滩羊FTO基因编码区克隆、分子特征及表达模式.pdf
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1、克隆滩羊脂肪肥胖相关基因的编码区序列,采用生物学软件和在线预测工具对 基因进行分子特征分析,通过实时荧光定量 检测 基因 在滩羊各组织以及不同绵羊群体背最长肌中的表达水平,为研究 基因在滩羊及其杂交后代的生产性能以及新品种选育提供参考数据。结果表明:滩羊 基因 全长 ,编码 个氨基酸,存在 个错义突变,导致缬氨酸突变为蛋氨酸;滩羊 蛋白为亲水性蛋白,不存在跨膜结构,在第 氨基酸残基处具有信号肽;构建的系统发育进化树显示,滩羊与山羊的亲缘关系最为接近。基因 在滩羊背最长肌中的表达水平最低,在不同绵羊群体背最长肌中的表达水平存在显著差异,表达水平表现为:杜泊羊杜滩寒杂交一开放科学(资源服务)标识码
2、()代滩羊小尾寒羊;肉用绵羊(杜泊羊)基因 的表达水平相对高于其他非肉用品种。关键词:基因;滩羊;脂肪沉积;组织表达中图分类号:文献标识码:文章编号:():(),(,):(),(),:;脂肪肥胖相关基因(,)是一种蛋白质编码基因,编码的蛋白是酮戊二酸依赖的核酸脱甲基酶。全基因组关联研究表明,基因与机体体重指数和肥胖相关,机体内 基因表达水平上调会导致儿童肥胖和严重的成人肥胖。基因缺失或部分功能丧失会导致小鼠严重的生长迟缓、脂肪减少以及大脑尺寸和体重下降,过表达则会导致小鼠脂肪和体重增加。据报道,基因沉默处理会抑制猪肌内脂肪细胞的增殖和分化,而 基因过表达可显著促进细胞增殖与脂质沉积。基因功能的
3、发挥可能主要依赖于 和 信号通路调节脂肪沉积,。此外,基因还与动物采食行为和机体代谢有关,如 基因可以通过调节机体的饱腹感和瘦素水平来调节食欲,进而影响能量代谢。福建农林大学学报(自然科学版)第 卷 第 期 ()年 月滩羊以生产特征鲜明的二毛裘皮著称,同时肉质优良、肉膻味小、肌纤维细、风味独特,但相比于其他肉用品种,滩羊产肉量低,肌内脂肪含量低,从而影响其整体经济效益。截至目前还没有有关滩羊杂交后代 基因遗传多态性的报道。据此,本研究基于前期对 个绵羊群体肉用性能及肉质特性的比较,以宁夏本地滩羊为研究对象,利用 技术克隆 基因编码区序列(,),并使用生物学软件和在线预测工具进行分子特征分析,通
4、过实时荧光定量 检测 基因 在滩羊不同组织以及不同绵羊群体(滩羊、小尾寒羊、杜泊羊、杜滩寒杂交一代)背最长肌中的表达水平。为了进一步探究滩羊肉质特征,提高滩羊产肉量,从遗传学角度开展滩羊 基因分析,有助于后续滩羊新品种(系)的选育。材料与方法 试验动物及样品采集 个群体的试验用羊均选自宁夏某肉羊繁育场,每个群体选取的 只公羊均在 月龄时被屠宰。屠宰后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌等组织。采集的组织样品置于液氮中并带回实验室,下放置备用。方法 引物的设计与合成 参考其他近缘物种 基因引物信息设计 基因 区特异性引物并进行 扩增。参考 数据库中的绵羊 基因序列,利用 软件设计实时荧光定
