雌核发育系红鲤8305的产生及其生物学特性.pdf

第 2 2卷 第 4期 1 9 9 1年7 月 海洋与湖沼 O CEA N O LO G I A ET L1 M N O LO GI A S l N I CA 7 尸 i va 1 22，No。J ul y，l9 9l 雌核发育系红鲤 8 3 0 5的产生 及其生物学特性 吴清江 叶 玉珍 陈荣德 童垒苟 (中国科学院水生生物研究所，武 汉,4 3 o o 7 2)提要 于 1 9 8 1 年，以经 过 r射 线 或紫 外 线处 理的 近类 精 子作 为擞 活 源，成 功 地 诱发兴 国红 鲤(C y p r i n u s 砷)卵子 的雌 核发 育。经 两代 连 续雌 核发 育 的部 分后 代 个 体进 行 人工转 性，使 之成 为“生理 雄性”，井 以“生理 雄性”个 体与 其 同胞 蛆辣 交配所 产后 代 为遗 传特 性 纯 一 的 个体 红鲤 8 3 0 5。检 查 了 LD HE S TMDHS O DI DH 及 运铁 蛋 白(t r a n s f e r r；n)的 座 位，发现 同一 个 系 的不 同个 体之 间等 位基 因没 有差 别，而 且各 座位 的 等位 基 因都 是 纯合 的。血 清学试验表明，控制红鲤 8 3 0 5雌棱发育系 的红细胞表面抗原的基 因纯合度相 当高，同系个体 之间 的鳞 片移植 成 活 率可 进 8 7 以 上，说明 控 制MHC 基 因 的纯 合度 很 高。目前，国际上常用的 纯系实验 鱼主要是鳙形 目的孔 雀鱼(P o e e i l i a r e t i c u l a t a)和伽 尾鱼(Xi p h o p h o r u s)，而 这两类鱼的 繁殖 方式 都是 卵胎生。而 中国的淡水鱼类 8 0 属鲤 科，均为卵生，因此，要满 足我 国鱼 类生理、营养、病理、药理 等实验的要 求，必须从鲤科鱼 类的 有代 表性 种中培育一个 纯系。为 达到这一 目的，自 7 0年代 末我们 就着手对鲤 的鳞 被和体色 的遗 传进行了研 究C 1 ，并完成了鱼 类人工雌核发育作为建立近 交 系新途径 的 研 究；在 8 0年代 初对鱼 类品系的鉴定技 术作 了初步研究，同时培 育了一 个兴国红鲤 的纯 系红 鲤 8 3 0 5。本文为这 方面 工作的报告。一、雌核二倍体纯 系的产生 l 9 7 8年，作者 首先在 国内突破了鱼 类人工雌核发育，并诱发了 人工雌 核二倍体。l 9 8 0,年，完成了 鲤人工雌核 发育、染色体的人工和 自然加倍、性 别人工控 制等一 系列 关键 技术 的研 究，并首先提 出了一个通过雌核发育 结合性 别人工控 制快速建立鱼类纯 系的完整技 术 途 径。1 雌棱 单倍俸的产生 母本 为红 鲤(C y p r i n u s c a r p i o)，以经 1 3 1 0-z J 射 线照射或 经 2支 3 0 W、波长 为 2 3 5 0 五的灭菌灯、距离 1 7 c m 照射 3 0 rai n的鲫(C a r a s s i u s a u r a t u s)或团头鲂(Me g a l o b r a ma a mb l y c e p h a l a)精 于作 为激活源，经射线处理 过的 精子的遗 传物质遭受 破坏，但 精 虫不 失活。用这种遗传 失活 的精子激活红鲤的成熟 卵子，其馓活 比例与正常受精的受 本研究系由国家攻关项 目(7 5 0 6 一 O 2 0 7)及国家自然科学基盎(8 5 2 l 6 0生 B 5 3 4 3)资助。收稿E l 期：1 9 B 9年 l 0月 l O日。t-_ 维普资讯 http:/ 海 洋 与 蝴 沼 精 率没有显著 差别，激活的胚胎 在胚 前期形态正常；但 精核不 与卵核融 合，检 查激活卵 的 囊 胚细 胞，几乎全部为 单倍体。这种单倍体 胚胎，在原肠 期以后某 些酶的 合成 出现 障碍，在孵化 前 即开始出现形态异常，皆为 围心腔扩大、水 肿、尾 柄向上弯曲等单倍体 综合 症状；至孵化期，这类单倍体 胚胎 大量死亡。凭 肉眼，在胚 胎的眼 色素期就很容 易辨认 出这些 单 倍体胚胎为母体 遗传，雌核发育的幼鱼形态 也表 现了母本红鲤 的遗传特 征；在 激活 卵的胚 胎 中，只有 0 1 5 左右的个体 能顺利通过孵化 期而 继续发育，这些个体 都为 自然加倍 的 正 常雌核二 倍体。2 雌核 单倍体的人工加 倍和 自然加 倍 提高雌 核二倍体的产量可借 助于染色体人 工加 倍的方法，我们 采用两种 人工加 倍的 方 法均获得成功。在卵子激活 3 5 mi n时，以 1 的极 端温度进 行 冷休克 3 0 mi n，抑制第 二极体的排 出，从而 雌核 二倍体胚胎的 比例可提 高至 1 7 4：当激活卵 发育至 二胞期时，以 2 5 1 0 或 1 O 0 1 O-6 g的秋 水仙 碱水溶液 浸泡 3 O ml n，破坏纺锤丝 的形成，从而 雌 核 二倍体胚胎 比例可 达 3 1 6。