丹参对抑制膝关节骨性关节炎NO诱导软骨细胞凋亡及滑膜炎症的研究.doc

一、立项依据（包括国内外研究现状、发展趋势、理论与实践依据、研究目的意义等）
骨性关节炎（Osteoarthritis OA）是一种慢性进行性软骨损伤的骨关节病，多发于老年人。随着社会人口老龄化的加剧，该病的发生越来越多，严重危害着老年人的健康。由于目前尚未弄清该病的病因及发病机理，所以临床上还缺乏有效的防治该病的药物及方法。业已证明，关节软骨的退变是OA的直接原因。自1993年Stefanovic阐述一氧化氮(NO)在关节软骨退变中的作用以来，NO在OA中的作用倍受关注，人们为此作了大量的研究工作。
Palmer等[1] 和Rediske等[2]报告软骨细胞是在关节内炎症递质诱导下产生NO的主要细胞。而Grabowski等[3]研究证实人类关节中的软骨母细胞在体外培养中并无N0产生，只要加入炎性细胞因子，如IL-l α、TNF-β、IFB-γ等，就会激活软骨母细胞中的iNOS而产生大量NO。iNOS在OA的发病过程中发挥着重要作用。目前已知一氧化氮合酶（NOS）按表达方式分为结构型(包括神经型和内皮型)和诱导型（iNOS）。NOS催化底物精氨酸产生NO[4]。iNOS在正常滑膜和软骨中没有表达，但在炎症刺激下被活化形成大量NO。彭丹等[5]研究发现实验性OA中NO水平显著高于正常对照组，且随病程延长，NO水平逐渐升高，6周达高峰，此时也出现较多软骨细胞凋亡现象，应用一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME后，关节液中NO含量降低，软骨细胞凋亡现象减轻，提示NO是引起实验性OA中软骨细胞凋亡的介质之一。高石军等[6]对OA患者关节软骨、滑膜血清及关节液中NO的测定显示其明显升高，且以软骨及滑膜中的含量最高，提示NO含量升高成为关节软骨退变和滑膜炎症的病因之一。而在另项研究中[7]发现，即使不加入IL-1或脂多糖等刺激物，OA患者软骨细胞在体外仍可产生大量的NO，体外培养发现：NO对软骨细胞功能有许多不利影响，包括抑制胶原和粘多糖的合成，促进细胞凋亡，以及抑制细胞外基质粘集。Francisco等[8]的体外实验发现，NO在软骨细胞凋亡中起重要作用，其他细胞词控因子如 IL-l、TNF、LPS、氧自由基等均不能诱导软骨细胞凋亡。正常关节软骨细胞有少量的NO分泌，从而维持细胞-细胞间信息传递，拮抗氧自由基的氧化损害反应[9]。而骨关节炎患者关节内软骨组织在诸如滑液内低氧分压液、pH值降低、软骨缺血、细胞因子、创伤等多种病例因素刺激下，N0被过度的表达和调控，明显高于正常人。研究表明，高浓度N0可通过抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞凋亡，改变蛋白多糖和胶原蛋白的合成与分泌功能,抑制软骨细胞合成软骨基质,促进软骨细胞糖酵解,从而导致关节软骨修复能力降低,软骨破坏增加,加速软骨退变[10]。
滑膜中丰富的血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等在炎性细胞因子的刺激下可产生大量的NO[11]。体外实验证明[12]，人类滑膜中的纤维母细胞在体外培养时无NO产生。当加入IL-1β、 TNF-α等细胞因子后可活化其中的iNOS，产生大量的NO。滑膜中高含量的NO可引起滑膜组织的损伤和血管扩张，NO在损伤滑膜组织的同时，也损伤了其中的血管壁，使血管壁的通透性增大而引起渗出，导致滑膜肿胀、充血及关节内的少细胞渗出性关节积液。
祖国医学认为OA属痹证范畴，认为肝肾亏虚为其内因，复加风寒湿邪侵袭及劳损外伤等外因，致使病变局部气血瘀滞，筋骨失养而发病，“风寒湿三
气杂而为痹”(《素问·痹论》)，故主张“祛寒除湿”[13]。
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。[14]，其性苦，微寒。归心、肝经。祛瘀止痛，活血通经，清心除烦。《千金方》、《证治准绳》、《普济方》等医书中均有丹参在方剂中或合用以治疗骨性关节炎的记载[15]。
研究表明：丹参注射液对治疗骨性关节炎有临床疗效[16]，但没有阐明其具体的药理机制。本实验旨在通过细胞分子生物学的水平研究丹参的作用机理并进一步研究NO在OA中软骨退变过程的机理。此外，本实验还将研究不同的注射方式对临床疗效的影响。
综上所述:NO在OA中具有重要的意义，但其在OA中所起的作用尚未完全明白。有研究表明，NO在破坏软骨的同时，在某种条件下还具有保护软骨的作用。因此，需进一步研究NO在OA中软骨退变过程的机理，并为iNOS特异性抑制剂的使用提供理论依据，为我们临床治疗OA提供一个更加有效的途径。