5、量 引物,引物序列如表 所示。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。表 滩羊 基因引物扩增信息 引物类别或名称引物序列上游引物下游引物产物长度 退火温度 扩增引物 实时荧光定量 引物 基因 区的克隆与测序以滩羊背最长肌组织 为模板进行 扩增。反应体系:含 模板,上、下游引物各 ,加水至 。反应程序:预变性;变性 ,退火 ,扩增 个循环;延伸 。产物用 琼脂糖凝胶电泳检测,特异性好的扩增产物使用 纯化回收试剂盒回收后送公司测序。滩羊 基因分子特征分析 滩羊 基因的分子特征采用在线软件(表)进行分析;系统发育进化树使用 软件进行构建。基因表达特征的检测采用实时荧光定量 检测 基因 在滩羊心脏、
6、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌中以及不同绵羊群体背最长肌中的相对表达量。严格按照 试剂盒说明书的步骤进行操作,用 试剂盒进行实时荧光定量 检测。每个样品重复测定 次。使用 法计算相对表达量,使用 软件进行数据统计,使用 软件进行差异显著性分析。当 时,认为差异显著;当 时,认为差异极显著。结果与分析 滩羊 基因 区的克隆与测序利用提取的滩羊肌肉组织总 进行 扩增,扩增产物用 琼脂糖凝胶电泳检测,获得了与预期长度一致的条带(图)。扩增产物使用 纯化回收试剂盒回收后送公司测序,得到滩羊 基福建农林大学学报(自然科学版)第 卷因 区的扩增片段。结果(图)表明,滩羊 基因 长 ,编码 个氨基酸。表
7、滩羊 基因分子特征分析软件信息 软件名称用途网址理化性质分析:多序列比对:磷酸化位点预测:疏水性预测:跨膜结构预测:亚细胞定位:信号肽预测:蛋白质二级结构预测:?蛋白质三级结构预测:蛋白质互作分析:心脏;:肝脏;:脾脏;:肺脏;:肾脏;:滩羊;:小尾寒羊;:杜滩寒杂交一代;:杜泊羊。图 滩羊不同组织及不同绵羊群体背最长肌 基因 扩增电泳图谱 滩羊 基因的分子特征 理 化 性 质 在 线 软 件 分 析 显 示,滩 羊 基 因 编 码 氨 基 酸 的 分 子 式 为,相对分子质量为 ,正电荷残基(赖氨酸、精氨酸)总数为 个,负电荷残基(天冬氨酸、谷氨酸)总数为 个,不稳定系数为,脂肪系数为,总平
8、均疏水性为。推测该蛋白为亲水性蛋白。核苷酸序列同源性比对和系统进化关系 与绵羊参考基因序列()进行比对发现,滩羊 基因 区存在两处碱基突变,第 处的 突变为,为同义突变;第 处的 突变为,为错义突变,导致第 位缬氨酸突变为蛋氨酸。同时与 数据库中 个物种相应的核苷酸序列进行同源性比对,发现滩羊 基因与黑猩猩、长江海豚、双峰驼、猪、人、羊驼、野牛、山羊、牛的同源性分别为、(图);而在亲缘关系远近方面,滩羊 基因在各物种间具有较高的保守性,与山羊的亲缘关系最近(图)。磷酸化位点、亚细胞定位和蛋白质跨膜结构 采用 在线软件预测磷酸化位点的结果显示:蛋白有 个丝氨酸、个苏氨酸、个酪氨酸可能成为蛋白激酶
9、磷酸化位点(附件图,扫 码可见),表明滩羊 蛋白能催化磷酸基团从磷酸供体转移到受体蛋白的酶。亚细胞定位表明,滩羊 基因主要分布在线粒体、细胞质和细胞核中,分别占、。将标分值大于 定义为是可能性较高的跨膜结构域,则蛋白质跨膜结构预测结果显示滩羊 蛋白不存在跨膜结构。第 期马应等:滩羊 基因编码区克隆、分子特征及表达模式图 滩羊 基因 全长序列及对应的氨基酸序列 图 不同物种 基因核苷酸序列同源性比对()和构建的系统发育进化树()()()疏水性和信号肽 利用 在线软件对 基因编码的氨基酸进行疏水性预测。疏水性正值越大表示蛋白质疏水性越强,负值越大表示蛋白质亲水性越强,介于 的主要为两性氨基酸(附件
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