家兔颈动脉粥样硬化模型的建立.pdf

作者单位:430060 武汉大学人民医院神经内科艾志兵(硕士研究生)李承晏(导师);湖北省郧阳医学院附属太和医院神经内科何国厚(导师)刘 勇 魏国耀 郑 虎家兔颈动脉粥样硬化模型的建立艾志兵 何国厚 李承晏 刘 勇 魏国耀 郑 虎【摘要】目的 寻找一个建立家兔颈动脉粥样硬化模型的简单、重复性好的方法。方法 35只日本大耳白兔随机分成3组:正常组5只,高脂喂养组15只和高脂喂养加手术组15只。正常组普通饲料喂养,高脂喂养组给予高脂喂养,高脂喂养加手术组喂养1周后行颈动脉空气干燥术,并分别在喂养2、4、6周行脑血管DSA和观察颈动脉粥样硬化的病理变化。结果 喂养4、6周时就可以形成颈动脉粥样硬化的病变,DSA可以发现颈动脉狭窄,内膜中膜比(I/M):1.050.008(喂养4周时),1.110.007(喂养6周时)。结论 利用高脂喂养加颈动脉空气干燥法可以建立一种成熟的颈动脉粥样硬化模型,而且此方法简单、重复性好,有利于进行颈脉粥样硬化的实验研究。【关键词】动物模型 颈动脉粥样硬化 家兔 空气干燥法【中图分类号】R747.8【文献标识码】A【文章编号】100720478(2005)0220096204Carotid artery atherosclerosis model of rabbitAi Zhibing,He Guohou,Li chengyan,et al.Neurology Department,Renmin hospital,Wuhan University,Wuhan 430060【Abstract】ObjectiveTointroduce the carotid artery atheroslerosis model of rabbit.MethodsTherty five Japan rabbitswere assigned into three groups ransdomly,normal group fed with normal food,lipo2fed and group fed with high lipo food,lipo2fed and operation group,in which the rabbits were operated by air2dry on carotid artery after a week fed with lipo food.DSAand pathological examination of the carotid artery were done at2th、4th and6th week after operation.ResultsThe carotid ath2erosclerosis stenosis were observed in rabbits in the lipo2fed and operation group at the4th and the6th weeks after operation,the I/M was1.050.008at the4th week and1.110.007at the6th week in the lipo2fed and operation group respectively.ConclusionThe carotid artery atherosclerosis model can be made by the lipo2fed and air drying method.【Key words】Animal modelCarotid artery atherosclerosisRabbitAir dry 颈动脉粥样硬化是引起缺血性脑卒中的重要原因,其中60%的缺血性脑卒中和颈动脉粥样硬化密切相关13。本研究用高脂喂养加空气干燥法造成日本大耳白家兔颈总动脉内皮细胞变性和内膜脂肪沉积,建立颈动脉粥样硬化模型。1 材料与方法1.1实验材料 雄性日本大耳白兔35只,体重15002000g(由湖北省医学动物试验中心提供)。胆固醇购自北京海淀区微生物培养基制品厂,批号:20030827,食用猪油在市面购得;高脂饲料由96%的普通饲料和2%的胆固醇以及2%的猪油配制而成;HE染色试剂以及弹力纤维染色试剂由湖北省太和医院病理科提供。