温度 休克可 能在抑制第二极体 排 出时造 成染 色体 的断裂 或 丢失，从而形成 非整 倍体，最终性细 胞分化 发生障碍致使败育。大 批卵子于 二胞期进行 秋 水碱溶液 处理 在实验操作上是 有一定 困难的，因为同一批受 精卵即使 在环 境条件完全 相 同的情况下 发育速度也是很不一致 的。因此，我 们经常采用 自然加 倍的方 法，尽管雌 核 二倍体的 产量极低，但不 发生不育现 象，况 且产量低还可 以大 批量激活卵子 来弥 补。几 年 来，我们用 紫外 线处理近 类精子诱发若干 组雌核 发育红鲤，全部具 有正 常的雌核 二倍体 染色体。这 些个体生长正常，而且 发育 至性 成熟，有的个体 已用 于进 行第二代 雌核发育。3 雌核发 育个体性 别的人工 控制 雌核发育二倍体鲤全部 个体 均为雌性。因此，虽然 由同一个雌 核发育一 代母体所产 生 的所 有雌核发育二代 个体 的基 因都是纯 合的，但 由于缺 少雄性个体就不可 能依靠它们 来繁殖 后代而建立 纯系；为此，应把部 分雌 核发育二代 的个体转 变为 生理 雄性”。为得到 这 种生理雄性的个体，在 夏花 出塘后(大 约孵化后 2 0 d)，对雌核发育的红鲤 开始喂 以雄性 激素混合饵料，剂量为每公斤 商品 饵料 含 3 0 mg甲基睾 丸酮。三个 月后改 为普 通饵料，即 可 把性原细胞 转变为精原细 胞，翌年 轻 压腹 部可 流 出精液。4 纯 系建立 如果 雌核发育一代 的母 本的某些基 因座位是 杂合的，同胞姐妹个体之 间的 等位基 因 是不 同的，即使杂 合型个 体所 占比例很 低。因此要获得一个 等垃基 因完全 纯合的后代，必 须进 行两代连续的雌核 发育。这样，同一个雌核 发育二代的不同个体 的遗 传基 因都是源 于同一个 卵细胞，只有这样的 群体 才可 能建立一个纯 系。鲤 雌核发育后代 都为 雌性，要建 立一个纯系还必须把部 分雌核发育后代 的个体转 化为生理雄性个体，并以这种生理 雄性 个体 与 同胞姐妹 交配，所产后 代就可 形成一个纯 系。应用这一技 术我们 已获得 了一个 红 鲤 8 3 0 5纯 系。二、品 系 鉴 定 鱼类品系鉴定技术是个全新的课题。首先，在鱼类养殖对象中可称为品种的极少，因 此就不可 能发展起完善的品系鉴定技 术手 段。但是，这一 技术在我们 应用雌核 单倍体 建 J t j ：I l I 维普资讯 http:/ 期 吴请江等：雌拔发育系红鲤 8 3 0 5的产生及其生物 学特性 2 9 7 立 纯系工 作中是不 可缺少的；同时，它在品种 的提 纯及鉴定方面也具 有重 要的实际意义。解决 这一 问题磐须考虑的是同一个 品系的所 有个体是 否具有纯合基因 以及个体之间 的等 位基 因是 否相同。我们企 图从 分析 某些 控制功能蛋 白、同工酶 的基因座位及免 疫反应来 解决 这一 问 题。1 运铁蛋 白 鲤的运铁蛋 白受一个 座位 7个等位基 因控 制。我们分析 了不 同品 种鲤的 3 O个样品，检 出了 6个 等位基因，其相 对迁移 率分别为 A 一 6 8 3，刍，B一 5 6 7，C一 5 2 3，D 一 O，E一 4 7 0，F一 4 4 0。红鲤 8 3 0 5的全 部个体都为 E的 纯合型(图版 I：1)。王 同工酶 红鲤 8 3 0 5的 LD H，ES T，MDH，S OD，I DH 的座位数 见表 1。应 当指出，E S T的座 位 G是 多型 的，但 红鲤 8 3 0 5的 G座位 只有纯合的等位基 因 G (图版 I：2，3)鲤的 L DH 的 B基 因也是 多型的，但 红鲤 8 3 0 5的不 同个 体 中并 未发现 B基 因有 多型性；鲤 的 s MDH。一I DH和 S OD都是多型的，但在红鲤 8 3 0 5中我 们从未发现这 几种同工酶 有杂合带。裹 1红鲤 8 a o s几种 同工醵 的 座位数 T a b 1 N t t m be r of i s o zym e l oc i i n Re d Car p 8 3 05 酶 座位缩写 乳 酸 脱氢酶-Ldh A Ld b B Ld h C 醑 酶 E s t A，Es t B，E s t C，E 5 _ D，E s _ E，E s _ F E s _G，E s t H，E s t 1 s 一 苹果酸 脱 基酶 日 一 Md h A5 一 Mdh B m一 苹果 酸脱 每 酶 m Md h Am Md b B s 一 异 柠檬 酸 脱氢酶 I d b Am I d b B m一 异 柠檬醢 脱氢 酶 m l d b C 超 氧 化物歧 化 酶 S o d A，So d B，So d C 3 血清 学及免痤学反应(1)血 清学反应 以红鲤 8 3 0 5 的 红血球作为抗原分别 制取 家兔的抗 血清。