主要参考文献:
1 Palmer RM．Induction of nitric oxide sythase in human chondrocytes．
Biochem Biophys Res Commum 1993；193：398
2 Rediske．Human articular chondrocyte induced by proimflamatory mediators as the major articular cell source of nitric oxide. Osteoarthritis Cartilage 1994;2:199
3 Grabowski PS, Macpherson H, Ralston SH．Nitric Oxide production in cells derived from the human joint．Br J Rheumatol 1996；35：207
4 Moncada S, Hirai Y. Endogenous nitric oxide: physiology, pathology and clinical relevance. J Clin Invest 1991;21:361–374.
5 彭丹，孙才江，周江南。一氧化氮在实验性骨关节炎软骨细胞凋亡中的作用。中华风湿病杂志2000；4（4）：232
6 高石军，陈百成，汤慧华，等。一氧化氮在骨性关节炎发比病机制中作用。中华骨科杂志1999；19（7）：411
7 Amin AR，Abramson SB．The role of nitric oxide in articular breakdown in osteoarthritis．Curr Opin Rheumatol 1998；1O(3)：262
8 Francisco JB，Robert LO．Herbert S，et a1． Chondrocyte apoptosis induced by nitric oxide. Am J Pathol 1995；146：75
9 彭丹，孙材江，陈游．膝关节骨性关节炎患者中一氧化氮的动态变化及其临床意义．现代康复，2000，4（8）：1 192
10 Tomita M，Sato EF，Nishikawa M，et al Nitric oxide regulates mitochondrial respiration and functions of articular chondrocytes. Arthritis Rheum，2001，41：96
11 田恒力，张镛。一氧化氮生物作用的研究进展。国外医学·神经病学神经外科学分册1995；22：87
12 Crabowski PS， Macpherson H，Ralston SH．Nitric oxide production in cells derived from the human joint．Br J Rheumatol 1996；35：207
13 杨晋翔，赵世喜，主编．疼痛性疾病中医现代治疗学．北京：学苑出版社，2001．882—902．
14 中华人民共和国卫生部药典委员会主编．中华人民共和国药典．1995．220—221．
15 高学敏，主编．中药学．北京：人民卫生出版社，2000．645—655．
16 华美汇，陈世盖，顾湘杰等 丹参注射液对膝关节骨性关节炎临床疗效的观察。中华运动医学杂志 2003；22（1）：90－91

二、研究内容（包括研究目标、关键技术和创新之处、应用前景、预期达到的主要技术
指标、学术水平等）
本课题旨在通过细胞分子生物学的水平研究丹参注射液的作用机理并进一步研究NO在OA中软骨退变过程的机理。此外，本实验还将研究不同的注射方式对临床疗效的影响。
关键技术在于体外分离培养软骨细胞，并鉴定其品质，对其数目、存活率、增殖、凋亡、NO浓度等方面进行相关检测，同时通过血清药理学方法制备丹参含药血清。动物关节镜检查在本研究中也很重要。
本研究创新之处为在细胞分子水平研究丹参治疗骨性关节炎的药理机制，并研究不同的治疗方法对于疗效的影响。国内仅有华山医院运动医学科做过临床疗效的研究，国内外未见系列药理实验研究报道，达到国际领先水平。
应用前景：随着社会人口老龄化的加剧，OA的发生越来越多，严重危害着老年人的健康。本研究将阐明丹参注射液的作用机理并进一步研究NO在OA中软骨退变过程的机理。此外，本实验还将研究不同的注射方式对临床疗效的影响，为iN0S特异性抑制剂的使用提供理论依据，从而为我们临床治疗OA提供一个更加有效的途径。该研究将造福广大OA患者，具有很大的社会价值。