1.2 动物分组 将大白兔在室温、自然通风和12/12h昼夜交替的环境里适应性喂养,自由择食、饮水,动物存活良好,没有异常发生;正常组5只,每日进食普通饲料150克,自由饮水,共喂养7周;高脂喂养组成15只,每日进食150克高脂饲料,自由饮水,根据喂养的时间分为3个亚组:喂养3周组(5只),喂养5周组(5只),喂养7周组(5只);高脂喂养加手术组15只,高脂喂养1周后分别行颈总动脉内膜空气干燥术,术后继续高脂喂养,根据喂养时间分为3个亚组:喂养2周组(5只)、喂养4周组(5只)、喂养6周组(5只)。1.3 颈总动脉内膜空气干燥术 10%的水合氯醛(剂量为5ml/kg)灌肠后,颈部脱毛消毒;颈部正中纵行切口,钝性分离,暴露两侧颈总动脉,分离右侧颈总动脉,长度约2cm;用动脉夹临时夹闭右侧颈总动脉近心端和远心端后用皮试针头于近心端夹闭外近刺入管腔,再在远心端刺破颈总动脉;将抽有生理盐水的注射器连接于皮试针头,用生理盐水灌洗血管腔,然后将医用氮气连接于皮试针头向夹闭段的颈总动脉行空气干燥术,以120ml/min进行干69Stroke and Nervous Diseases,Apr2005,Vol.12,No.2燥,时间10min;干燥术后拔出皮试针头,松开动脉夹,恢复右侧颈总动脉的血流,用棉签轻压伤口,待完全止血后去掉棉签,轻压2min;待颈总动脉完全止血且血流通畅后用庆大霉素局部抗感染,并缝合皮肤。1.4 指标检测 正常组在开始喂养时经耳缘静脉采血2ml,3000r/min离心5min,取血清查血脂水平;喂养7周时经耳缘静脉采血2ml,3000r/min离心5分钟,取血清查血脂水平;经腹主动脉行双侧颈动脉造影术;取双侧颈总动脉,长度约2cm,置于4%(4,p H7.4)的多聚甲醛中固定24h,石蜡包埋后以4um厚度切片,常规行HE染色以及弹力纤维染色。高脂喂养组在喂养1、3、5、7周时分别经耳缘静脉采血2ml,3 000r/min离心5min,取血清查血脂水平;在喂养3、5、7周时将高脂喂养组大白兔经腹主动脉行双侧颈动脉造影术;取双侧颈总动脉,长度约2cm,置于4%(4,p H7.4)的多聚甲醛中固定24h,石蜡包埋后以4m厚度切片,常规行HE染色及弹力纤维染色。高脂喂养加手术组在喂养1、2、4、6周时分别经耳缘静脉采血2ml,3000r/min离心5min,取血清查血脂水平;在喂养2、4、6周时将高脂喂养加手术组大白兔经腹主动脉行双侧颈动脉造影术;取双侧颈总动脉,长度约2cm,置于4%(4,p H7.4)的多聚甲醛中固定24h,石蜡包埋后以4um厚度切片,常规行HE染色及弹力纤维染色。1.5 统计学处理 所有数据均用?xs表示,组间比较采用t检验,统计软件采用SPSS10.0软件包。2 结 果2.1 正常组的大白兔血脂(CHOL、LDL,TG)水平没有明显变化(P 0.05),高脂喂养组和高脂喂养加手术组的大白兔血脂(CHOL、LDL、TG)水平在喂养2、4、6周时明显高于正常组(P 0.05)(表1)。2.2 大白兔光镜下正常组的双侧血管内膜没有明显变化;高脂喂养组的大白兔双侧血管内膜在喂养2、4、6周时也没有明显变化但可见血管平滑肌细胞的增生,即高脂喂养在6周内不会引起动脉内膜的变化;高脂喂养加手术组的大白兔在喂养2周时右侧血管有内皮细胞的变性和内膜增生,并有少量的泡沫细胞形成,喂养4周时内膜明显增生,中膜变薄,内膜下大量泡沫细胞堆积,间有坏死的物质沉积,喂养6周时内膜增厚更加明显,有核细胞进一步减少,并有大量不定形物质和坏死物质的沉积;喂养2周时与喂养4、6周时内膜中膜比(I/M)有时显差异(P 0.05)(图16、表2),而左侧的颈动脉没有明显的病理改变,与正常组和高脂喂养组比较无明显差异(P 0.05)表1 各组的大白兔血脂水平比较(?xs,mmol/L)组别CHOLLDLTG正常组开始喂养时1.580.180.650.350.850.12正常组喂养7周时1.600.220.640.340.860.11高脂喂养组开始喂养时1.610.220.660.350.840.12高脂喂养3周组26.954.21323.654.0232.301.753高脂喂养5周组37.606.75333.225.453.020.203高脂喂养7周组38.906.60334.405.083.130.353高脂喂养加手术组开始喂养时1.580.200.650.360.850.13高脂喂养加手术组喂养2周时28.025.01324.053.9532.321.803高脂喂养加手术组喂养4周时36.907.02334.223.3433.120.323高脂喂养加手术组喂养6周时40.026.42333.354.8533.200.403注:与正常组比较,3P 0.01图1 正常组血管没有内膜增生(弹力纤维染色 100倍)2.3 正常组的大白兔双侧血管造影没有见到明显的血管影像学改变;高脂喂养组的大白兔在喂养2、4、6周时双侧血管造影也没有发现明显血管的影像学变化;高脂喂养加手术组的大白兔在喂养2周时右侧颈动脉没有明显的影像学变化,在喂养4、6周时可以发现右侧颈动脉有不同程度的狭窄,而左侧颈动脉造影却发现血管壁光滑,管腔通常,没有影像学改变(图79)。