这 种 抗血清 与各 品种鲤随机抽样的个 体的红血球的 交叉 凝集反应(表 2)表明，各 品种 对这 种 抗血清 的凝 集效价不 同，但 同系不 同个 体的凝集效价基本 在同一水 平，而 且每 测验 的 5个 个体都 有一个是 原来作为制取抗血清 的红血球 供体，抗 血清与其红血球的 凝集反 应滴度 表 2 鲤 备 品种 间 红血 球和 抗 血清 的 变叉 凝集反 应(单 位：滴 度)Ta b 2 Th e r e s u l t s o f c i o s s a g g l u t i n a t i o n a mo n g v a r i o u s v a r i e t i e s o Ca z p(un i t：t he r)红鲤 B 3 0 5 红 镜鲤 红鲤 镜鲤 抗 血清 红 血球 红 血球 红血 球 红 血 球 红鲤8 3 0 5 1：5 2 1，2 0 2 8 11 1 1 5 2 1 7 8 2 3 2 0】6 4 0 红 镜照 6 4 0 8 5 3 3 0 5 6 4 0，7 4 6 1)Fu Ho n g t u o a n d W u Ch i n g j i a n g，1 9 8 9-Th e I s o z y me Ex p r e s s i o n o f Di p l o i d a n d Tz i p l o i d Hy b r i d b e t we e n R e d C a r p(C?p r i n u s c a r p i o)a n d R e d G o l d f i s h(C a r s*i u*口#f、P r o c e e d i n g o t S y m p o s i u m o f t Ne w Tr e n d i n I c h【h y 0 g t i c s C Mu t l i c h)l 1 ，。，t，i。4 维普资讯 http:/ 海 洋 与 湖 沼 达 2 0 0 0左右，其它个 体的反应值 与此值十分相近，说 明控 制红血球表 面抗原的基因有棺 当水平的纯合。从 表 2还可看 出，红鲤 8 3 0 5的反应值与普通 红鲤 及散鳞 镜鲤 的有显著的 差别，这一 点从吸收试验 的结果也可得到 进一 步证明(表 3)。以上 结果 说明，以鲤 红血球 作为 抗原不仅 可清楚地把不 同品种的鲤区 别开 来，而且 还可 作为 品系鉴定的技术手段。表 3 抗红鲤 S 3 0 5红血球抗原抗血清的吸收试验(单位：滴度)T a b 3 T he r e s ul t 0 of bs o r p1 i o n T es t o f an t i s e r um of r e d bl o od c e l l o f R e d C a r p 8 3 0 5(u n i t：t i t e r)未 经吸收 经红鲤 8 4 1 3 经镜 鲤 吸 经鲢 吸收 红 血球 抗 血 清 吸收 抗血 祷 收抗 血 清 抗 血 清 红鲤 8 3 0 2 5 6 0 3 2 0 6 O 1 2 B 0 (2)组织移植 鲤 的鳞片生长 在鳞 囊 中，鳞片表 面覆盖 以表 皮，鳞 囊分布有馓 血 管。由于 编码主要组织相 容性 复合体(MHC)基 因有高度 的遗传 多态性，因此 在同种不 同 个 体之间的鳞片 移植总是不能成功。水温在 2 0 以上，一 般移植 的第二天 就可以观察 到 排斥反应，先是充血、发炎，以后移植的鳞片表面 由一层白色腐生物覆盖，最终移植的鳞片 被排 斥而 脱落，或是 虽未脱 落但鳞片的 反光 层脱 落，覆盖于鳞片 上的表皮色素细 胞死亡 消 失，整个 移植 的鳞片成 为透明的似玻璃 纸的薄片。整个排 斥过程最快为 5 d，最 慢两周完 成。对 I 2 0个 红鲤 8 3 0 5的不 同个体 进行了鳞片移植 试验，结果有 8 7 弼 的 移植鳞片 都能 正常生 长。这说明控制红鲤 8 3 0 5品 系各个体 MHC 的基 因的纯台度是很 高的。参 考 文 献 1 吴清江，柯鸿文、陈荣德，1 9 8 0。鲤鱼的遗传分离规律及选种分析。遗传2(2)：1 5 一l 6。2 昊漓江、陈荣德、叶玉珍等，1 9 8 1 鲤鱼人工雌 攘发育及其作为建立近交系新途径的研究。遗传学报8(1)：O一 5 。3 童盎萄、陈荣德、昊蒲江，1 9 8 7。鲤鱼不同品种(系)红血球抗原特异性的初步研究。永生生物学报l l(2)：1 l2 1 l 6。维普资讯 http:/ 4期 吴清江等：雌核发育系红鲤 8 3 0 5的产生及其生物学特性 2 9 9 THE PRODUCTI ON OF P URE LI NE RED CARP 83 0 5 AND I TS B1 0L0GI CAL CHA RACTERI STI CS W u Qi n g j i a n g，Ye Yu z ben，Ch e n Ro n g d e a n d To n g J i n g o u (，t l t ut e。