泛,经水基切削液使用体系的长期驯化,具有一定的耐逆性,其作为水基切削液中 SRB 优势菌株的代表,用于维持水基切削液生物稳定性研究。在厌氧条件下,肉毒杆菌 Y8 和摩氏摩根菌 Y10培养 2 d 后,菌株生长进入稳定期,这意味着车间在遇到各种原因导致停产时,水基切削液在一定时间内处于静止状态,好氧菌或兼性厌氧菌会很快消耗切削液中的溶氧,如若不及时干预 SRB 菌株会快速生长,使水基切削液腐败发臭。肉毒杆菌生长条件优化试验发现肉毒杆菌 Y8 对盐度和 pH 值非常敏感,这可能是由于该菌株在切削液环境中驯化所致。有研究报道肉毒杆菌在 pH 9 时不能繁殖和形成毒素32,因此在实际生产中可通过微调水基切削液的盐度和 pH 值,达到既不影响切削液性能又可实现抑制肉毒杆菌活性的效果。摩氏摩根菌 Y10 在pH 值7 10,温度25 45,NaCl 质量分数0 5%均能良好地生长,生长条件要求非常宽泛。这与朱大玲等28从红树沉积物中分离出的一株产氢摩氏摩根菌 BH16 生理特性相近,具有耐盐碱性。此4212 Vol.23 No.6 安全 与 环 境 学 报 第 23 卷第 6 期外,2002 年 Nicolle33报道野生型摩氏摩根菌具有对 内酰胺类抗生素的天然耐药性,这表明常用抑菌剂对摩氏摩根菌的活性抑制不理想,导致水基切削液防腐难度增大。鉴于 SRB 摩氏摩根菌 Y10 的强耐逆性和耐药性,可作为高效抑菌剂研发的指示菌株。在防治水基切削液腐败的相关研究中,已报道抑菌方法主要包括微波法、超声波法、辐射的物理法17,34和添加化学杀菌剂的化学法35。这些方法不仅会对工人健康造成影响,还会增加生产或废液处理成本36,所以寻找和开发高效安全的水基切削液生物抑菌剂仍然非常迫切。常作为食品防腐剂使用的 PL 具有很好的杀菌能力和热稳定性37。PL 具有抑菌谱广的特点,对大多数革兰阳性菌和革兰阴性菌具有显著的抑菌作用,且可以抑制黄曲霉孢子的萌生和菌丝生长38 39。PL 水溶性、热稳定性良好,其水溶液在 121 灭菌 20 min,聚合物长度不变,仍具有抑菌效果。PL 抑制微生物生长的机理是基于其阳离子性质,通过在微生物细胞表面的静电吸附,破坏细菌的细胞壁和细胞膜结构,使菌体抗渗透压能力下降,原生质外渗,最终破坏微生物细胞结构的完整性,致使细菌死亡40 42。此外,在弱碱条件下其抑菌活性不受影响,可以适应水基切削液的工作 pH 值43。PL 具有抑菌谱广、水溶性及热稳定性好等特点使其非常适合作为水基切削液的候选生物抑菌剂。本研究 PL 作为生物抑菌剂对水基切削液中 2 株 SRB 优势菌株活性抑制效果明显,最小抑菌质量浓度分别为 20 mg/L 和60 mg/L。尽管 PL 的价格较高,但在水基切削液中微生物生物量较低,维持切削液中的生物稳定性,一般只需要加入微量抑菌剂就可以达到抑菌效果,所以开发 PL 作为水基切削液的生物抑菌剂,具有经济可行性。4 结 论1)从腐败水基切削液中分离获得 2 株硫酸盐还原菌优势菌株肉毒杆菌 Y8 和摩氏摩根菌 Y10,2 株菌均可还原硫酸盐产生硫化氢,具有硫酸盐还原菌特性。2)肉毒杆菌 Y8 最佳生长温度、NaCl 质量分数、pH 值分别为35、0、9。摩氏摩根菌 Y10 最佳生长温度、NaCl 质量分数、pH 值分别为 30、0.1%、8。2 株硫酸盐还原菌生长条件要求宽泛,具有一定的耐逆性。3)PL 对肉毒杆菌 Y8 和摩氏摩根菌 Y10的抑菌效果皆较好,最小抑菌质量浓度分别为 20mg/L 和 60 mg/L。参考文献(References):1 WINTERI M,BOCK R,HERRMANN C.Investigation ofa new polymer water based cutting 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