79卒中与神经疾病2005年4月第12卷第2期图2 高脂喂养加手术组喂养4周时血管内膜增生变厚,中膜变薄(弹力纤维染色 100倍)图3 高脂喂养加手术组喂养6周时血管内膜进一步增生变厚(弹力纤维染色 100倍)图4 正常组血管没有明显改变(HE染色 200倍)图5 高脂喂养加手术组喂养4周时可见大量泡沫细胞沉积及粥样斑块(HE染色 200倍)3 讨 论动脉粥样硬化是多因素共同作用的结果,动脉内膜损伤是关键因素之一,引起内膜损伤的危险因图6 高脂喂养加手术组喂养6周时可见大量泡沫细胞沉积及粥样斑块(HE染色 200倍)表2 各组大白兔的颈动脉内膜中膜比(I/M)变化组别nI/M正常组50.020.008高脂喂养3周组50.030.006高脂喂养5周组50.040.007高脂喂养7周组50.040.008高脂喂养加手术组喂养2周时50.550.0073高脂喂养加手术组喂养4周时51.050.0083高脂喂养加手术组喂养6周时51.110.0073注:与正常组和高脂喂养组比较,3P 0.05图7 正常组DSA可见血管内膜光滑,管腔通畅无狭窄图8 高脂喂养加手术组喂养4周时DSA可见血管内膜粗糙及管腔狭窄89Stroke and Nervous Diseases,Apr2005,Vol.12,No.2图9 高脂喂养加手术组喂养6周时可见血管内膜粗糙及管腔狭窄素很多,包括高脂、高同型半胱氨酸(HCY)血症等4,5。内皮细胞的功能障碍是粥样硬化形成的起始阶段6,人为的内膜受损则可以加快粥样硬化的形成,有人利用球囊造成内膜损伤,可以使动脉粥样硬化模型的形成时间大大缩短,但是这种方法容易造成内弹力板的断裂,并且病理结构与自然形成的粥样硬化不完全相同,故不适合用来做主动脉动脉粥样硬化研究7。已有通过造高脂血症以及高同型半胱氨酸血症而使动物主动脉粥样硬化模型的报道8,9,而对于颈动脉粥样硬化的模型建立却报道比较少,故本研究旨在探讨颈动脉粥样硬化模型的适当方法。寻找一个形成时间短、稳定、且重复性好的颈动脉粥样硬化模型建立方法对于进行缺血性脑血管疾病的研究具有重要的意义。高脂喂养加空气干燥法形成颈动脉粥样硬化的关键步骤:(1)高脂喂养造成的动物高脂血症是引起颈动脉粥样硬化的基础;(2)空气干燥使内皮细胞变性,导致内膜损伤,加快了颈动脉粥样硬化的形成。本研究利用高脂喂养加颈动脉空气干燥法建立了颈动脉粥样硬化的模型,喂养2周时就出现了内皮细胞的变性和内膜增厚,并有少量的泡沫细胞形成;喂养4周时内膜进一步增厚,并有大量的泡沫细胞形成;喂养6周时病理变化更加明显。DSA检查发现喂养4周时可见颈动脉有不同程度的狭窄,大大缩短了造模所需要的时间。高脂喂养加空气干燥法建立家兔颈动脉粥样硬化模型的病理变化与人的大动脉粥样硬化的病理改变相似,早期内皮细胞变性,随着时间的延长泡沫细胞的大量沉积,内膜逐渐增殖、变厚,中膜变薄、脂质沉积、纤维斑块以及最后粥样斑块的形成。同时在病理检查和颈动脉造影过程中发现,手术侧的对侧颈动脉没有发现粥样硬化的病理改变,HE染色见对侧颈动脉和正常组的HE染色相近,弹力纤维染色见对侧颈动脉的内膜为一层内皮细胞,即没有增生;脑血管造影发现在高脂喂养加手术组的大白兔右侧颈总动脉可以见到不同程度的狭窄,而对侧的颈总动脉血管壁光滑,管腔通常与高脂喂养组及正常组比较没有明显差异,所以高脂喂养不易在短时间内形成颈动脉粥样硬化,而空气干燥术后人为地使血管内膜受到损伤,可以加快颈动脉粥样硬化形成的过程。利用空气干燥法建立大动脉粥样硬化模型在国内、外已有报道10,但是在高脂配方、干燥的时间以及干燥的气量方面都有不同,徐永革等用的气量为120ml/min,历时15min,张磊等用的气量为250ml/min,历时5min,结果都形成了动脉粥样硬化病变1012,本试验采用的气量为120ml/min,历时10min,结果在喂养4周时就可以形成颈动脉粥样硬化。参考文献1Nagao 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