t Hy dr o b i o o gy，m a d e ml a$i n l c aW u h an，43 0 07 2)AB S T R A C T I n d u c t i o n o f g y n o g e n e s i s o f t h e X i n g g u o Re d C a r p(C y p r i n u e C a r 0 v a r )h a s b e e n -c a r r i e d O U t s i n c e 1 9 8 8 B y me a n s o f y-r a y s(d o s a g e o f 1 3 l 0 J)o r u h r a v i o l e t(2 3 5 0 A，3 O W 2，3 0 rai n)，t h e s p e r ms o f r e l a t e d s p e c i e s(C a r a s s i u s d“r d 拟s eo r M e g a l o b r a ma a mb l y c p h o l a)we r e i r r a di a t e d a n d u s ed a s a n a c t i v a t i o n a g e n t，t h e mz t u r e d e g g s o f Xi n g g u o Re d Ca r p we r e s uc c e s s f u l l y i nd u c e d t o g yn o g e nesi s AI I o f t he gy n o g e n t i c e m b r y o s a r e ma t e r na l h e r e d i t a r y wi t h o u t a n y p a t e r n a l c h a r a c t e r i s t i c s T h e r e i s o n l y o n e g e n o me(N=5 0)i n a l mo s t a l I of t h e gy n o ne t i c e mb r y o ni c c e l I H o we v e r，t h e r e i s n o s i g ni f i c a n t di f f e r e nc e be t we e n f r o q u e n c i e s o f the a c t i v a t i o n b y i r r a d i a t i o n a n d f e r t i l i z a t i o n wi t h a n o r ma l s p e r ms Ma j o r i t y o f t h e g yn o g e n e t i c e mb r y o ha d a ha p l o i d s y n dr o me o f e d e ma，e n l a r g e d c a r d i o c o e l o m a n d b e n t c a u d a l p a r t As a r e s u l t o f p a t u r a l d i p l o i d i z a i o n a mi n o r i t y o f g y n o g e n e t i c e mb r y o(O 1 5 0 2 0)wa s n o r ma l g y n o g e n e t i c d i p I o i d W i h n o r ma l v i a b i l i t y n a t u r a l l y d i p l o i d i z e d g y n o g e ne t i c di p l o i d i n di v i d ua l s gr e w n o r ma l l y a n d de v e l o p e d i n t o ma t u r a t i o nAf t e r t wo s u c c e s s i v e gy no ge n e s i s，i I 1 t he s e c on d ge n e r a t i o n of g yn o g e n e s i s n i l i ndi v i d ua l s c a me o f a s a me e g g Af t e r b e i n g t r e a t e d wi t h a n dr o g e n，p a r t o f i ndi v i du a l s o f sec o n d g y n o ge u e dc ge ne r a t i o n wa g a r t i f i c i a l l y r e v e r s e d i n t o“p hy s i o l o g i c a l ma I e”M a t i n g“p h y s i ol o gi c a I ma l e wi t h i t s s t e r s he p ur e l i n e Re d Car p 8 3 05 wa s e s t a bl i s h e dLo c i o f s o me i s o z y m e s a nd r