三、研究方法和技术路线（包括研究工作总体思路、预试验结果、技术方案、实验
方法、数据处理及现有工作基础等）

本研究分为三个阶段：
（1） 体外实验部分
1 兔血清制备
分别制备正常兔血清和丹参含药血清：取正常新西兰大白兔。每组3只，雄性，体重在2.25～2.50kg之间。丹参注射液按体表面积折算动物的等效剂量，以生理盐水2 ml肌肉注射，1次/日。连续3周，在末次注射1小时后耳缘静脉采血。放置1小时，离心(2500 r／min)30分钟，抽取血清，56℃ 、30分钟灭活，经0.22m滤膜抽滤除菌，分装，-20℃保存备用。
2 软骨细胞的分离与培养
取4周龄的新西兰大白兔，无菌条件下取后肢膝关节软骨，剔除滑膜和骨组织，用PBS溶液清洗2次，然后将软骨组织机械分离成约1mm 3大小的组织块，移入培养瓶，按1：6体积比加入0.1％U胶原酶，37℃ 消化7小时，200目网筛过滤后，将七清液离心8分钟(1200 r／min)，然后倒掉上清液，加入PBS溶液清洗2次，最后加入15％小牛血清1640培养液，反复吹打后将软骨细胞接种在75 cm2的培养瓶中，置37℃ 、5％ coa培养箱中。逐日观察，2-3天换1次液，原代细胞长满后传代，取1～3代细胞作实验用。传代细胞接种在96孔板中，接种密度2×10个细胞／孔，正常培养待细胞贴壁后，分别换用含有正常兔血清(对照组)和丹参血清(丹参组)的培养液培养，血清浓度分别为5％、10％、20％。48小时后加入5 mg／mL MTT 20μL／孔，孵育4小时后，加DMSO 200μL／孔，15分钟后在酶标仪上测OD值，波长为595 nm。
3 NO的检测 ，软骨细胞增殖、凋亡的检测。NO在体内转变为NO2-和NO3-，而NO2-进一步转化为NO3-，利用硝酸还原酶特异性将NO3-还原为NO2-，通过显色深浅测定其浓度高低。将培养细胞消化、离心、弃上清，下层细胞加入生理盐水后破碎，取混悬液500ul测定。用MTT法和流式细胞技术分别检测软骨细胞增殖、凋亡的情况。
4 iNOS的检测 细胞裂解后，提蛋白Western Blot检测iNOS的表达，RT－PCR法检测iNOS基因表达的量。
5 统计学方法 各组数据以z±S表示，用SPSS12．0软件包进行统计学分析，组间比较采用t检验。

(2)动物实验部分
本研究采用随机对照动物实验。选用兔为研究对象，数量为64只，随机分为6组，即丹参肌肉注射治疗组（12只）；NS肌肉注射组（12只）；丹参关节腔内注射治疗组（12只）；NS关节腔内注射治疗组（12只）；骨性关节炎阴性对照组（12只）；正常空白对照组(4只)。
除正常空白对照组外，先建立骨性关节炎的兔膝关节动物模型，采用文献报道的木瓜蛋白酶法建立。2周后所有动物进行膝关节的关节镜检查，以验证模型建立是否成功。成功后丹参肌肉注射治疗组予丹参2 ml，肌肉注射，1次/日；NS肌肉注射组予NS 2 ml，肌肉注射，1次/日；丹参关节腔内注射治疗组予丹参2 ml，膝关节腔内注射，1次/日；NS关节腔内注射组予NS 2 ml，膝关节腔内注射，1次/日；骨性关节炎阴性对照组及正常空白对照组不采用任何干预措施。治疗后动物正常喂养和活动。1月、2月、3月分别麻醉动物，进行关节镜检查，并取标本（包括关节液及滑膜组织）。同时从兔耳缘静脉处抽血。硝酸还原法酶法检测血清、关节液及滑膜中NO的浓度，其中取血清100ul，稀释5－10倍后关节液100ul检测；滑膜与生理盐水按重量体积比1：9制备成10％的组织匀浆液，然后1000转/分离心，取上清检测。Western Blot检测iNOS的表达，RT－PCR法检测iNOS基因表达的量。部分滑膜组织行病理检查，观察滑膜炎症情况。
统计学分析：采用SPSS 12.0软件对各组间资料进行方差分析。
（3） 临床研究部分
准备开展60例病例。病例入选标准：MRI检查证实有软骨缺损，并且根据改良Outerbridge分级法为Ⅲ、Ⅳ级的骨性关节炎病人。其中,丹参肌肉注射组20人，丹参关节腔注射组20人，透明质酸钠关节腔注射组20人。术前均进行详细的医患沟通并签署知情同意书。
丹参肌肉注射治疗组予丹参2 ml，肌肉注射，1次/日；丹参关节腔内注射治疗组予丹参2 ml，膝关节腔内注射，1次/日；透明质酸钠关节腔注射组予透明质酸钠2ml膝关节腔内注射，1次/周，各组连续治疗5周。术后每月随访，3、9、12月随访MRI，以后每年随访一次MRI。随访时抽取静脉血和关节液，取血清100ul，稀释5－10倍后关节液100ul硝酸还原法酶法检测NO浓度。Western Blot检测iNOS的表达，RT－PCR法检测iNOS基因表达的量。运用IKDC、Lysholm评分系统评价手术前后随访时患者的膝关节功能，IKDC MRI评分系统评价软骨修复情况。
统计学分析：采用SPSS 12.0软件对各组间资料进行方差分析。