a ns f e r r i n we r e e x a mi n e dTh e r e s u l t s s ho we d t ha t i n t h e s a me l o c u s t h e r e wa s no di f f e r e n t a l l e l e be t we e n d i f f e r e n t i nd i vi d u a l s o f Re d Ca r p 8 3 0 5 a n d n o he t e r o z y g o t e s h a d be e n f o un dH o we v e r，t h e r e a r e 7 a l l e l e s o f t r a n s f e r r i n a n d t h e G-I o c us a n d I-l o c us o f Es t e r a s e,B-l o c u s o f La c t a t e De hy dr o-g e na s e，s-M a l a t e De hy dr o g e na s e，s-I s oc i t r a t e De h yd r o g e n a s e，Su p e r o x i de Di s mu t a s e a r e f o un d t o be p ol y m o r p h i c i n t h e c o mmo n c a r p po p u l a tio n s Us i ng r e d bl o o d c e l I o f t h e Re d Ca r p 8 3 0 5 fl,s a n a n t i g e n f r o m r a b b i t t h e s p e c i a l a n t i s e r u m wa s ma d e Th e r e s u l t s o f t e s t s o f c r o s s h e ma g g l fl t in a t l on b e t we e n t h e s pe c i a l a n t i s e r u m a n d t h e r e d b l o o d c e l 1 o f Re d Ca r p 8 3 0 5 a n d t h o s e o f o t h e r c a r p v a r i e t i e s s h o we d t h a t t h e r e a o t i o n v a l u e s we r e d i f f e r e n t b e t we e n t h e s e v a r i e t i e s，b u t the va l ue s o f di f f e r e a t i n di v i dua l s o f t he Re d Ca r p 8 3 0 5 a r e o f t h e s a m e L e v e l、t he t i t r e i s a b o ut 2 0 0 0Th e s e r ol o g i c a l a s s a y s ho we d t h a t ge n es c o n t r ol l i n g t h e r e d b l o o d c e l l a l l o t yp i e a n t i g e n s we r e h o mo ge no u s t o a g r e at e x t e nt i n Re d Ca r p 8 3 0 5Th e s u r v i v a l r ate o f s c a l e t r a n s p l a n t a t i o n b e t we e n d i f f e r e n t i n d i v i d ua l s o f Red Ca r p 8 3 0 5 wa s o v e r 8 7 I t a p p e a r s t h a t g e De s c o n t r o l l i ng M HC ar e ho m o g e ni c 维普资讯 http:/ 是清江等：雌棱发育系虹鲤8 3 0 5的产生厦其生物学特性 目(P l a t e)I 红鲤 8 3 0 5的 运 铁蛋 白和酯 酶 同土酶 图谱 Pa t t e r n s o f t r a ns f e r r l n a nd e s【e r a s 。E Re d Ca p 83 D 3 鲤的运铁蛋白谱带：a-f 红鲤 8 3 0 5 E等位基因纯台带，g 其它鲤十体的A等位基因纯台 带；2 酯酶同 工酶 在 鲤各组 织 中的表 达：L一肝，E眼，H心，B 脑，Mi肌 肉，s 血清；红 鲤 8 3 )5血情 酯酶 同工 酶谱：a d-红鲤 8 0,3只有 G z 纯合 带，e f 红镜 鲤 G 纯台 带。维普资讯 http:/